Difração de raios X do músculo esquelético murino intacto como uma ferramenta para estudar a base estrutural da doença muscular

Todos os protocolos de experimentos com animais foram aprovados pelo Instituto de tecnologia de cuidados e uso de animais institucionais de Illinois (protocolo 2015-001, data de aprovação: 3 de novembro de 2015) e seguiram o “guia para o cuidado e uso de animais de laboratório” da NIH9 . 1. pré-experimento de preparação Prepare 500 mL de solução de Ringer (contém: 145 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,0 mM MgSO4, 1,0 mm CAcl2, 10,0 mm HEPES, 11 mM glucose, pH 7,4) recentemente para cada dia do experimento. Encha 200 mL da solução de Ringer em um frasco do pulverizador e armazene-o no refrigerador de 4 ° c. Encha uma placa de Petri (10 cm no diâmetro) com solução e perfuse de Ringer com oxigênio de 100% conectando o tubo de um cilindro de oxigênio a uma pedra do ar do aquário. Os pratos de Petri (“pratos de dissecação”) foram previamente revestidos com um composto de elastômero para permitir a inserção de pinos durante a dissecção. Prepare ganchos de montagem metálicos. Corte dois pedaços de arame de aço inoxidável, 0,5 mm de diâmetro, até o comprimento apropriado e dobre o fio em ambas as extremidades para formar ganchos. Organize todas as ferramentas de dissecação, tesouras, sutura que amarra o fórceps, Microtesoura acessível para o uso.Nota: A parte do gancho deve ser de cerca de 3 mm de comprimento. O fio mais longo (terminando em um gancho) deve ser cerca de 5 cm de comprimento, e o fio mais curto (também terminando em um gancho) deve ser cerca de 1 cm de comprimento, a fim de caber as câmaras personalizadas utilizadas na Biocat e permitir uma gama suficiente de movimento para o braço do transdutor. Ligue e ligue todos os equipamentos. Isto inclui um transdutor combinado do motor/força, controlador do transdutor do motor/força um stimulator atual bi-fálico de alta potência, e um sistema controlado computador da aquisição/controle de dados. Ative o sistema de aquisição de dados e calibre-o antes de iniciar o experimento10. Resumidamente, calibrando a força adicionando um conjunto de pesos conhecidos, cobrindo até 50% da força máxima medida pelo transdutor de força em uma progressão linear, no transdutor de força e gravando as mudanças de tensão de saída. Calibre o comprimento aplicando um jogo da tensão conhecida da saída ao braço de alavanca e meça a mudança do comprimento do braço. Conecte as mangueiras do bloco térmico no suporte da amostra a um banho de circulação refrigerado e ajuste a temperatura para manter a temperatura desejada na câmara entre 10 ° c e 40 ° c. Determine isto empiricamente antes do tempo ajustando o banho de circulação a uma escala das temperaturas e medindo a temperatura na câmara com um par termoeléctrico. 2. preparação do músculo Eutanizar o rato Eutanizar o rato por inalação de dióxido de carbono seguido de luxação cervical. Pulverize a pele no membro traseiro com a solução fria de Ringer para impedir que o cabelo sopre na preparação. Retire a pele cortando-a ao redor da coxa usando uma tesoura de dissecção fina e puxe rapidamente a pele para baixo usando #5 fórceps para expor os músculos. Amputar o membro traseiro e transferi-lo para um prato de dissecação que foi preenchido com solução de Ringer oxigenada e, em seguida, colocar um microscópio de dissecação binocular. Preparando um músculo sóleo Fixe o membro traseiro no prato de dissecação com o músculo gastrocnêmio voltado para cima. Corte o tendão distal do grupo músculo gastrocnêmio/sóleo e levante os músculos suavemente e lentamente cortando a fáscia em ambos os lados do músculo gastrocnêmio usando tesouras finas. Isolar o grupo músculo gastrocnêmio/sóleo do membro após libertar o tendão proximal do músculo sóleo. Fixe o grupo muscular que contém o músculo gastrocnêmio e o tendão distal no prato de dissecação. Levante o músculo sóleo suavemente através do tendão proximal e separe-o do músculo gastrocnêmio deixando tanto do tendão distal do sóleo intacto quanto possível. Preparando um músculo extensor longo (EDL) do digitorium Fixar o membro traseiro no prato de dissecação com o músculo tibial anterior voltado para cima. Corte a fáscia ao longo do músculo tibial anterior (ta) e puxe-o claro usando fórceps. Identifique e corte o tendão distal do músculo TA. Levante o músculo TA e corte-o cuidadosamente sem puxar o músculo EDL. Corte abrir o lado lateral do joelho e expor os dois tendões. Corte o tendão proximal, deixando tanto do tendão quanto possível ainda ligado ao músculo, e levante o músculo EDL (músculo medial), puxando suavemente o tendão. Corte o tendão distal uma vez exposto. Montagem do músculo Fixar o músculo através dos tendões, e aparar toda a gordura extra, fáscia e tendão afastado, tanto quanto possível. Inserir um tendão em um nó pré-amarrado e amarrar a sutura firmemente com sutura amarrando fórceps. Amarrar o segundo nó em torno do gancho de metal. Repita o mesmo procedimento com o gancho longo na outra extremidade do tendão. Certifique-se de que nenhum do corpo do músculo é contatado pelas suturas. Isto danificará a preparação. Prenda o gancho curto à parte inferior da câmara experimental e o gancho longo ao transdutor/motor da força do modo duplo. Borbulhe a solução na câmara experimental com 100% de oxigénio. Otimizando protocolos de estimulação e comprimento