لينتيفيروسي تسكت الجينات بوساطة في الزائفة البشرية أعدت في لوحات مرفق منخفضة
Summary
يتم تقديم بروتوكول لإنشاء البوادى البشرية المعدلة الجينات من خلايا جزيرة الإنسان المشتتة التي يتم نقلها بواسطة فيروس لينتي تحمل RNA دبوس الشعر القصير (shRNA). ويستخدم هذا البروتوكول الأنزيمات وأوعية الثقافة المتاحة بسهولة، ويمكن القيام به بسهولة، وينتج الزائفة البشرية المعدلة وراثيا مناسبة للدراسات الوظيفية والمورفولوجية.
Abstract
تتوفر أدوات وراثية مختلفة لتعديل الجينات في جزر البنكرياس من القوارض لتشريح وظيفة جينات الجزر لبحوث مرض السكري. ومع ذلك، فإن البيانات التي يتم الحصول عليها من جزر القوارض غالبا ما لا تستنسخ بالكامل في الجزر البشرية أو تنطبق عليها بسبب الاختلافات المعروفة في هيكل الجزر ووظيفتها بين الأنواع. وفي الوقت الراهن، فإن التقنيات المتاحة للتلاعب بالتعبير الجيني للجزر البشرية محدودة جدا. إدخال الجينات في الجزر سليمة عن طريق الفيروس الغدي، بلازميد، وoligonucleotides غالبا ما يعاني من انخفاض الكفاءة والسمية العالية. انخفاض الكفاءة هو إشكالية خاصة في الدراسات الجينات أسفل التنظيم في الجزر سليمة، والتي تتطلب كفاءة عالية. ومن المعروف أن خلايا جزيرة المشتتة الأنزيمية إعادة تجميع في الثقافة تشكيل spheroids تسمى الزائفة. إعادة تصنيف الخلايا الصغيرة التي يتم التحكم فيها بالحجم تخلق البساط التي تحافظ على إفراز الأنسولين الديناميكي في المرحلة الأولى بعد الزراعة المطولة وتوفر نافذة لإدخال الحمض النووي الريبي القصير اللين (shRNA) بكفاءة مع سمية منخفضة. هنا، يتم وصف بروتوكول مفصل لإنشاء الزائفة البشرية بعد الانشّاط الفيروسي باستخدام اثنين من لوحات multiwell المتاحة تجاريا. ويمكن تنفيذ البروتوكول بسهولة ويسمح بكفاءة خفض تنظيم الجينات وتقييم دينامية إفراز الأنسولين باستخدام خلايا الislet البشرية. وهكذا، فإن الزائفة البشرية مع تعديل الجينات بوساطة لينتيفيروسي توفر نموذجا قويا وتنوعا لتقييم وظيفة الجينات داخل خلايا جزيرة الإنسان.
Introduction
فقدان كتلة خلية بيتا الوظيفية هو علم الأمراض المركزية لكل من النوع 1 والنوع 2 مرض السكري1. في حين أن خلايا بيتا هي منتجة الأنسولين في جزر البنكرياس، فإن التواصل بين خلايا بيتا والخلايا غير بيتا يلعب دورا حاسما في تنظيم إفراز الأنسولين2. وبالإضافة إلى ذلك، فإن خلل تنظيم إفراز الجلوكاجون يساهم في ارتفاع السكر في الدم في مرض السكري3. وهكذا، هناك اهتمام قوي لتعديل التعبير الجيني للخلايا داخل جزر البنكرياس لمعالجة الآلية وراء تطور خلل في مرض السكري في جزيرة. تتوفر مجموعة متنوعة من النهج بما في ذلك الفئران المعدلة وراثيا لتعديل التعبير الجيني من جزر الماوس. ومع ذلك، تظهر الجزر البشرية والماوس تتداخلي متميزة، وتوزيع الخلايا، ونسبة بيتا إلى خلايا ألفا، والاستجابة لsecretagogues4. لذلك ، فإن التقييم المباشر لوظيفة الجينات في الجزر البشرية مهم للغاية لفهم الفيزيولوجيا المرضية لجزيرة البنكرياس البشرية.
