JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

הצלה של וירוס רקומביננטי Zika מתוך כרומוזום מלאכותי בקטריאלי cDNA שיבוט

Published: June 24, 2019
doi:
10.3791/59537
, , , ,
1Department of Microbiology and Immunology,University of Rochester Medical Center, 2Department of Molecular and Cell Biology,Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC), Campus Universidad Autónoma de Madrid

Summary

המגיפה האחרונה של וירוס Zika מדגיש את החשיבות של הקמת גישות גנטיות הפוכה לפתח חיסונים ו/או אסטרטגיות טיפוליות. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול כדי להציל וירוס מדבק רקומביננטי Zika מתוך שיבוט באורך מלא cDNA התאספו בכרומוזום מלאכותי חיידקי תחת השליטה של cytomegalovirus ירוס האדם המוקדם מיידית היזם.

Abstract

האגודה של וירוס zika (zika) זיהום עם סיבוכים נוירולוגיים במהלך ההתפרצות העולמית האחרונה ואת חוסר חיסונים מאושרים ו/או נוגדנים יש הבקיע את הצורך הדחוף לפתח מערכות גנטיות הפוכה zika כדי להקל על ה חקר ביולוגיה של ZIKV ופיתוח גישות טיפוליות ו/או מניעתי. עם זאת, כמו עם וירוסים אחרים, הדור של ZIKV באורך מלא מדבקת cDNA שיבוטים כבר החלה בשל רעילות של רצפים ויראלי במהלך הגברה שלה חיידקים. כדי להתגבר על בעיה זו, פיתחנו גישה לא מסורתית המבוססת על השימוש של כרומוזומים מלאכותיים חיידקיים (BACs). באמצעות גישה זו, באורך מלא cDNA עותק של זן ZIKV ריו גרנדה do Norte נטאל (ZIKV-RGN) נוצר מארבעה שברי דנ א סינתטי והתאספו לתוך עותק יחיד pBeloBAC11 באמצע תחת השליטה של cytomegalovirus האנושי (CDNA) יזם מוקדם מיידית התאספו שיבוט BAC cDNA הוא יציב במהלך התפשטות חיידקים, ו זיהומיות רקומביננטי (r) ZIKV הוא התאושש בתאי ברו לאחר התפשטות של שיבוט BAC cDNA. הפרוטוקול המתואר כאן מספק טכניקה רבת עוצמה עבור הדור של שיבוטים מדבקים של וירוסים וירוסים, כולל zikv, ו אחרים חיובי-הגדיל וירוסי RNA, במיוחד אלה עם גנום גדול שיש להם בעיות יציבות במהלך חיידקים הפצת ההפצה.

Introduction

ZIKV הוא חבר של היתוש הנישא של סוג Flavivirus בתוך משפחת פלאוויריתיים המהווה כיום חירום הכללית בריאות הציבור1. כמו וירוסים אחרים, ZIKV הוא וירוס מעטפת RNA עם מבנה מדומה, המכיל תחושה חיובית, יחיד תקוע מולקולה RNA של כ 10.8 kb (איור 1)2. הגנום הנגיפי מקודד polyprotein גדול של כ 3,423 חומצות אמינו כי הוא מעובד על ידי פרוטסים ויראלי הסלולר לתוך שלושה חלבונים מבניים (capsid [C], premembrane/ממברנה [prM/M], ומעטפה [E]) המעורבים היווצרות של חלקיקים ויראליים שבעה (NS) חלבונים (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, ו NS5) כי להשתתף שכפול הגנום, וירוס הרכבה, והתחמקות של התגובה החיסונית מארח (איור 1)3.

היסטורית, זיהום zikv נקשר עם מחלה חום קל4,5. עם זאת, המגפה האחרונה נפץ של זיהומים zikv ברחבי דרום ומרכז אמריקה, דרום האוקיינוס השקט, ואת הקאריביים6,7,8, ואת הקשר שלה עם התרחשות של תסמונת גיליאן בברה ומיקרוצפליה9,10,11,12,13, שינו את התפיסה ההיסטורית ובעלת פוטנציאל לרלוונטיות של zikv כפתוגן אנושי חשוב. במובן זה, התפתחות של כלים מולקולריים, כגון שיבוטים cDNA זיהומיות, יקל על המחקר של פתוגנזה נגיפי ופיתוח של חיסונים מוגדרים גנטית זיהוי של תרופות אנטי לטיפול בזיהום ZIKV. כפי שמתואר עבור וירוסים אחרים, הדור של שיבוטים זיהומיות ZIKV קשה בשל נוכחותם של היזמים בקטריות מסתורית הגנום הנגיפי14 המאפשרים ביטוי דולף של חלבונים נגיפי רעילים במהלך התפשטות של cdna שיבוטים בחיידקים באמצעות תקן גבוה העתק מספר פלמידים15,16,17. כדי להתגבר על בעיית רעילות זו, מספר גישות שאינן מסורתיות יושמו בהצלחה בשנתיים האחרונות של18. אלה כוללים את השימוש של מספר העתק-החלקיקים הנמוכים19,20, החדרת introns כדי לשבש את האזורים הרעילים21,22,23, הארכה מחוץ לחומר של שברי cdna בת 24 , 25, השתקה של היזמים בקטריות מסתורית נוכח הגנום הנגיפי26,27, זיהומיות משנה הגברה (ISA)28,29, שיטת הגיבסון האסיפה30 , והשימוש בתגובת הרחבה מעגלית פולימרואז (CPER)31.

