이차 세균성 폐렴의 뮤린 모델을 위한 정확한 병원균 전달 및 회복 시스템

모든 방법은 건강의 국가 학회 지침에 부합하고 몬태나 주립 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 1. 내막 주입 삽관 플랫폼, 멸균 1mL 주사기, 멸균 무딘 팁 집게, 멸균 21게이지 무딘 팁 바늘, 주사기와 집게를 저장하는 원추형 튜브 2개 등 다음 소모품이 포함된 작업 공간을 준비합니다.참고: 삽관 플랫폼은 상업적으로 구입하거나 사내에서 건설할 수 있습니다. 여기에 사용되는 삽관 플랫폼은 0.25 인치 플렉시 유리를 사용하여 구성되었습니다. 간단히 말해서, 열이 플렉시 글라스에 가해졌고 보드는 약 65° 내부 각도로 구부러집니다. 삽관 플랫폼의 외부 측에서는 두 개의 기계 나사를 3인치 간격으로 시드하고 두 나사 사이에 고무 밴드가 매달려 있었습니다. 원하는 최종 농도가 총 부피 50 μL에서 수득되도록 시료를 직렬로 희석하여 병원균 접종을 준비합니다. 멸균 장갑을 착용하고 21G 무딘 기울어진 바늘을 약 35°로 구부립니다.참고: 각 마우스마다 별도의 바늘이 필요합니다. 구부러진 21G 무딘 기울어진 바늘을 1 mL 주사기로 고정하십시오. 100 μL 공기 쿠션을 주사기에 넣고 감염제의 50 μL을 그립니다. 지배적 인 손으로 쉽게 접근 할 수있는 위치에로드 된 바늘과 주사기를 놓습니다. 깊이 마취 4% 이소플루란 / 산소 혼합물 또는 유사한 IACUC 마취의 유사한 IACUC 방법을 사용하여 마우스. 적당한 마취 깊이는 일반적으로 호흡 속도가 5-8 s 당 대략 1 흡입으로 느릴 때 얻어지며 부속기를 꼬집고 마우스에서 아무 반응도 관찰하여 확인할 수 있습니다.참고 : 이 마취 방법은 약 1.5 분의 충분한 마취 기간을 제공했습니다. 이것은 우리 실험실의 회원들이 이 주입 절차를 배우고 수행하기에 충분했습니다. 그러나, 다른 제도적으로 승인 된 마취 방법은11,12,13을사용할 수있다. 마취 실에서 마취 된 마우스를 제거하고 상악 절개에서 삽관 플랫폼에 마우스를 일시 중단하십시오. 기관으로 명확한 통로를 열려면 무딘 팁 집게를 사용하여 입 바깥쪽으로 혀를 부드럽게 잡고 확장하십시오. 포셉에서 비 지배적 인 손의 엄지 손가락과 집게 손가락으로 혀를 옮김으로 옮김을 옮김. 비 지배적 인 손에 혀를 잡고 미리로드 된 주사기를 데리러 유지. 바늘의 구부러진 끝을 몸에서 멀리 가리키고 혀의 기저부로 구강에 바늘을 삽입합니다. 혀 의 기지에 바늘로, 부드럽게 몸에서 바늘의 약간의 푸시를 일으킬 손목을 각도. 이 단계는 바늘이 식도가 아닌 기관에 삽입될 것을 보장합니다. 천천히 기관으로 바늘을 안내; 바늘이 보컬 폴을 통과할 때 종종 약간의 진드기가 느껴질 수 있습니다. 바늘이 카리나에 부딪을 때 약간의 저항이 느껴될 때까지 기관을 통해 바늘을 통과시다. 카리나 위의 바늘을 일시 중단하기 위해 근접 방향으로 바늘을 약간 들어 올립니다. 이것은 2개의 1 차적인 기관지로 납품을 가능하게 합니다. 전염성 부하를 전달하기 위해 주사기의 플런저를 완전히 누르습니다. 위쪽으로 들어 올려 기관에서 바늘을 제거하고 폐기하십시오. 고무 밴드를 누르고 삽관 플랫폼에서 마우스를 제거하지만 마우스를 똑바로 세워 서 유지합니다. 손가락을 nares 위에 직접 배치하여 비강 기도를 방해하십시오. 이 자세를 약 1분 간 또는 여러 번 의심이 관찰될 때까지 유지합니다.참고 : 이 마지막 단계는 총 접종 량이 하부 호흡기로 전달되도록합니다. 마우스를 케이지로 되돌리고 마취에서 완전한 회복을 관찰하십시오. 2. 감염된 폐 절제 멸균을 유지하기 위해 층류 후드 내에서 작업하고 스케일 및 멸균 계량 보트, 해부 플랫폼, 가위 및 집게가 들어있는 해부 키트, 멸균 RNAE없는 PBS 및 멸균 거즈로 작업 공간을 준비하십시오. 감염된 마우스를CO2 또는 이와 유사한 IACUC 승인 된 안락사 방법으로 안락사시. 