ناقلات الأدينوفيروسي هو الناقل الفيروسي الأكثر استخداما ً لنقل جزر البنكرياس في المختبر بسبب الكفاءة العالية للانتقال في الخلايا غير المقسمة. ومع ذلك، لا تخترق الغدة الدرقية إلى جوهر الجزر بكفاءة، وخاصة في الجزر البشرية5، وهو سامة للخلايا بجرعات عالية6. نسبيا, ناقلات لينتيفيروسي أقل سمية للخلايا ويسلم الجينات الخارجية بشكل دائم في كروموسوم الخلايا ما بعد السيتوتيك, مما يجعلها وسيلة اختبارها على نطاق واسع للعلاج الجيني7. ومع ذلك، فإن قدرة الفيروس اللين على اختراق جوهر الجزر البشرية السليمة محدودة أيضا، مما يتطلب تشتتا جزئيا عن طريق الهضم الأنزيمي لزيادة كفاءة التحويل8. التحذير مع تشتت الجزر البشرية سليمة هو انقطاع خلية الخلية وخلية مصفوفة الاتصالات، مما يعرض للخطر التنظيم الديناميكي لإفراز الأنسولين حاسمة للحفاظ على التوازن الجلوكوز في البشر9. وهكذا، كان من الصعب تقييم تأثير تعديل الجينات على التنظيم الديناميكي لوظيفة جزيرة في نموذج من الجزر البشرية.
ومن المعروف أن خلايا الجزر المشتتة من الجزر البشرية والقوارض تعيد تجميعها بشكل مستقل في هياكل شبيهة بالجزر تسمى “الزائفة”. الزائفة تظهر بيتا وغير بيتا توزيع الخلايا مماثلة للجزر الأصلية10،11. بالإضافة إلى ذلك، بعد الثقافة على المدى الطويل،الجزر الأصلية تفقد تدريجيا قوية المرحلة الأولى إفراز الأنسولين 5،10،11،12. ومع ذلك، أظهرت الزائفة الحفاظ على أفضل من إفراز الأنسولين المرحلة الأولى استجابة للجلوكوز مقارنة مع الجزر الأصلية بعد نفس فترة الثقافة5. بالإضافة إلى وجود أفضل الحفاظ على إفراز الأنسولين، إعادة تصنيف الخلايا التي تسيطر عليها حجم من الخلايا الصغيرة البشرية في لوحات مرفق منخفضة11 يوفر فرصة لإدخال ناقلات فيروس لينتي قبل إعادة تجميعها في الزائفة. وقد أظهرت العديد من الدراسات فائدة الزائفة جنبا إلى جنب مع نقل اللاتيفيروسي بوساطة. وأفاد Caton et al.13 أن إدخال بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) الذي يعبر عن فيروس اللين لم يكن له تأثير يذكر على إفراز الأنسولين في حين حقق التعبير المتجانس عن GFP في الزائفة الفئران مقارنة مع السيطرة غير المصابة. كما أنها أظهرت تأثير محدد من connexins مختلفة على إفراز الأنسولين عن طريق الإفراط في connexins 32, 36, و 43 عن طريق lentivirus13. الزائفة البشرية أعدت مع لوحة مرفق 96-well منخفضة جدا المتاحة تجاريا أظهرت أن الإفراط في التعبير عن النسخ بوساطة lentiviral SIX3 يحسن إفراز الأنسولين التي تم تقييمها من قبل الحضانة ثابتة 14. في الآونة الأخيرة، تم استخدام الزائفة البشرية التي أعدت مع لوحة مرفق منخفضة جدا 96 جيدا لdownregulate glucokinase عن طريق الحمض النووي الريبي القصير لينفيروسي (شرنا) كدليل على المبدأ لإظهار أن يتم تقليل إفراز الأنسولين المحفز للجلوكوز، في حين يتم تخفيض تم الحفاظ على إفراز الأنسولين المحفز من قبل KCl5. وأظهرت الدراسة أيضا أن الزائفة البشرية مماثلة للجزر الأصلية في التعبير الجيني وملامح إفرازية، وزيادة دعم فائدة الزائفة البشرية لتشريح تنظيم وظيفة جزيرة5. على الرغم من أن لا يتم إجراء التسريب، ولوحة ثقافة ميكروويل المهندسة بيولوجيا التي أصبحت متاحة تجاريا مؤخرا، كما أفيد أن تكون متوافقة مع نقل اللاتفيروسي وتنتج الزائفة البشرية التي أظهرت الأنسولين ممتازة إفراز في المختبر وفي الجسم الحي بعد زرع11. بشكل جماعي، تكوين الزائفة البشرية جنبا إلى جنب مع الانبثاق الفيروسي ة هو نهج بسيط وفعال للتحقيق في الفيزيولوجيا الباثولوجية جزيرة الإنسان، وتوفير أداة قيمة لإجراء الدراسات الميكانيكية في الجزر البشرية.
