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Bioquímica

Aislamiento de partículas de lipoproteínas de yema de huevo de pollo para el estudio de la incorporación de ácidos grasos patógenos bacterianos en fosfolípidos de membrana

Published: May 15, 2019
doi:
10.3791/59538
, ,
1Department of Microbiology and Molecular Genetics,Michigan State University, 2Department of Physiology,Michigan State University

Summary

Este método proporciona un marco para el estudio de la incorporación de ácidos grasos exógenos de fuentes huésped complejas en membranas bacterianas, particularmente Staphylococcus aureus. Para lograrlo, se describen los protocolos para el enriquecimiento de partículas de lipoproteínas a partir de la yema de huevo de pollo y el posterior perfilado de ácidos grasos de fosfolípidos bacterianos utilizando espectrometría de masas.

Abstract

Staphylococcus aureus y otros patógenos Gram-positivos incorporan ácidos grasos del medio ambiente en fosfolípidos de membrana. Durante la infección, la mayoría de los ácidos grasos exógenos están presentes dentro de las partículas de lipoproteínas del huésped. Sigue habiendo incertidumbre en cuanto a los reservorios de ácidos grasos huésped y los mecanismos por los cuales las bacterias extraen ácidos grasos de las partículas de lipoproteínas. En este trabajo, describimos protocolos para el enriquecimiento de partículas de lipoproteínas de baja densidad (LDL) a partir de yema de huevo de pollo y determinando si los LDL sirven como reservorios de ácidos grasos para S. aureus. Este método explota el análisis lipidémico imparcial y los LDL de pollo, un modelo eficaz y económico para la exploración de interacciones entre LDL y bacterias. El análisis de la integración de S. aureus de ácidos grasos exógenos de lDL se realiza utilizando espectrometría de masas de alta resolución/precisa y espectrometría de masas en tándem, permitiendo la caracterización de la composición de ácidos grasos de la bacteria identificación imparcial de nuevas combinaciones de ácidos grasos que surgen en los lípidos de la membrana bacteriana al exponerse a los LDL. Estas técnicas avanzadas de espectrometría de masas ofrecen una perspectiva sin igual de la incorporación de ácidos grasos al revelar los ácidos grasos exógenos específicos incorporados en los fosfolípidos. Los métodos descritos aquí son adaptables al estudio de otros patógenos bacterianos y fuentes alternativas de ácidos grasos complejos.

Introduction

S. aureus resistente a la meticilina (MRSA) es la principal causa de infección asociada a la atención sanitaria y la resistencia a los antibióticos asociada es un desafío clínico considerable1,2,3. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas es una alta prioridad. Una estrategia de tratamiento prometedora para patógenos Gram-positivos está inhibiendo la síntesis de ácidos grasos, un requisito para la producción de fosfolípidos de membrana que, en S. aureus, incluye fosfatidilglicerol (PG), lisil-PG, y cardiolipina4. En bacterias, la producción de ácidos grasos se produce a través de la vía de síntesis de ácidos grasos II (FASII)5, que es considerablemente diferente de la contraparte eucariota, haciendo de FASII un objetivo atractivo para el desarrollo de antibióticos5,6 . Los inhibidores de FASII se dirigen principalmente a FabI, una enzima necesaria para el alargamiento de la cadena de carbono de ácidos grasos7. El inhibidor FabI triclosán se utiliza ampliamente en bienes de consumo y médicos8,9. Inhibidores Adicionales FabI están siendo desarrollados por varias compañías farmacéuticas para el tratamiento de la infección por S. aureus 10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. Sin embargo, muchos patógenos Gram-positivos, incluyendo S. aureus, son capaces de barrer ácidos grasos exógenos para la síntesis de fosfolípidos, eludiendo la inhibición FASII27,28,29. Así, el potencial clínico de los inhibidores FASII se debate debido a considerables lagunas en nuestro conocimiento de las fuentes de ácidos grasos del huésped y los mecanismos por los cuales los patógenos extraen ácidos grasos del huésped27,28. Para abordar estas lagunas, desarrollamos un método de análisis lipidomico imparcial para monitorear la incorporación de ácidogra exógeno a partir de partículas de lipoproteínas en fosfolípidos de membrana de S. aureus.

