प्रारंभिक विकास के दौरान सागर एनमोन का जनन
Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य भ्रूण का त्याग किए बिना समुद्र एनामोने नेमाटोस्टेला वेक्टेन्सिस को गैसट्रेशन के दौरान जीनोटाइप करना है.
Abstract
यहाँ वर्णित एक पीसीआर आधारित प्रोटोकॉल है जो जानवर के जीवन का त्याग किए बिना एंथोजोआन निडरियन नेमाटोस्टेला वेक्टेन्सिस के गैस्ट्रुला चरण भ्रूण को जीनोटाइप करने के लिए है। इन विट्रो निषेचन और डी-जेलिंग के बाद, युग्मनज को कमरे के तापमान पर 24 एच के लिए विकसित करने की अनुमति दी जाती है ताकि मध्य-गैस्ट्रुला चरण तक पहुंच सके। गैस्ट्रुला भ्रूण तो समुद्री जल युक्त एक पेट्री डिश में एक agarose जेल बिस्तर पर रखा जाता है. विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, एक टंगस्टन सुई शल्य चिकित्सा प्रत्येक भ्रूण से एक aboral ऊतक टुकड़ा अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है। सर्जरी के बाद भ्रूण तो चंगा और विकास जारी रखने के लिए अनुमति दी जाती है. जीनोमिक डीएनए अलग ऊतक टुकड़ा से निकाला जाता है और टिड्डी विशेष पीसीआर के लिए एक टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया। जीनोटाइप पीसीआर उत्पादों या उपस्थिति /विशिष्ट पीसीआर उत्पादों की उपस्थिति/अभाव के आकार के आधार पर निर्धारित किया जा सकता है। सर्जरी के बाद भ्रूण तो जीनोटाइप के अनुसार हल कर रहे हैं. पूरे जीनोटाइपिंग प्रक्रिया की अवधि जांच की जाने वाली भ्रूणों की संख्या पर निर्भर करती है, लेकिन इसके लिए न्यूनतम 4-5 ज की आवश्यकता होती है। इस विधि भ्रूण की एक आनुवंशिक रूप से विषम आबादी से नॉकआउट उत्परिवर्ती की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और विकास के दौरान phenotypes के विश्लेषण में सक्षम बनाता है.
Introduction
Cnidarians जेलीफ़िश, कोरल, और समुद्री anemones शामिल हैं कि जानवरों की एक विविध समूह का प्रतिनिधित्व करते हैं। वे डिप्लोब्लास्ट, बहिर्चर्म और एंडोडर्म से बना है जो एक extracellular मैट्रिक्स (mesoglea) द्वारा अलग कर रहे हैं। Cnidaria एक बहन समूह के लिए कल्पना Bilateria है, जो इस तरह के Drosophila और Mus के रूप में पारंपरिक पशु मॉडल1से संबंधित है. इसके अतिरिक्त, Cnidaria-Bilateria विचलन पूर्व Cambrian अवधि2में हुई है माना जाता है. इस तरह के रूप में, उनके सबसे हाल ही में आम पूर्वज के जीव विज्ञान में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए nidarians और bilaterians के तुलनात्मक अध्ययन आवश्यक हैं. हाल ही में, तुलनात्मक जीनोमिक्स से पता चला है कि cnidarians और bilaterians पायदान और BHLH जैसे कई विकासात्मक टूलकिट जीन साझा करते हैं, जिसका अर्थ है कि उनके सामान्य पूर्वज में पहले से ही ये जीन3थे। हालांकि, Cnidaria और Bilateria के अंतिम आम पूर्वज में इन विकास Toolkit जीन की भूमिका तुलनात्मक रूप से कम अच्छी तरह से समझा जाता है. इस समस्या का समाधान करने के लिए, यह अध्ययन करना महत्वपूर्ण है कि ये गहराई से संरक्षित जीन कैसे निडरियन्स में कार्य करते हैं।
उभरते निडनेरियन आनुवंशिक मॉडलों में से एक एंथोजोअन नेमाटोस्टेला वेक्टेन्सिस है। इसके जीनोम3अनुक्रम किया गया है, और आनुवंशिक उपकरणों की एक किस्म है, morpholino-मध्यस्थ जीन knockdown सहित, meganuclease-मध्यस्थ transgenesis, और CRISPR-Cas9-मध्यस्थ जीन knockins और knockouts, अब इस जानवर में उपयोग के लिए उपलब्ध हैं. इसके अलावा, नेमाटोस्टेला विकास अपेक्षाकृत अच्छी तरह से समझा जाता है। भ्रूणजनन के दौरान, गैस्ट्रेशन 4 के सेवन से होता है, और भ्रूण एक मुक्त-स्वीमिंग प्लैनुला लार्वा में विकसित होता है। planula बाद में एक मुंह और परिमुख जाल के साथ एक सेसाइल पॉलीप में बदल देती है। पॉलीप तो बढ़ता है और यौन परिपक्वता तक पहुँचता है.