وفي هذا التقرير، يُعرض بروتوكول لتشكيل الزائفات البشرية المستحثة بفيروس اللانتي باستخدام منصتين متاحتين تجارياً، ولوحة مرفق منخفضة جداً تبلغ 96 بئراً، ولوحة ثقافة ميكروويل. كلاهما تحقيق تعديل فعال للتعبير الجيني وخلق الزائفة البشرية التي تتوافق مع تقييمات المصب بما في ذلك الحضانة الثابتة وperifusion.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، يتم تقديم بروتوكول مفصل لتوليد الزائفة البشرية التي يتم نقلها عن طريق فيروس لينتي باستخدام لوحة مرفق منخفضة جدا ً 96-well أو لوحة ثقافة ميكروويل. وقد أفيد الزائفة لإظهار وظائف مورفولوجيا وإفراز مماثلة للجزر البشرية الأصلية ويمكن أن تكون مثقفة لفترة طويلة في المختبر5،…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل ماليا من قبل المعاهد الوطنية للصحة إلى Y.I. (R01-DK090490) والرابطة الأمريكية للسكري إلى Y.I. (1-17-IBS-132). ويدعم J.A. وY.I. من قبل منظمة أخوية من النسور مركز أبحاث مرض السكري. A.B. بدعم من منحة التدريب المعاهد الوطنية للصحة (T32NS45549). استخدم المؤلفون جزر البنكرياس البشرية التي يوفرها برنامج توزيع الجزر المتكاملة (IIDP) الممول من NIDDK في مدينة الأمل (2UC4DK098085).
Materials
| Anti-adherence rinsing solution | Stemcell technologies | 7919 | |
| Biological safety cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series Type A2 | |
| cell strainer, 40 micrometer | Corning | 431750 | |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530037 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | Heracell VIOS 160i | |
| conical centrifuge tube, 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| conical centrifuge tube, 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent | ThermoFisher | 15596026 | Trizol |
| glutamine | ThermoFisher | 25030164 | |
| Hemocytometer | Marien Feld | Neubauer-Improved Bright line | |
| Human serum albumin | Sigma | A1653 | |
| inverted microscope | Fisher brand | 11-350-119 | |
| microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 20 | |
| microcentrifuge tube, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5500 | |
| microwell culture plate | Stemcell technologies | 34411 | Aggrewell 400, 24 well |
| motor-driven pestle | GAMUT | #399X644 | |
| non-tissue culture treated dish, 10 cm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| PBS | ThermoFisher | 14190250 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Petri dish, 35 mm | Celltreat | 229638 | |
| pipette, 5 mL | DOT Scientific, | 667205B | |
| pipette, 8-channel | VWR | #613-5253 | |
| pipette, 10 mL | VWR | 667210B | |
| pipette, P10 | Denville | UEZ-P-10 | |
| pipette, P200 | Denville | UEZ-P-200 | |
| pipette, P1000 | Denville | UEZ-P-1000 | |
| proteolytic and collagenolytic enzyme mixture | Sigma | A6965 | Accutase |
| reagent reservoir, 50 mL | VWR | 89094-680 | |
| reversible strainer, 37 micrometer | Stemcell technologies | 27251 | |
| swing bucket plate centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-14R | |
| swing bucket rotor | Beckman Coulter | SX4750A | |
| tuberculin syringe, 1 mL | BD | 309659 | |
| ultra low attachment microplate, 96 well | Corning | 4515 |
Referências
- Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).