בזאת, אנו מתארים את הפרוטוקול המפורט עבור הנדסה של שיבוט cDNA באורך מלא של מאמץ ZIKV ZIKV-RGN13, באמצעות BAC כדי להתגבר על בעיית רעילות, ואת ההצלה של rZIKV זיהומיות ידי העברה ישירה של שיבוט BAC cdna לתוך ברו תאים32, קו תא מאושר על ידי מינהל המזון והתרופות (FDA) לפיתוח חיסונים אנושיים33. במערכת זו, העתק באורך מלא cDNA של הגנום הנגיפי הוא התאספו ב-34 pBeloBAC11 באמצע בינוני (איור 2a), מספר העתק נמוך-פלמיד (אחד לשני עותקים לכל תא) נגזר Es, האנהנשכיה F-factor35, אשר ממזער את רעילות של רצפים וירוס במהלך התפשטות שלה בחיידקים. CDNA של הגנום ZIKV מורכב ב pBeloBAC11 תחת שליטה של מיזם האדם CDNA האנושי מיידית, כדי לאפשר את הביטוי של ויראלי (v) RNA בגרעין של תאים מזוהמים על ידי הסלולר RNA פולימראז II, ומקיפים את 3 ‘-end על ידי צהבת דלתא וירוס (HDV) ריבוזים (rz), ואחריו רצפים של הורמון גדילה השור (bgh) הפסקת ואותות פוליאדלציה כדי לייצר rz סינתטי נושא אותנטי 5 ‘-ו 3 ‘-קצות הגנום הנגיפי, בהתאמה (איור 2b). זה cDNA-השיקה מערכת התוצאות ביטוי תאיים של RNA ויראלי הכתיר, המאפשר התאוששות של ZIKV זיהומיות ללא צורך לשלב שעתוק מבחנה. הגישה באק מספק מתודולוגיה רבת עוצמה הישימה כדי לבנות יציב ופונקציונלי מדבקת cdna שיבוטים עבור flaviviruses אחרים, כמו גם אחרים וירוסים חיובי-RNA36,37, 38,39,40,41.