muscular Esticar o músculo ajustando os Micromanipuladores acoplados ao transdutor/motor para gerar uma tensão da linha de base entre 15 a 20 mN antes de encontrar os melhores parâmetros do estímulo. Ajuste a tensão da estimulação a 40 V. A corrente da estimulação é aumentada sistematicamente até que não haja nenhum aumento adicional na força do Twitch. A mais alta corrente encontrada é aumentada em cerca de 50% para garantir a ativação supra-máxima. Encontre o comprimento ideal, L0, definido como o comprimento muscular que dão força máxima de contração, aumentando o comprimento muscular e ativando o músculo com um único contração até que a força ativa (força de pico menos força basal) pára de aumentar. Realize uma contração tetânica curta (1 s ativação) para testar a montagem e esticar o músculo de volta para a força basal ideal, se necessário. Registre o comprimento muscular em mm com um paquímetro digital. 3. difração de raios-X Nota: A seguinte descrição é para experimentos de difração de raios x feitos usando o instrumento de difração de raios x de pequeno ângulo na beamline 18id da Biocat na fonte avançada de fótons, laboratório nacional de Argonne, mas métodos semelhantes poderiam ser empregados em outras linhas de linhas luz como o ID 02 na ESRF (França) e BL40XU em SPring8 (Japão). Beamline 18ID é operado em uma energia fixa do feixe de raio X de 12 keV (comprimento de onda de 0,1033 nanômetro) com um fluxo do incidente de ~ 1013 fótons por o segundo no feixe cheio. Escolha uma amostra para a distância do detector (comprimento da câmera). Use um comprimento de câmera de 1,8 m para experimentos examinando a actina de 2,7 nm e reflexões de miosina de ordem alta, como reflexos meridional de 2,8 nm. Use uma câmera de 4-6 m para outros experimentos, onde um está principalmente interessado em detalhes finos no meridiano e linhas de camada Otimizando a posição da amostra em feixe Determine a posição do feixe usando uma parte de papel sensível do raio X que produza um ponto escuro em resposta aos raios X (“uma queimadura”). Em seguida, use um gerador de cabelo cruzado de vídeo para criar um cross-Hair alinhado com a marca de queimadura no papel ou simplesmente fazer uma marca na tela de vídeo com uma caneta marcador. Use a interface gráfica do usuário fornecida pela BioCAT para o posicionador de amostra para mover o músculo para ser centrado na posição do feixe. Oscilar a câmara da amostra em ~ 10-20 mm/s movendo o estágio da amostra a fim espalhar a dose do raio X sobre o músculo durante a exposição. Observe a amostra como ele se move para evitar grandes regiões de fáscia (contém colágeno que irá poluir os padrões de Difração) e para garantir que ele permanece iluminado durante todo o caminho de sua viagem.Nota: As etapas exatas exigidas nas seções 3,3 e 3,4 para fazer as configurações e as ações exigidas usando a interface de usuário gráfica beamline-fornecida serão beamline e detector específico. Pergunte ao pessoal da beamline como realizar essas operações. Configurando o detector CCD (dispositivo de carga acoplada) para padrões de alta resolução do músculo em Estados estáticos definidos (descansando, ou durante a contração isométrica) Configure o tempo de exposição e o período de exposição na interface gráfica do usuário para o software de controle. Tome uma imagem de fundo escura antes de tomar a exposição e repita este procedimento cada 2 horas ou após a mudança do tempo da exposição para corrigir toda a tração na eletrônica do leitura do detector. Atenuam o feixe de raios-X para o valor desejado para a exposição. Então pegue uma imagem. Não é possível tirar sequências de imagens com este detector. O detector CCD também precisa de vários segundos para ler uma imagem individual. Configurando o detector de pixel array para um experimento de tempo resolvido Configure o número de imagens, o tempo de exposição, o período de exposição na interface gráfica do usuário. O detector de pixel array usado aqui precisa de pelo menos 1 ms para leitura. A frequência máxima do quadro para o detector de contagem de fótons é 500 Hz. Use o sinal de saída do detector de contagem de fótons para controlar o obturador de raios X. Atenuar o feixe para a intensidade desejada. Armar o detector e aguardar o gatilho do sistema de aquisição de dados. Sincronize os dados mecânicos e de raio X ao acioná-los ao mesmo tempo. Os padrões de raios-X são coletados continuamente ao longo do protocolo a com um tempo de exposição de 1 ms e um período de exposição de 2 ms.Nota: O tempo exato de exposição e o período de exposição devem ser determinados caso a caso para as informações desejadas e a vida útil observada da amostra no feixe. Atenuar o feixe, a fim de não usar mais raio-X do que é necessário para fornecer dados analisáveis no período de exposição escolhido. 4. pós-experimento de tratamento muscular Recupere e pese o músculo após cada experimento mecânico e de raios-X. Calcule a área transversal do músculo usando o comprimento do músculo medido e a massa muscular11 assumindo uma densidade muscular de 1, 6 g/ml12. Esticar o músculo para o comprimento experimental e fixar o músculo em formalina 10% por 10 min. Separe o músculo fixo em uma série de feixes de fibra selecionados a partir de locais ao longo de toda a seção transversal muscular3. Meça o comprimento do sarcômero usando um sistema de medição do comprimento do sarcômero video.