근육 질환의 구조적 기초를 연구하기위한 도구로 그대로 뮤린 골격 근육의 X 선 회절

모든 동물 실험 프로토콜은 일리노이 공과 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (프로토콜 2015-001, 승인 날짜: 3 11 월 2015)에 의해 승인되었으며 NIH “실험실 동물의 관리 및 사용을위한 가이드”9 . 1. 사전 실험 준비 링거 용액 500 mL(포함: 145 mM NaCl, 2.5 mM KCl,1.0 mM MgSO 4, 1.0 mM CaCl2,10.0 mM HEPES, 11 mM 포도당, pH 7.4)을 실험의 매일 신선하게 준비한다. 링거 용액 200 mL을 스프레이 병에 채우고 4 °C 냉장고에 보관하십시오. 링거 용액으로 페트리 접시(직경 10cm)를 채우고 산소 실린더에서 수족관 공기 석에 튜브를 연결하여 100% 산소를 주입합니다. 페트리 접시 (“해부 요리”)는 이전에 해부 중에 핀을 삽입 할 수 있도록 탄성 중합체 화합물로 코팅되었습니다. 금속 장착 후크를 준비합니다. 직경 0.5mm의 스테인리스 스틸 와이어 두 개를 적절한 길이로 자르고 양쪽 끝에서 와이어를 구부려 후크를 형성합니다. 모든 해부 도구, 가위, 봉합 집게, 사용하기에 편리한 마이크로 가위를 정렬합니다.참고: 후크 부분은 약 3mm 길이여야 합니다. 긴 와이어 (후크에서 끝나는)는 약 5cm 길이여야하며, 짧은 와이어 (또한 후크에서 끝나는)는 BioCAT에서 사용되는 사용자 정의 챔버에 맞게 약 1cm 길이여야하며 트랜스듀서 암에 대한 충분한 운동 범위를 허용해야합니다. 모든 장비를 연결하고 켭니다. 여기에는 결합된 모터/힘 트랜스듀서, 모터/포스 트랜스듀서 컨트롤러, 고출력 이중 패시크 전류 자극기, 컴퓨터 제어 데이터 수집/제어 시스템이 포함됩니다. 실험10을시작하기 전에 데이터 수집 시스템을 켜고 보정합니다. 간단히 말해서, 알려진 가중치 세트를 추가하여 힘을 보정하고, 선형 진행에서 힘 변환기로 측정된 최대 힘의 최대 50%를 포스 트랜스듀서에 덮고, 출력 전압 변화를 기록합니다. 레버 암에 알려진 출력 전압 세트를 적용하여 길이를 보정하고 암의 길이 변화를 측정합니다. 시료 홀더의 열 블록에서 호스를 냉장 순환 욕조에 연결하고 챔버에서 원하는 온도를 10°C에서 40°C 사이로 유지하도록 온도를 설정합니다. 순환 욕조를 다양한 온도로 설정하고 열전대를 사용하여 챔버의 온도를 측정하여 미리 이 것을 결정합니다. 2. 근육 준비 마우스 안락사 자궁 경부 탈구 에 이어 이산화탄소 흡입에 의해 마우스를 안락사. 차가운 링거 용액으로 뒷다리에 피부를 뿌리면 모발이 준비중으로 불어오는 것을 방지합니다. 미세한 해부 가위를 사용하여 허벅지 주위를 절단하여 피부를 제거하고 근육을 노출하기 위해 #5 집게를 사용하여 피부를 빠르게 아래로 당깁니다. 뒷다리를 절단하고 산소 링거의 용액으로 채워진 해부 접시로 옮김을 옮김시킨 다음 쌍안경 해부 현미경 아래에 놓습니다. 발바닥 근육 준비 위절제술을 위쪽으로 향하여 해부하는 접시에 뒷다리를 고정합니다. 