감염된 마우스를 해부 플랫폼에 놓고 각 부속기 끝에 핀을 사용하여 마우스를 고정합니다. 작업 표면의 불임 유지를 위해 에탄올로 마우스를 살포하십시오. 배꼽에서 시작, 피부를 들어 올리고 기관의 기지까지 절개를 하기 위해 집게의 쌍을 사용합니다. 초기 절개 양쪽의 피부를 잡고, 몸에서 피부를 당기고 조직 연결을 통해 잘라.참고 : 흉부 부위를 더 많이 드러내기 위해 피부를 가로 질러 여러 개의 측면 컷을 만드는 것이 도움이 될 수 있습니다. xiphoid 과정의 기지에서 시작하여 횡격막을 뚫을 의도로 작은 절개를하십시오. 이것은 폐가 철회하는 원인이 되는 흉부 구멍에 있는 압력의 증가 결과. 폐가 후퇴하면서 절개를 계속하여 횡격막을 풀어. 갈비뼈의 양쪽을 따라 절개를 하여 갈비뼈를 제거합니다. 이것은 흉강과 폐를 완전히 노출시킬 것입니다. 폐를 절제하려면 집게로 심장 의 기저를 잡고 위쪽으로 들어 올립니다. 폐 뒤에 가위를 놓고 심장을 위쪽으로 들어 올리는 동안 조직 연결을 통해 작은 절개를 하기 시작합니다. 폐가 절제되면 멸균 거즈에 놓고 심장을 제거하십시오. 심혼은 집게로 폐에서 멀리 들어 올리고 나머지 조직 연결을 절단하여 쉽게 제거될 수 있습니다. 폐를 미리 타르식 계량 보트로 옮기고 무게를 기록합니다. 폐를 칭량한 후에, 멸균 인산완충 식염수 (PBS)로 그(것)들을 전송하고 병원체 복구 및 분석 단계로 앞으로 이동할 때까지 얼음에 일시적으로 저장합니다. 3. 병원체 복구 및 분석 층류 후드 내에서 계속 작업, 다음과 같은 공급 작업 공간을 준비: 조직 분쇄기, 멸균 RNAse 무료 PBS, 완충 RLT ß-mercaptoethanol (1:100), 그리고 1.5 mL RNAse 무료 미세 원심 분리 튜브.주의: ß-메르카포에탄올은 피부 접촉, 섭취, 눈 접촉 또는 흡입시 위험할 수 있습니다. 완충물 RLT로의 ß-메르카포에탄올의 희석은 연기 후드에서 이루어져야 한다. 먼저 멸균 RNAE 없는 PBS 1 mL을 티슈 그라인더에 첨가하여 시작합니다. 일단 채워진 후, 티슈 그라인더를 얼음 위에 보관하십시오. 감염된 폐에서 회수된 세균 부하를 정량화하는 데 사용되는 일련의 멸균 RNAE-FREE 직렬 희석 튜브를 준비합니다. 이것은 병원체 접종의 직렬 희석에 선행된 각 microcentrifuge 관으로 살균근의 900 μL를 aliquoting에 의해 가장 쉽게 달성됩니다.참고 : 정확한 병원체 열거에 필요한 희석 튜브의 수는 초기 병원균 입력 및 감염 기간에 따라 달라집니다. 이것은 경험적으로 결정되어야합니다. 멸균 집게를 사용하여 폐를 준비된 조직 분쇄기로 옮기고 회전하는 동안 받침대를 눌러 조직을 철저히 균질화합니다. 조직 분쇄기 및 균질화된 샘플의 알리쿼트 100 μL을 제조된 직렬 희석 튜브의 제1로 열어. 샘플을 연속적으로 희석하고 영양한천에 도금하여 CFU를 동봉합니다. CFU는 폐 조직의 CFUs/mL 또는 CFU/mL/mg으로 기록될 수 있습니다.참고: 이 단계에서 는 바이러스 RNA의 정제를 위해 균질화된 샘플의 추가 200 μL을 제거하거나 향후 분석을 위해 -80°C에 보관할 수 있습니다. CFU 결정 및/또는 바이러스 RNA 분리를 위해 양호를 제거한 후, 4°C에서 10분 동안 4,000 rpm (3724 x g)에서원심분리하여 분쇄 받침대 및 펠릿을 교체합니다. 파이펫을 사용하여 펠릿 샘플에서 상급자를 제거하고 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브에 넣습니다.참고 : 상판은 박테리아가 없으며 수용성 숙주 및 분비 된 병원균 인자의 분석을 위해 -80 °C에서 저장할 수 있습니다. 완충RLT-ß-메르카포에탄올의 700 μL에서 파이펫팅 또는 와르싱하여 균질화된 조직 펠릿을 재중단하고 시료를 멸균 RNAE-free 1.5 mL 미세원원지 튜브로 옮김을 옮김.