Protocol

1. בנייה של מדבקת cDNA שיבוט זיהומיות ב-BAC הערה: האסטרטגיה עבור הרכבה של ZIKV ב BACs מתוארת עבור זן RGN13 (ההצטרפות מספר KU527068) (איור 2). בחרו אתרי הגבלה ייחודיים המרווחים כראוי בגנום הנגיפי שנעדרים בpBeloBAC11 הפלמיד (איור 2A).הערה: עבור ZIKV-RGN, אתרי ההגבלה Pml I, Afe אני, ו-BstB I (משרות גנומית 3,347, 5,969, ו 9,127, בהתאמה) נבחרו. במקרה שאין אתרי הגבלה מתאים זמינים בגנום נגיפי, ליצור אתרי הגבלה חדשים על ידי החדרת נוקלאוטיד שקט מוטציות בגנום ויראלי במהלך העיצוב קטע cDNA. לייצר על ידי סינתזה כימית ארבעה שברי ה-Dna מתוך הגנום באורך מלא (Z1 to Z4), מוקף על ידי היזם CDNA ב 5 ‘-end ו-HDV RZ, הפסקת BGH, ורצפים פוליאדלציה ב 3 ‘-end ( איור 2B). על כל קטע להיות מוקף באתרי ההגבלה שנבחרו (שלב 1.1).הערה: רסיס Z1 משמש כעמוד השדרה כדי לשכפל את שאר השברים pBeloBac11. לשם כך, הוא חייב להכיל את היזם CMV האדם צריך להיות מוקף ב 5 ‘-end על ידי ApaL אני (כדי לשכפל את הקטע הזה ב pBeloBAC11) ו עולה I (נעדר הגנום הנגיפי), ו ב 3 ‘-end על ידי אתרי ההגבלה שנבחרו עבור ההרכבה של שיבוט זיהומיות (Pml I , Afe I, ו-BstB I) ואחריו Mlu I (נעדר הגנום הנגיפי) ו BamH אני (כדי לשכפל את הרסיס הזה ב pBeloBAC11). רסיס Z4 חייב להכיל את האזור גנומית מאתר ההגבלה האחרון שנבחר (BstB I) לסוף הגנום הנגיפי, ואחריו HDV RZ, הפסקת BSTB, ורצפים פוליאדלציה, ואת מגבלת Mlu I אתר (איור 2B). לחילופין, שברי ה-Dna (Z1-Z4) יכולים להיווצר על-ידי שילוב של תגובות שרשרת של היפוך הרוורס פולימראז (RT-בדיקות) והבדיקות החופף באמצעות מחלת אוליונוב מסויימת. להרכיב את שיבוט מדבקת cDNA ידי שיבוט רציפים של קטעים Z1 כדי Z4 לתוך pBeloBAC11 (איור 2B). לעכל את pBeloBAC11 באמצע ואת הקטע Z1 עם ApaL אני ובח האני. בשביל זה, לערבב 2 μg של pBeloBAC11 באמצע או 1 μg של קטע Z1 עם 10 μL של מאגר התגובה 10x, 20 יחידות של אנזים כל, ומים כדי להגיע לנפח הסופי של 100 μL. דגירה ב 37 ° c עבור 2 h. ביטול השימוש וקטור BAC באמצעות שרימפס בסיסי פוספספטאז (SAP). לשם כך, להוסיף 2.5 μL (2.5 יחידות) של SAP לתוך BAC מתעכל ו-דגירה ב 37 ° c עבור 1 h. חום-להפעיל את SAP על ידי דגירה ב 75 ° c עבור 15 דקות. לטהר את הווקטור BAC הפחת ו רסיס Z1 על ידי אגנה ג’ל באמצעות ג’ל מסחרי לניקוי הערכה אופטימיזציה לטיהור של שברי DNA גדול יותר 10 kb (לראות את הטבלה של חומרים). בצע את התגובה הליצור כדי ליצור את הפלסמיד (p) BAC-Z1. לשם כך, לערבב 150 ng של וקטור מתעכל BAC מטוהרים עם להוסיף מטוהרים באמצעות יחס טוחנת של וקטור-כדי להוסיף של 1:3, 1.5 μl של מאגר ה-dna 10x t4 ליגאז המכיל 10 מ”מ ATP, יחידה אחת של t4 dna ליגאז, ומים לנפח הסופי של 15 μl. מודפה את תערובת הריסוס במשך 20 שעות ב -16 ° c. כשליטה על תגובת הזמן, בצע במקביל תגובה מקבילה ללא הכנסה. חום-הפוך את הליגסה על ידי דגירה ב 65 ° c עבור 15 דקות.הערה: במקרה של DNAs בוטה שהסתיימה, מודמת את התגובה לסיום 20 h ב 14 ° c. בשל הגודל הגדול של וקטור BAC (איור 2A), זה חיוני להשתמש כמויות גדולות יותר של וקטור ולהוסיף מאשר הטיות באמצעות פלמידים קונבנציונליים כדי להגביר את היעילות לעשות. שינוי 50 μl של E. coli DH10B electrocompetent מוסמכת תאים עם 2 μl של תגובת הקשר (שלב 1.3.5) על ידי אלקטרופורציה (25 μf קיבוליות, 2.5 kV, ו 100 Ω ההתנגדות), באמצעות כימיקלים אלקטרופורציה מצויד במרווחים אלקטרודות במרווחי זמן של 0.2 ס מ, בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים. העבר את התאים לצינור פוליפרופילן עם 1 מ ל של SOC בינוני (2% טריטונים, 0.5% שמרים לחלץ, 0.05% הנאגל, 2.5 mM ליטר, 10 מ”מ MgCl2, 10 מ”מ Mgcl4, 20 מ”מ גלוקוז [pH 7.0]) ו דגירה אותם ב 37 ° c עבור 1 h עם טלטול עדין (200-250 rpm). לוחית את התאים על ציר לוריא (LB) אגר