Durante la sepsis, las partículas de lipoproteínas huésped representan una fuente potencial de ácidos grasos derivados del huésped dentro de la vasculatura, ya que la mayoría de los ácidos grasos del huésped están asociados con las partículas30. Las lipoproteínas consisten en una cáscara hidrófila compuesta de fosfolípidos y proteínas que encierran un núcleo hidrófobo de triglicéridos y ésteres de colesterol31. El huésped produce cuatro clases principales de lipoproteínas (quilomicron, lipoproteína de muy baja densidad, lipoproteína de alta densidad y lipoproteína de baja densidad (LDL)) y funcionan como vehículos de transporte de lípidos, suministrando ácidos grasos y colesterol hacia y desde células anfitrionas a través de la vasculatura. Los LDL son abundantes en ácidos grasos esterificados incluyendo triglicéridos y ésteres de colesterol31. Hemos demostrado previamente que los LDL humanos altamente purificados son una fuente viable de ácidos grasos exógenos para la síntesis de PG, proporcionando así un mecanismo para el bypass inhibidor de FASII32. La purificación de los LDL humanos puede ser técnicamente difícil y llevar mucho tiempo, mientras que las fuentes comerciales de LDL humanos purificados son prohibitivamente costosas de usar de forma rutinaria o para realizar pantallas bacterianas a gran escala. Para hacer frente a estas limitaciones, hemos modificado un procedimiento para el enriquecimiento de LDL a partir de la yema de huevo de pollo, una rica fuente de partículas de lipoproteínas33. Hemos utilizado con éxito espectrometría de masas no objetivo, de alta resolución/precisa y espectrometría de masas en tándem para monitorear la incorporación de ácidos grasos derivados de LDL humanos en la membrana de S. aureus32. A diferencia de los métodos reportados anteriormente, este enfoque puede cuantificar isómeros de ácidos grasos individuales para cada uno de los tres tipos principales de fosfolípidos estafilocócicos. El ácido oleico (18:1) es un ácido graso insaturado presente en todas las partículas de lipoproteínas del huésped que se incorpora fácilmente en S. aureus phospholipids29,30,32. S. aureus no es capaz de síntesis de ácido oleico29; por lo tanto, la cantidad de ácido oleico incorporado en fosfolípidos establece la presencia de ácidos grasos derivados de lipoproteínas huésped dentro de la membrana estafilocócica29. Estas especies de fosfolípidos pueden ser identificadas por el método de espectrometría de masas de última generación descrito aquí, ofreciendo una resolución sin precedentes de la composición de la membrana de S. aureus cultivada en presencia de una fuente de ácidos grasos que probablemente durante la infección.

Protocol

NOTA: El siguiente protocolo para el enriquecimiento de partículas LDL de yema de huevo de pollo se deriva de Moussa et al. 200233. 1. Preparación de yema de huevo de pollo para el enriquecimiento de partículas LDL Desinfecte dos huevos de pollo grandes lavando las cáscaras con una solución de etanol al 70% y deje secar al aire. Desinfecte el separador de huevos con una solución de etanol al 70% y deje secar al aire. Coloque el separador de hue…

Representative Results

El protocolo para el enriquecimiento de LDL a partir de la yema de huevo de pollo se ilustra en la Figura1. Este proceso comienza diluyendo la yema de huevo entera con salina y separando los sólidos de yemade huevo conocidos como gránulos de la fracción soluble o plasmática que contiene los LDL (Figura 1)33. El contenido de LDL de la fracción plasmática se enriquece aún más con la<strong class="xfi…

Discussion

S. aureus incorpora ácidos grasos exógenos en su membrana fosfolípidos27,32,43. La síntesis de fosfolípidos utilizando ácidos grasos exógenos evita la inhibición de faSII, pero también altera las propiedades biofísicas de la membrana27,32,44. Si bien la incorporación de ácidos grasos exógenos en fosfolípidos de pa…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a los miembros del laboratorio Hammer por su evaluación crítica del manuscrito y el apoyo de este trabajo. El Dr. Alex Horswill de la Escuela de Medicina de la Universidad de Colorado amablemente proporcionó AH1263. El laboratorio del Dr. Chris Waters de la Universidad Estatal de Michigan proporcionó reactivos. Este trabajo fue apoyado por la concesión 16SDG30170026 de la Asociación Americana del Corazón y los fondos de puesta en marcha de la Universidad Estatal de Michigan.

Materials

Ammonium sulfate Fisher BP212R-1 ≥99.5% pure
Cell culture incubator Thermo MaxQ 6000
Centrafuge Thermo 75-217-420 Sorvall Legen XTR, rotor F14-6×250 LE
Costar assay plate Corning 3788 96 well
Filter paper Schleicher & Schuell 597
Large chicken egg N/A N/A Common store bought egg
Microplate spectrophotometer BioTek Epoch 2
NaCl Sigma S9625
S. aureus strain AH1263 N/A N/A Provided by Alex Horswill of the University of Colorado
Dialysis tubing Pierce 68700 7,000 MWCO
Tryptone Becton, Dickison and Company 211705
0.5 mm zirconium oxide beads Next Advance ZROB05
Bullet Blender Next Advance BBX24B
Methanol (LC-MS grade) Fisher A4561
Chloroform (reagent grade) Fisher MCX10559
Isopropanol (LC-MS grade) Fisher A4611
Dimyristoyl phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 850345C-25mg
Ammonium bicarbonate Sigma 9830 ≥99.5% pure
Ammonium formate Sigma 70221-25G-F
Xcalibur software Thermo Scientific OPTON-30801
LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer Thermo Scientific high resolution/accurate mass MS
Agilent 1260 capillary HPLC Agilent
SpeedVac Vacuum Concentrators Thermo Scientific
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Referências

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Delekta, P. C., Lydic, T. A., Hammer, N. D. Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids. J. Vis. Exp. (147), e59538, doi:10.3791/59538 (2019).
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