참고 : 이 시점에서 샘플은 몇 달 동안 -80 °C에서 저장할 수 있습니다. 정제 키트의 제조업체 프로토콜에 약간의 수정을 사용하여 RNA를 정화 (재료 표참조); 참조 Voyich 외. 200814. 균질화된 폐 슬러리를 0.1 mm 실리카 비드를 함유하는 2 mL 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 6 m/s에서 20s의 비드 비터를 통해 처리합니다. 샘플을 1,500 rpm에서 3분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 상급체를 새로운 1.5 mL 미세원원원지 튜브로 피펫한다. 시료에 96%-100% 에탄올의 350 μL을 추가하고 파이펫팅 또는 반전으로 철저히 혼합합니다. 시료의 700 μL을 2 mL 수집 튜브에 배치된 정제 컬럼으로 이송한다. 샘플을 ≥ 8,000 x g에서 15초 동안 원심분리하고 흐름을 폐기한다. 위에서 설명한 것과 동일한 열을 통해 초과 샘플을 실행합니다. 완충RW1 및 원심분리기 시료를 ≥8,000 x g에서 15초로 700 μL로 세척하고, 유동을 버리고 실리카 막 컬럼을 새로운 2 mL 수집 튜브로 옮긴다. 500 μL의 버퍼 RPE를 컬럼에 적용합니다. 15 s에 대 한 ≥ 8,000 x g에서 원심 분리에 의해 열을 세척 합니다. RNeasy 컬럼과 원심분리기에 500 μL의 버퍼 RPE를 추가로 적용하여 2분 동안 8,000 x g에 적용합니다. 정제 된 RNA를 용출하려면 컬럼을 새로운 1.5 mL RNAse없는 미세 원심 분리 튜브로 옮기십시오. 피펫 50 μL의 RNase-free 물은 1 분 동안 ≥8000 x g에서 기둥및 원심 분리기의 실리카 겔 멤브레인에 직접 상한다.참고: 용출된 RNA는 RNA 수율을 높이기 위해 동일한 컬럼을 다시 통해 실행될 수 있습니다. 정제된 RNA에 RNase 가 없는 물 50 μL을 추가하여 총 부피를 100 μL로 가져와서 Aliquot 350 μL RLT-ß-mercaptoethanol을 시료에 250 μL-100% 에탄올로 넣고 파이펫팅 또는 반전으로 철저히 혼합합니다. 샘플을 수집 튜브에 배치하고 15 초 동안 ≥8000 x g의 원심 분리기에 샘플을 적용하십시오. 350 μL의 버퍼 RW1을 추가한 다음 15s에 대해 ≥8000 x g의 원심분리를 추가하여 컬럼을 세척합니다. 버퍼 RDD의 70 μL에 DNase 스톡(750 Kunitz units/mL)의 10 μL을 추가하여 약 27개의 Kunitz 단위를 포함하는 DNase 용액을 준비합니다. 80 μL의 DNase 용액을 실리카 겔 멤브레인에 직접 넣고 실온에서 15 분 동안 샘플을 배양하십시오. 350 μL의 버퍼 RW1 및 원심분리기를 15s에 대해 ≥8000 x g로 세척하고 흐름을 폐기합니다. RNA를 정화하기 위해 3.9.6-3.9.8 단계를 반복합니다.참고: 3.9.9-3.9.10 단계 및 3.9.6-3.9.8(DNase 단계 3.9.11-3.9.13 건너뛰기)을 수행하여 RNA 정리 절차를 반복하는 것이 좋습니다. 이 추가 정리는 매우 높은 품질의 RNA를 초래한다. RNA 수율은 농도를 결정하기 위한 260 nM 및 순도를 위한 260:280 nM의 판독값을 가진 분광광도계를 사용하여 정량화될 수 있다. RNA 수율을 얻은 후 각 RNA 샘플의 농도를 50 ng/μL로 표준화합니다.참고: RNA 분해로 이어질 수 있는 동결/해동 주기를 피하기 위해 50 ng/μL의 농도에서 여러 개의 aliquots를 만드는 것이 좋습니다. 정제된 RNA를 -80°C에 저장하거나 전사체 분석을 위해 즉시 사용하십시오.참고: 이전 간행물에서 3-5 마우스로부터의 RNA를 전사체 분석을 위해 풀화하였다. 상기 기술의 최적화를 통해, 1마우스로부터의 RNA는 전사적으로 전사적 으로 전사적 으로 결정되어 전사적 분석(80-120 ng/μL).