- Hong, H., Jo, J., Sin, S. J. Stable and flexible system for glucose homeostasis. Physiological Review E covering statistical, nonlinear, biological, and soft matter physic. 88 (3), 032711 (2013).
- Cryer, P. E. Minireview: Glucagon in the pathogenesis of hypoglycemia and hyperglycemia in diabetes. Endocrinology. 153 (3), 1039-1048 (2012).
- Arrojo e Drigo, R., et al. New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment. Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).
- Harata, M., et al. Delivery of shRNA via lentivirus in human pseudoislets provides a model to test dynamic regulation of insulin secretion and gene function in human islets. Physiological Reports. 6 (20), e13907 (2018).
- Barbu, A. R., Akusjarvi, G., Welsh, N. Adenoviral-mediated transduction of human pancreatic islets: importance of adenoviral genome for cell viability and association with a deficient antiviral response. Endocrinology. 146 (5), 2406-2414 (2005).
- Hughes, A., et al. Gene therapy to improve pancreatic islet transplantation for Type 1 diabetes mellitus. Current Diabetes Reviews. 6 (5), 274-284 (2010).
- Jimenez-Moreno, C. M., et al. A Simple High Efficiency Intra-Islet Transduction Protocol Using Lentiviral Vectors. Current Gene Therapy. 15 (4), 436-446 (2015).
- Bonora, E., et al. Prevalence and correlates of post-prandial hyperglycaemia in a large sample of patients with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49 (5), 846-854 (2006).
- Halban, P. A., Powers, S. L., George, K. L., Bonner-Weir, S. Spontaneous reassociation of dispersed adult rat pancreatic islet cells into aggregates with three-dimensional architecture typical of native islets. Diabetes. 36 (7), 783-790 (1987).
- Yu, Y., et al. Bioengineered human pseudoislets form efficiently from donated tissue, compare favourably with native islets in vitro and restore normoglycaemia in mice. Diabetologia. 61 (9), 2016-2029 (2018).
- Zuellig, R. A., et al. Improved physiological properties of gravity-enforced reassembled rat and human pancreatic pseudo-islets. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (1), 109-120 (2017).
- Caton, D., et al. Lentivirus-mediated transduction of connexin cDNAs shows level- and isoform-specific alterations in insulin secretion of primary pancreatic beta-cells. Journal of Cell Science. 116 (Pt 11), 2285-2294 (2003).
- Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human beta Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
- Peiris, H., et al. Discovering human diabetes-risk gene function with genetics and physiological assays. Nature Communications. 9 (1), 3855 (2018).
- Schlimgen, R., et al. Risks Associated With Lentiviral Vector Exposures and Prevention Strategies. Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Li, N., et al. Engineering islet for improved performance by optimized reaggregation in alginate gel beads. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (3), 400-405 (2017).
- Ramachandran, K., Peng, X., Bokvist, K., Stehno-Bittel, L. Assessment of re-aggregated human pancreatic islets for secondary drug screening. British Journal of Pharmacology. 171 (12), 3010-3022 (2014).
- Hilderink, J., et al. Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 1836-1846 (2015).
- Saunders, D. C., et al. Ectonucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase-3 Antibody Targets Adult Human Pancreatic beta Cells for In Vitro and In Vivo Analysis. Cell Metabolism. (18), (2018).
- Reissaus, C. A., Piston, D. W. Reestablishment of Glucose Inhibition of Glucagon Secretion in Small Pseudoislets. Diabetes. 66 (4), 960-969 (2017).