צלחות המכילות 12.5 μg/mL כלוראמאנרול ו-דגירה אותם ב 37 ° c עבור 16 h. לקחת 8 כדי 12 מושבות חיידקי, לעשות העתק על הלוח ליברות מחדש אגר המכיל 12.5 μg/mL כלוראמאנסול, ולבדוק אם הם מכילים את ההוספה הנכונה על-ידי ניתוח ה-PCR הישיר באמצעות שימוש ספציפי באמצעות מחלת האנליונואודים. בחר מושבה חיובית מלוחית העותק המשוכפל, לגדל אותו ב 100 mL של LB המכיל 12.5 μg/mL של כchloramphenicol, לבודד את BAC cDNA על ידי השיטה לפירוק אלקליין באמצעות ערכת midi מסחרי באמצע, בעקבות ההמלצה לטיהור של גדול פלמידים בעלי העתקים נמוכים (ראו טבלת חומרים).הערה: BAC cDNA שהוכנו על ידי שיטה זו יכול להיות מזוהם עם עד 30% של DNA גנומית חיידקי, אבל זה מתאים באיכות לבצע ניתוח הגבלה, רצף, ושיבוט. בהתאם לגודל BAC, תשואות של 4-6 μg של הפלמיד BAC ניתן להשיג. ודא את השלמות הגנטית של cDNA משוכפל על ידי ניתוח הגבלה. לעכל 500 ng של pBAC-Z1 באמצע עם עולה I ו Pbac אני ב 37 ° צ’ עבור 1 h ולאשר את הנוכחות של הרסיס Z1 על ידי ג’ל אלקטרופורזה. כדי לוודא עוד כי מוטציות בלתי רצויות לא הוצגו, רצף את ההכנסה עם מחלת האוליונואודים ספציפיים. החל מהפלסטלינה pBAC-Z1 המכיל את אתרי ההגבלה שנבחרו (Pbac אני, Afe I, BstB אני, ו Mlu I), שיבוט ברציפות שברי Z2 כדי Z4 כדי להפיק את באורך מלא מדבקת cDNA שיבוט pBAC-ZIKV (איור 2B), בעקבות ניסיוני דומה גישות כמתואר לעיל עבור קטע Z1 (שלבים 1.3.1-1.3.10). 2. הכנת pBAC הטוהר הגבוהה-ZIKV להצלת rZIKV זיהומיות הערה: הכנת הקנה מידה גדול של שיבוט זיהומיות באולטרסאונד pBAC-ZIKV, מתאים לטיהור והצלה של וירוסים זיהומיות, מבוצעת על ידי הליזה אלקליין עם ערכת מסחרית שפותחה במיוחד עבור הטיהור BAC (לראות את השולחן של חומרים). הערכה חייבת לכלול את מערכת העיכול התלויה ב-ATP, אשר מסירה את זיהום ה-DNA חיידקי גנומית, המאפשר בידוד של BAC cDNA עם כיתה של טוהר דומה לזה שהושג עם שיטת צסיום כלוריד. לגדל מושבה אחת של E. coli DH10B נשיאת pbac-zikv שיבוט זיהומיות 5 מ ל ליברות בינונית המכילה 12.5 μg/mL של כלוראמאנסול ב 37 ° c עבור 8 h עם טלטול עדין (200-250 rpm). הוסף 1 מ ל של התרבות החיידקית (שלב 2.1) כדי 500 mL של LB עם 12.5 μg/mL של ככלורמפניקול 2 L בקבוקון ולגדול את התאים ב 37 ° c עבור 14-16 h (עד OD600 של 0.6-0.8).הערה: עשיר broths, כגון ציר מצוין (TB), יכול לייצר צפיפות תאים גבוהה מאוד, וכתוצאה מכך תשואה נמוכה יותר טוהר פחות של BAC cDNA. לטהר את השכפול מדבקת cDNA שיבוט על ידי הליזה אלקליין באמצעות ערכת מסחרית שפותחה במיוחד עבור הטיהור BAC, בעקבות מפרטים של היצרן (לראות את הטבלה של חומרים). שמרו על הטוהר הטהור ב -4 ° c. בהתאם לגודל BAC, תשואות של 30 μg של שיבוט bac באלקטרופורזה cdna ניתן להשיג.הערה: אל תייבש את הגלולה DNA עבור יותר מ 5 דקות, כמו ייבוש יתר יהיה קשה לפזר את BAC cDNA. בשל הגודל הגדול של שיבוט BAC cDNA, להימנע vortexing או ליטוף כדי למנוע הטיה פלמיד. 3. הצלה של rZIKV זיהומיות מתוך שיבוט BAC cDNA על ידי העברה של בתאי ברו הערה: RZIKV זיהומיות הוא התאושש על ידי מעבר החצייה של התאים של ברו עם שיבוט pBAC-ZIKV cDNA, באמצעות מסחרי העברה מסחריים השומנים מגיב (לראות את הטבלה של חומרים; איור 3). יום אחד לפני החצייה, צלחת על 6-צלחות לוחות 5 x 105 התאים של ברו/גם בינונית צמיחה (בינונית שונה של הנשר של מדיום [dmem] שיושלם עם 5% סרום בפרה העובר [fbs], 2 מ”מ L-גלוטמין, ו 1% חומצות אמינו לא חיוניות) ללא אנטיביוטיקה להעלות 90% מונואולאיירס תא קונקולארה בזמן ההעברה.