CRISPR-Cas9-मध्यस्थ लक्षित मटजनन अब नियमित रूप से नेमाटोस्टेला वेक्टेन्सिस5,6,7,8,9में जीन फंक्शन का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। Nematostellaमें नॉकआउट म्यूटेंट उत्पन्न करने के लिए, एक कॉकटेल जिसमें टिड्डी-विशिष्ट एकल-गाइड आरएनए और एंडोनुकेलेस Cas9 प्रोटीन शामिल हैं, को पहले F0 संस्थापक जानवरों का उत्पादन करने के लिए अनफर्टिलाइज्ड या निषेचित अंडे में इंजेक्ट किया जाता है जो आम तौर पर दिखाते हैं मोज़ेकवाद. F0 जानवरों बाद में यौन परिपक्वता के लिए उठाया और एक दूसरे के साथ पार कर रहे हैं एक F1 जनसंख्या का उत्पादन, जिनमें से एक सबसेट नॉकआउट उत्परिवर्ती6हो सकता है . वैकल्पिक रूप से, यौन परिपक्व F0 जानवरों जंगली प्रकार जानवरों के साथ पार किया जा सकता है F1 विषमयुग्मज जानवरों उत्पन्न करने के लिए, और F1 heterozygotes कि ब्याज की टिड्डी में एक नॉकआउट allele ले तो एक दूसरे के साथ पार किया जा सकता है F2 वंश का उत्पादन करने के लिए, एक चौथाई जिनमें से नॉकआउट म्यूटेंट5होने की संभावना है. दोनों दृष्टिकोण एक आनुवंशिक रूप से विषम आबादी से नॉकआउट उत्परिवर्ती की पहचान करने के लिए एक विधि की आवश्यकता है. पॉलीप स्पर्शक का उपयोग जीनोटाइपिंग6,7के लिए जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए किया जा सकता है . हालांकि, मामलों में जहां ब्याज के जीन के विकास समारोह की जांच की जा रही है और उत्परिवर्ती भ्रूण पॉलीप चरण तक नहीं पहुंचते हैं (यानी, उत्परिवर्तन के साथ जुड़े लार्वा घातकता के कारण), नॉकआउट म्यूटेंट की पहचान जल्दी में करने की आवश्यकता है। यहाँ वर्णित एक पीसीआर आधारित प्रोटोकॉल जानवर का त्याग किए बिना gastrula चरण में जीनोटाइप व्यक्तिगत जानवरों के लिए है, जो भ्रूण की आनुवंशिक रूप से विषम आबादी से नॉकआउट उत्परिवर्ती की पहचान सक्षम बनाता है. पूरे जीनोटाइपिंग प्रक्रिया की अवधि जांच की जाने वाली भ्रूणों की संख्या पर निर्भर करती है, लेकिन इसके लिए न्यूनतम 4-5 ज की आवश्यकता होती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ एक पीसीआर आधारित प्रोटोकॉल के लिए पशु त्याग के बिना एक एकल समुद्र anemone भ्रूण जीनोटाइप वर्णित. अंडे देने और डी-जेलिंग के बाद, निषेचित अंडे को गैस्ट्रूले में विकसित करने की अनुमति है। प्रत्येक gastrula भ्र?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि है, जो पांडुलिपि में सुधार के पिछले संस्करण पर टिप्पणी के लिए गुमनाम समीक्षक धन्यवाद. इस काम Arkansas विश्वविद्यालय से धन द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Drosophila Peltier Refrigerated Incubator | Shellab | SRI6PF | Used for spawning induction |
| Instant ocean sea salt | Instant ocean | 138510 | |
| Brine shrimp cysts | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standard Orbital Shaker, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITY BIOLOGICAL | 351-007-01 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitute | US Biological | N3500 | |
| Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Dissecting needle holder | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten dissecting needle | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
Referências
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