위장관/발바닥 근육 그룹의 말단 힘줄을 잘라 미세 가위를 사용하여 위장내 근육의 양쪽에 근막을 절단하여 부드럽고 천천히 근육을 들어 올립니다. 발바닥 근육의 근위 힘줄을 풀어 낸 후 사지에서 위장혈증 /발바닥 근육 그룹을 분리하십시오. 해부 접시에 위증 근육과 말단 힘줄을 포함하는 근육 그룹을 고정합니다. 근위 힘줄을 통해 발바닥 근육을 부드럽게 들어 올리고 가능한 한 발바닥 말단 힘줄을 그대로 남기는 위장혈에서 분리하십시오. 근근막디지오리움 롱러스(EDL) 근육 준비 경골 전방 근육이 위쪽을 향하여 해부 접시에 뒷다리를 고정합니다. 경골 전방 (TA) 근육을 따라 근막을 잘라 집게를 사용하여 명확하게 당깁니다. TA 근육의 말단 힘줄을 식별하고 잘라냅니다. TA 근육을 들어 올리고 EDL 근육을 당기지 않고 조심스럽게 잘라. 무릎의 측면을 열고 두 개의 힘줄을 노출 잘라. 근위 힘줄을 잘라, 가능한 한 많은 힘줄을 떠나 여전히 근육에 부착, 부드럽게 힘줄을 당겨 EDL 근육 (내측 근육)를 들어 올립니다. 원위 힘줄이 노출되면 잘라. 근육 장착 힘줄을 통해 근육을 아래로 고정, 모든 여분의 지방을 손질, 근막과 힘줄 멀리 가능한 한 많이. 하나의 힘줄을 미리 묶은 매듭에 넣고 봉합사를 묶는 집게로 단단히 묶습니다. 금속 후크 주위에 두 번째 매듭을 묶습니다. 힘줄의 다른 쪽 끝에 있는 긴 후크와 동일한 절차를 반복합니다. 근육의 몸이 봉합사에 의해 접촉되지 않았는지 확인하십시오. 이렇게 하면 준비가 손상됩니다. 짧은 후크를 실험 챔버 의 바닥에 부착하고 긴 후크를 듀얼 모드 힘 트랜스듀서 / 모터에 부착하십시오. 100 % 산소로 실험 챔버에서 용액을 거품. 자극 프로토콜 및 근육 길이 최적화 트랜스듀서/모터에 부착된 마이크로 매니퓰레이터를 조정하여 근육을 스트레칭하여 최상의 자극 파라미터를 찾기 전에 15~20mN 사이의 기준선 장력을 생성합니다. 자극 전압을 40V로 설정합니다. 자극 전류는 트위치 힘의 추가 증가가 없을 때까지 체계적으로 증가합니다. 발견된 가장 높은 전류는 최대 활성화를 보장하기 위해 약 50% 증가합니다. 최적의 길이를 찾아, L0,최대 트위치 힘을 주는 근육 길이로 정의, 근육 길이를 증가 하 고 활성 힘 (피크 힘 마이너스 기준선 힘) 증가 중지 될 때까지 단일 트 위치와 근육을 활성화 하 여. 짧은 파상풍 수축(1s 활성화)을 수행하여 마운팅을 테스트하고 필요한 경우 근육을 다시 최적의 기준선 힘으로 늘입니다. 디지털 캘리퍼로 근육 길이를 mm로 기록합니다. 3. 엑스레이 회절 참고: 다음 설명은 고급 광자 소스, 아르곤 국립 연구소에서 BioCAT 빔 라인 18ID에 작은 각도 X 선 회절 기기를 사용하여 수행 X 선 회절 실험에 대한 하지만 유사한 방법은 다른 빔 라인에 사용될 수있다 ESRF(프랑스)의 ID 02, SPring8(일본)의 BL40XU와 같은. 빔라인 18ID는 전체 빔에서 초당 ~10 광자 ~10광자의 입사 플럭스와 함께 12 keV (0.1033 nm 파장)의 고정 X 선 빔 에너지에서 작동된다. 검출기 거리(카메라 길이)까지 시편을 선택합니다. 2.7 nm 액틴 및 2.8 nm 자오선 반사와 같은 고차 미오신 반사를 검사하는 실험에 1.8m 카메라 길이를 사용합니다. 