הערה: אנו ממליצים לבצע את הווירוס מצילה בטריליטים. סרום בינוני-מופחת (לראות את הטבלה של חומרים) בטמפרטורת החדר ולהכין תערובות הזיהום בצינורות microfuge סטרילי עבור כל דגימת העברה כדלקמן. הוסף 4 μg של שיבוט BAC cDNA ב 250 μL של סרום-מופחת בינוני ולערבב בזהירות, הימנעות vortexing כדי למנוע הטיה פלביניים. בצינור נפרד, לדלל 12 μL של החצייה מגיב (1 מ”ג/mL) (לראות את הטבלה של חומרים) ב 250 μl של סרום מופחת בינוני, לערבב על ידי vortexing, ו דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות. לשלב את מדולל BAC cDNA ואת הזיהום מגיב (עם יחס 1:3 של דנ א: החצייה מגיב), לערבב בקפידה תוך הימנעות vortexing, ו דגירה בטמפרטורת החדר עבור 20-30 דקות. במהלך תקופת הדגירה של שחזור הגוף החדש של הקרן, לשטוף את התאים של ברו עם מדיום צמיחה ללא אנטיביוטיקה ולהשאיר את התאים ב 1 מ ל של מדיום טרי ללא אנטיביוטיקה.הערה: התוספת של אנטיביוטיקה במהלך תהליך החצייה עלולה להקטין את יעילות הטיפול בעור. הפץ dropwise 500 μL של התערובת הכימית BAC cDNA/transfection (שלב 3.2.3) אל התאים של ברו, לערבב אותם על ידי הנדנדה את הצלחת הלוך ושוב, ו מודקת את התאים בתוך 5% CO2 מחולל לחות בחממה ב 37 ° c עבור 6 h. הסר את בינוני ההתפתחות, להוסיף 2 מ ל של מדיום צמיחה טריים עם אנטיביוטיקה (100 U/mL פניצילין 100 μg/mL סטרפטומיצין), דגירה את התאים 5% CO2 מחולל חממה ב 37 ° c, ולבדוק כל יום על אינדוקציה של אפקט אפקט ציטופתי (cpe ).הערה: ZIKV CPE מבוטא למדי בתאי ברו והוא מאופיין על ידי נוכחות של תאים מעוגלים ושבירה כי לנתק ולצוף על התרבות הרקמה supernatant. לאסוף ali, 100 μL של הרקמה התאית של התאים של ברו-התרבות (שלב 3.5) כל 24 שעות כדי לקבוע את היעילות של שחזור וירוס על ידי הערכת נוכחות של ZIKV באמצעות שיטת הפלאק רגיל על התאים הטריים ברו (איור 4A). לאחר ארבעה עד שישה ימים של העברה, כאשר CPE הוא סביב 50%-75% (איור 4B), לאסוף את תרבות הרקמה סופרנטנים ב 15 מ ל שפופרות חרוט ו צנטריפוגה ב 2,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° צ’ כדי להסיר את הפסולת התאית. המסוק את הסופרנטנים המכילים rZIKV ולהשליך את כדורי התא. מחלק את סופרנטנט ב קריוצינוריות ולאחסן אותם ב-80 ° צ’ כדי לאשר עוד הנוכחות של rZIKV הצילה. 4. טיטור של התאושש rZIKV יום לפני titration, הזרע על 12-היטב צלחות 2.5 x 105 ברו תאים/גם בינונית צמיחה להעלות 90% התאים confluent מונולאיירס עד הזמן של טיטור.הערה: אנו ממליצים לנהל את הטיטור של השחזור המשוחזר בטריפליטים. להסיר את התמונה של supernatant מן המקפיא (שלב 3.8) ולהפוך מדלל 10 קיפול סדרתי בינונית צמיחה ללא FBS. לשטוף את התאים של ברו 2x עם מלוחים באגירה פוספט (PBS) ולהוסיף 200 μL/טוב של כל דילול וירוסים ב טרילקאט. לוחות מניחים ב 5% CO2 מחולל חממה ב 37 ° c ו רוק כל 15 דקות עבור 90 דקות ספיחה תקופה. הסר את האינויולים הנגיפי, שכבת-על התאים עם 2 מ ל של גידול בינוני המכיל 2% FBS, 1% DEAE-dextran, ו 0.6% אגר אצילי, ו דגירה ב 37 ° צ’ תחת 5% CO2 עבור 3-4 ימים.הערה: ניתן להשתמש agarose, מתילצלולוזה, או מדיית שכבת-על אחרת. הזמן להיווצרות הפלאק המתאים ישתנה בהתאם לכיסוי השימוש ולזן ZIKV. תקן את התאים הנגועים של ZIKV עם 1 mL/טוב של 4% פורמלדהיד מדולל PBS בטמפרטורת החדר עבור 1 h, להסיר את הכיסוי, ולהמחיש את הפלאק נגיפי ידי להכתים אותם עם 0.1% קריסטל סגול ב 20% מתנול בטמפרטורת החדר עבור 15 דקות. להיפטר גביש סגול, לשטוף את 3x עם מים, לאפשר לוחיות להתייבש, ובאופן ידני לספור את הפלאק (איור 4C, הלוח השמאלי). סיכוייו ויראלי מחושב כיחידות להרכיב מיליליטר (pfu/ml). לחילופין, שלטים ויראליות יכולים להיות מגובטים על ידי הנגיף החיסוני עם הפאן-flavivirus E חלבון העכבר המונבטיים נוגדן (mAb) 4G2 (איור 4C, הלוח הימני). כדי להעריך את שלטי ZIKV על ידי מכתים חיסוני, לאחר תיקון והסרה של שכבת הכיסוי כמתואר לעיל (בשלב 4.5), לשטוף את התאים 2x עם PBS ו החדירות אותם על ידי דגירה עם 200 μL/טוב של 0.5% טריטון-X100 ב PBS עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הפתרון החדיר, לשטוף את התאים 3x עם PBS, ולחסום אותם עם 200 μL/טוב של פתרון חסימה (10% FBS ב PBS) עבור 1 h בטמפרטורת החדר.הערה: ניתן להשתמש בשלב זה בפתרונות חסימה סטנדרטיים אחרים (לדוגמה, 2.5% BSA ב-PBS). להסיר את הפתרון חוסם ו מודלת את התאים עם 200 μL/הבאר של הפאן-flavivirus E חלבון mAb 4G2 מדולל בפתרון חסימה (1 μg/mL) עבור 1 h ב 37 ° c.הערה: ניתן להשתמש בנוגדנים מסוגי mAb או פוליבטיים אחרים (pAb) במקום 4G2 לצורך כתמים וזיהוי של שלטים ויראליים. לשטוף את התאים 3x עם PBS, ו מודלת אותם עם 200 μL של הנוגדן ביולוגי נגד העכבר משנית מדולל (בעקבות המלצת היצרן) בפתרון חסימה עבור 1 h ב 37 ° c. להסיר את הנוגדן המשני, לשטוף את התאים 4x עם PBS, ולהמחיש את הפלאק ויראלי באמצעות מבוססי avidin/biotin מבוסס peroxidase kit בעקבות מפרטי היצרן (לראות את הטבלה של חומרים). 5. אישור הצלה מוצלחת הערה: כדי לאשר עוד את זהותו של וירוס שחולצו, הביטוי החלבון ZIKV E מנותח על ידי immunofluorescence באמצעות העכבר mAb 1176-56 ספציפי לחלבון ZIKV E (איור 4D). MAb זה הוא ספציפי עבור חלבון ZIKV E, בניגוד למצב הפאן-flavivirus E חלבון mAb 4G2 (שלב 4.6.3). לחילופין, ניתן לאשר את זהות הוירוס ברצף. יום לפני ניתוח מאימונוoforסנס, שמיכות זרעים ב 24-הצלחות לוחיות המכילות 1 x 105 תאים ברו/גם בינונית צמיחה להעלות 90% התאים confluent מונולאיירס עד הזמן של זיהום. לשטוף את התאים 2x עם PBS ולהדביק אותם עם ריבוי של זיהום (מוי) של 0.5 PFU/תא של וירוס שחולצו בינונית צמיחה ללא FBS (100 μL/טוב) ב טרילקאט. מודקון את הצלחות ב 37 ° c עבור 90 דקות. לאחר adsorption ויראלי, להסיר את האינוינה ויראלי, להוסיף 0.5 mL של בינוני גדילה טריים עם 2% FBS, ו דגירה את התאים של 5% CO2 מחולל חממה ב 37 ° c עבור 48 h. הסר את התרבות רקמה supernatant, לתקן את התאים עם 150 μL/טוב של 4% פאראפורמלדהיד ב-PBS עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר, והחדיר התאים עם 150 μL/טוב של 0.5% טריטון-X100 ב PBS עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת הפתרון החדירות ושטיפת התאים 3x עם PBS, לחסום את התאים עם 150 μL/היטב של פתרון חסימה במהלך 1 h בטמפרטורת החדר.הערה: סריקת התא תיחסם עם פתרונות חסימה חלופית (לדוגמה, 2.5% BSA ב-PBS). להסיר את הפתרון חסימה מודלת את התאים עם 100 μL/טוב של mAb 1176-56, ספציפי עבור חלבון ZIKV E, מדולל בפתרון חסימה (1 μg/mL) עבור 1 h ב 37 ° c. לשטוף את התאים 3x עם PBS, דגירה אותם בטמפרטורת החדר עבור 1 h עם 100 μL/ובכן של אלקסה Fluor 488-מצומת אנטי עכבר משני הנוגדן מדולל (בעקבות המלצת היצרן) בפתרון חסימה, לשטוף את התאים בהרחבה עם PBS, ו דגירה אותם עם 150 μL/טוב של 4, 6 ‘-diamidino-2-פניינילידול (DAPI; 1 מ”ג/mL) מדולל 1:200 ב PBS בטמפרטורת החדר עבור 10 דקות. לשטוף את התאים 3x עם PBS, הר שמיכות על מדיום הרכבה אנטי לדעוך (לראות את הטבלה של חומרים), ולנתח את הדגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית.הערה: לאחסון לטווח ארוך, יש לאחסן דגימות ב -4 ° c, מוגן מפני אור. 6. הגברה והדור של מניות ויראליות הערה: לאחר הזהות של וירוס שחולצו הוא אישר (סעיף 5), להגביר את הווירוס על התאים ברו וליצור מניות ויראלי למחקרים נוספים. לגדול תאים ברו ב 100 מ”מ x 21 לוחות מ”מ ב 90% המפגש ולהדביק אותם עם משרד הבין של 0.1 PFU/תא כפי שמתואר לפני. כאשר CPE הוא סביב 75% (כ 48-72 h הדלקת הפוסט), לאסוף את התרבות הרקמה supernatant בצינור הצינורות של ה50 mL ו צנטריפוגה ב 2,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° צ’ כדי להסיר את הפסולת התאית. לקצור את הסופרמננט המכיל rZIKV ולמחוק את הגלולה התא. מחלקים את הסופרנטנט בקריוצינוריות ומאחסנים אותם ב-80 ° c. להסיר מקפיא וירוס מהמקפיא ולקבוע את סיכוייו נגיפי על ידי שיטת הפלאק כפי שמתואר לפני (סעיף 4).