자오선과 레이어 라인의 세밀한 디테일에 주로 관심이 있는 다른 실험에는 4-6m 카메라를 사용합니다. 빔에서 샘플위치 최적화 X선에 반응하여 어두운 지점을 생성하는 X선 민감한 용지(“화상”)를 사용하여 빔 위치를 결정합니다. 그런 다음 비디오 십자선 생성기를 사용하여 용지의 화상 표시에 정렬된 십자선을 만들거나 마커 펜으로 비디오 화면에 표시를 만듭니다. BioCAT이 제공된 그래픽 사용자 인터페이스를 샘플 포지셔너에 사용하여 빔 위치의 중심이 되는 근육을 이동합니다. 노출 동안 근육에 X 선 용량을 확산하기 위해 샘플 단계를 이동하여 ~ 10-20 mm /s에서 샘플 챔버를 진동. 근막의 큰 영역을 피하기 위해 이동시 샘플을 관찰 (회절 패턴을 오염 콜라겐을 포함) 그리고 그것의 여행의 전체 경로 동안 조명 유지 되도록.참고: 3.3 및 3.4 절에서 빔라인이 제공하는 그래픽 사용자 인터페이스를 사용하여 필요한 설정 및 작업을 만드는 데 필요한 정확한 단계는 빔라인 및 검출기별입니다. 이러한 작업을 수행하는 방법에 대해 beamline 직원에게 문의하십시오. 정의된 정적 상태(휴식 중 또는 등각 부호 조절 중)에서 근육의 고분해능 패턴에 대한 CCD(충전 결합 장치) 감지기 설정 제어 소프트웨어에 그래픽 사용자 인터페이스에서 노출 시간 및 노출 기간을 설정합니다. 노출을 하기 전에 어두운 배경 이미지를 가지고 2시간마다 또는 노출 시간을 변경한 후 이 절차를 반복하여 검출기 판독 전자 기기의 드리프트를 수정합니다. X선 빔을 노출에 대해 원하는 값으로 감쇠시합니다. 그런 다음 이미지를 가져 가라. 이 검출기로는 이미지 시퀀스를 볼 수 없습니다. CCD 검출기는 개별 이미지를 판독하는 데 몇 초가 필요합니다. 해결된 시간 실험을 위해 픽셀 배열 감지기 설정 그래픽 사용자 인터페이스에서 이미지 수, 노출 시간, 노출 기간을 설정합니다. 여기에 사용되는 픽셀 어레이 검출기는 판독에 최소 1ms가 필요합니다. 광자 계수 검출기의 최대 프레임 주파수는 500Hz입니다. 빔을 원하는 강도로 감쇠시합니다. 검출기를 무장시키고 데이터 수집 시스템에서 트리거를 기다립니다. 기계 및 X선 데이터를 동시에 트리거하여 동기화합니다. X선 패턴은 프로토콜 a 전체에 걸쳐 1 ms 노출 시간 및 2 ms 노출 기간을 통해 지속적으로 수집된다.참고: 정확한 노출 시간 및 노출 기간은 빔내시료의 관찰수명과 원하는 정보에 대해 사례별로 결정되어야 한다. 선택한 노출 기간에 분석 가능한 데이터를 제공하는 데 필요한 것보다 더 이상 X선 빔을 사용하지 않기 위해 빔을 감쇠시합니다. 4. 실험 후 근육 치료 각 기계 및 X 선 실험 후 근육을 복구하고 계량하십시오. 1.06 g/mL 12의 근육 밀도를 가정하여 측정된 근육 길이 및 근육 질량(11)을 사용하여 근육의 단면적을 계산한다. 근육을 실험 길이로 스트레칭하고 10 분 동안 10 % 포르말린으로 근육을 고정시고 고정 된 근육을 전체 근육단면 3의 위치에서 선택한 일련의 섬유 묶음으로 분리합니다. 비디오 사르카망 길이 측정 시스템을 사용하여 사르카망 길이를 측정합니다.