Representative Results

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר את הדור של מלאה ZIKV באורך מלא cDNA שיבוטים זיהומיות באמצעות BAC כדי למזער את בעיות רעילות הקשורים ברצפים מספר flaviviral. התאוששות יעילה של rZIKV זיהומיות מ-BAC cDNA שיבוט ניתן להשיג בקלות לאחר הזיהום של תאים ברו הרגיש (איור 2). באמצעות פרוטוקול זה, יצרנו יציבה באורך מלא cDNA שיבוט של הזנים ZIKV RGN32 על ידי שיבוט ברציפות ארבעה שברי ה-dna חופפים לתוך הפלpBeloBAC11 BAC באמצע ה34 באמצעות שיטות שיבוט קונבנציונלי ייחודי אתרי הגבלה נוכח הגנום הנגיפי (איור 2). שיבוט cDNA באורך מלא היה מוקף 5 ‘-end על ידי היזם CDNA האדם כדי לאפשר את הביטוי של vRNA בגרעין של תאים מזוהמים, ו ב 3 ‘-end על-ידי HDV RZ ואחריו BGH הפוליצילציה ורצפי הפסקת, כדי לייצר Rz המכיל המדויק 3 ‘-סוף של הגנום הנגיפי (איור 2). היציבות של חיידקים של שיבוט BAC cDNA שנוצר, יחד עם מניפולציה קלה שלה באמצעות תקן רקומביננטי DNA טכנולוגיות, מדגיש את הפוטנציאל של הגישה לcdna BAC עבור הדור המהיר והאמין של יציבה באורך מלא cDNA שיבוטים של ZIKV ווירוסים אחרים או שנתקע חיובי RNA וירוסים עם genomes ויראלי יציב. לאחר BAC cdna שיבוט הורכב (איור 2), וירוס זיהומיות יכול להיות התאושש בקלות לאחר מעבר ישיר של התאים הרגישים ברו עם שיבוט BAC cdna באמצעות ליפוזומים משקל(איור 3). זה cDNA-השיקה מערכת אפשרה את הביטוי התאיים של הכתיר Vrna, המאפשר התאוששות של וירוסים זיהומיות ללא צורך בצעד שעתוק מבחנה. באמצעות גישה זו, הצלחנו להציל את rzikv-rgn עם מגדל גבוה יותר 106 pfu/mL ב 5 ימים מעבר לזיהום (איור 4a). בנוסף, וירוס שחולצו המושרה CPE ברור (איור 4B), שנוצר לוחיות הומוגנית של כ 2 מ”מ בגודל (איור 4b), והזהות שלה אושרה על ידי רצף (נתונים לא מוצגים) ו מimmunofluorescence ניתוח באמצעות ספציפי mab לחלבון ZIKV E, 1176-56 (איור 4D). בנתונים חוץ גופית עולה כי rZIKV התאושש-RGN משוכפל ביעילות בתאי ברו ולרמות לעומת ZIKV בידוד טבעי32 (נתונים לא מוצגים). בסך הכל, תוצאות אלה מוכיחים כי rZIKV זיהומיות ניתן להציל מן באורך מלא cDNA שיבוטים התאספו ב BAC. איור 1 : ארגון הגנום Zikv ומבנה הויריאון. (א) הגנום הארגון: zikv מכיל חיובי אחד תקוע-RNA כי הוא מתורגם כמו פוליפרוטאין יחיד. פוליפרוטאין מתורגם היה ביקע על ידי נגיפי (חיצים) ומארח (יהלומים) הפרוטסים לייצר חלבונים מבניים capsid (C, כחול), מטריצה (M, חום), ו לעטוף (E, ירוק), ושבעה חלבונים לא מבניים (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, ו NS5). The 5 ‘ ו 3 ‘ אזורים לא מתורגם (UTRs) בסוף הגנום הנגיפי מסומנים קווים שחורים. (ב) מבנה הוירימטר: zikv הרימונים היו מעוטרים עם חלבונים E ו-M, מעוגן ביליפיד עם מבנה דומה של איסאודרהישור. תחת לעטוף ויראלי היה נוקלאואוקאפסיד ויראלי מורכב חלבון C המשויך RNA גנומית ויראלי. דמות זו הותאמה מ Ávila-פרז et al.18. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2 : הרכבה של ZIKV באורך מלא מדבקת cDNA שיבוט ב-BAC. (א) ייצוג סכמטי של pBeloBAC11 BAC: הגנים הרגולטורים פארה, parb, פארק, ו repe,מקור שכפול F-factor (וריס), הגנים ככלורמפניקול עמידים (Cmr), ו- lac גן Z מצוין. אתרי ההגבלה הרלוונטיים ששימשו להרכבת השכפול הזיהומיות של ZIKV cDNA מסומנים בקו תחתון. (ב) הרכבה של zikv באורך מלא מדבקת cdna שיבוט לתוך pBeloBAC11 BAC: ארבעה שברי ה-dna חופפים (Z1-Z4), כיסוי הגנום zikv כולו (איור 1) ומוקף באתרי ההגבלה המצוין, נוצרו על ידי כימיים סינתזה ברצף שוכפל לתוך pBeloBAC11 כדי ליצור את מדבקת ZIKV cDNA שיבוט pBAC-ZIKV. באורך מלא zikv זיהומיות cdna היה מורכב תחת השליטה של cytomegalovirus ירוס האדם מיידית מוקדם היזם (cdna) ומקיפים את 3 ‘-end על ידי ה-HDV ריבוזים (rz) ואת הורמון גדילה הפרה (bgh) סיום ורצפים פוליאדלציה. ראשי התיבות של הגנים הנגיליים ורכיבי הרגולציה הם כמתואר באיור 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3 : זרימת עבודה כדי ליצור rZIKV מ שיבוט BAC cDNA. התאים של ברו ב 90% של המפגש היו מצוידים במונאולייר עם ZIKV באורך מלא מדבקת cDNA שיבוט pBAC-ZIKV (איור 2) באמצעות ליפוזומים מזיקים. בשנת 4-6 ימים, כאשר CPE היה ברור, רקמות העור סופר המכילים rZIKV נאספו והוערך עבור נוכחות של וירוס (איור 4) ומשמש הגברה ויראלי בתאי ברו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 4 : שחזור ואפיון מבחנה של rZIKV. (א) הצלה של rZIKV זיהומיות מ-BAC cdna שיבוט: התאים ברו ב 90% של המפגש (6-ובכן תבנית צלחת, טריליטים) היו מבוים או מנוכר עם 4 μg/טוב של pbac-zikv (איור 3), ועל הימים המצוין החוצה הזיהום, מגדל וירוס ברקמת התרבות הסופר נקבע על ידי שיטת הפלאק (pfu/mL). קווי השגיאה מצביעים על סטיות סטנדרטיות מתוך שלושה ניסיונות שונים של מעבר החצייה. הקו השחור המנוקד מציין את מגבלת הזיהוי (50 PFU/mL). (ב) ויראלי cpe: התאים ברו ב 90% זרימה (6-הצלחת בפורמט, מטריליטים) היו מבוים נגועים (למעלה) או נגוע (המשרד הראשי של 0.5 pfu/תא) עם rZIKV, ו ב 48 h הזיהום, נוכחות של cpe הוערך על ידי מיקרוסקופ אור. קנה מידה ברים = 100 μm. (ג) רובד נגיפי שיטת ההדבקה: התאים הורו בשעה 90% זרימה (12-הצלחת בפורמט) נדבקו rZIKV, ו ב 72 h לאחר מכן, שלטים ויראלי היו דמיינו על ידי כתמים גביש סגול (משמאל) או על ידי כתמים חיסוני ( ימין) באמצעות הפאן-פליווירוס E-החלבון האלקטרוני mAb 4G2. קנה מידה ברים = 5 מ”מ. (ד) immunofluorescence: התאים הורו ב 90% המפגש (24-הצלחת בפורמט, מטריליטים) נדבקו (ממוי של 0.5 pfu/תא) עם rZIKV ו, בשנת 48 h הזיהום, שנותחו על ידי immunofluorescence באמצעות mab 1176-56, ספציפי . חלבון אי גרעיני התא היו מוכתמים באמצעות DAPI. התמונה הממוזגת מייצגת של תאים של הנגועים ZIKV מוצג. הריבוע הלבן בחלק העליון של הימנית מייצג תמונה מוגדלת של תאים של הנגועים ZIKV. קנה מידה ברים = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

מדבקת cDNA שיבוטים מהווים כלי מולקולרי חיוניים עבור מחקר בסיסי של וירוסים RNA ופיתוח של חיסונים ו/או זיהוי של אסטרטגיות אנטי ויראליות. עם זאת, עבור רבים וירוסים בעלי-RNA שנתקעו הרבה, כולל flaviviruses, הדור של המשובטים מדבקת cDNA הם קשים בשל חוסר היציבות של cDNAs משוכפל כאשר מופץ חיידקים באמצעות תקן גבוהה העתק מספר פלמידים. במקרה של zikv ווירוסים אחרים, אי-יציבות זו היא בעיקר בשל הביטוי הדולף של חלבונים ויראלי רעילים מיזמים בקטריות מסתורית להציג את הגנום הנגיפי14,15,16,17 . כאן, אנו מתארים פרוטוקול חלופי ורב עוצמה כדי ליצור באורך מלא של ZIKV מדבקת cDNA שיבוט מידבקת כמו פלבאמצע בודד, מבוסס על השימוש של pBeloBAC11 באמצע BAC34 (איור 2a) כדי להתגבר על בעיית רעילות, השימוש של היזם CMV כדי לאפשר את הביטוי של vRNA בגרעין של תאים מזוהמים, ואת HDV RZ לייצר Vrna עם 3 ‘-קצוות מדויקים (איור 2B). באמצעות שיטה זו, יצרנו בהצלחה שיבוט מדבקת לחלוטין יציבה של הזנים ZIKV המאפשר התאוששות יעילה ואמינה של rZIKV זיהומיות לאחר הגלגול הישיר של תאים ברו רגיש (איור 3 ו איור 4).

מאמץ עצום נעשה בשנים האחרונות כדי להתגבר על בעיות אי-יציבות הקשורים במשובטים ZIKV זיהומיות cDNA, ומספר גישות יושמו בהצלחה18, כולל הארכה מחוץ לבית של שברי cdna24 ,25, נמוך העתק פלמידים19,20, הפעלה של היזמים בקטריות מסתורית על ידי הקדמה של מוטציות שקטות26,27, איון הכניסה21, מיכל בן 22 , 23, שיטת הייצור של הגיבסון30, שיטת ISA28,29, והשימוש cper31. למרות גישות אלה להתגבר על בעיית רעילות והם שימושיים כדי ליצור ZIKV מדבקת cDNA שיבוטים, כמה מהם הם מפרך ולהציג כמה חסרונות, כולל את הצורך בתהליך הפריה חוץ גופית ושעתוק להפחית וירוס יעילות ההחלמה או הקדמה של מספר גבוה של מוטציות שקטות להפעיל יזם בקטריאלי מסתורית שיכול להשפיע על כושר נגיפי, בין היתר. הגישה המתוארת בפרוטוקול זה מציגה את היתרונות הבאים. i) ה-pBeloBAC11 בינוני של BAC34 יש שכפול מבוקרת לחלוטין, שמירה על אחד או שניים עותקים של פלביניים לכל תא, אשר ממזער את הרעילות ומאפשר תחזוקה יציבה חיידקים של מיצב cdnas. ii) ההפצה והשינוי של הפלמידים של BAC הם דומים כמעט לאלה של פלמידים קונבנציונליים, בהתחשב בשינויים הקלים המתוארים בפרוטוקול זה כדי לתמרן שברי בגודל גדול של ה-DNA ו-העתקה מפלסטיק נמוך. במיוחד, שיבוט BAC cdna יכול להיות שונה לתוך E. coli על ידי שילוב הומוולוגי באמצעות מערכת רקומבינציה אדום42,43,44. iii) השימוש ב-cdna יזם מאפשר ל ביטוי תאיים של הכתיר ZIKV vRNA ואת ההתאוששות של וירוסים זיהומיות ללא צורך בתהליך שעתוק מבחנה. iv) rZIKV זיהומיות נוצר לאחר הזיהום הישיר של תאים רגישים (למשל, ברו) עם שיבוט BAC cDNA. מאחר שיצירת דנ א בתאי היונקים יעילה יותר מאשר העברה של RNA, יעילות השחזור של הנגיף עם הגישה BAC גבוהה יותר מאשר נצפתה באמצעות תעתיקים של RNA, הפחתת מספר המעברים בתאי התרבות כדי ליצור מניות ויראליות, כתוצאה מכך, הגבלת המבוא של מוטציות לא רצויות על ידי הסתגלות לתרבות התא.

בסופו של דבר, הפוטנציאל של הגישה BAC הוא נתמך על ידי שימוש מוצלח של שיטה זו (עם שינויים קלים) כדי להנדס מדבקת cdna שיבוטים של מכונות אחרות וירוסים, כולל וירוס דנגה36, ווירוסים מספר של השפעה גבוהה ב בריאות האדם ובעלי חיים, כגון דבקות מערכת העיכול37 (גב), צפקת וירוס זיהומיות38 (fipv), האדם coavirus OC4339 (hcov-OC43), חמור תסמונת הנשימה חמורה וירוס40 (סארס-cov), ותסמונת הנשימה של המזרח התיכוןמ41 (מרס-cov), בין היתר.

בפרוטוקול המתואר כאן, קיימים שני שלבים קריטיים שיש לשקול. אחד השיקול החשוב הוא לזהות אתרי הגבלה ייחודי מתאים הגנום הנגיפי כי נעדרים בתוך הפלביניים BAC. אם לא קיימים אתרי הגבלה מספיקים, ניתן ליצור אתרי הגבלה חדשים במהלך עיצוב השכפול על-ידי הכנסת מוטציות של נוקלאוטיד שקט. עוד בעיה חשובה היא כי הפלמידים BAC מופיע רק אחד או שניים עותקים לכל תא, ולכן, תשואות נמוכות של BAC פלאמידים עם זיהום גבוה של DNA גנומית חיידקי מתקבלים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים המיועדים גבוהה-ו . מספר העתקים בינוניים זו בעיה פוטנציאלית היא להתגבר בקלות באמצעות כרכים התרבות גדול לטהר את הפלמיד BAC עם ערכת מסחרית שפותחה במיוחד עבור הטיהור BAC.

לסיכום, פיתחנו שיטה רבת עוצמה גנטית הפוכה המבוססת על שימוש ב-BAC שיכול להיות מותאם כדי ליצור יציב ופונקציונלי במלואו cDNA שיבוטים של וירוסי RNA אחרים וירוסים חיוביים להקל על המחקר של הביולוגיה של אלה וירוסים ופיתוח חיסונים ו/או כדי להקל על זיהוי תרופות אנטי-ויראליות.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות קארלה Gómez עבור הסיוע הטכני שלה ב-BAC cDNA הדור שיבוט ו Snezhana דימיברובה לעזור עם הכנת וידאו. עבודה זו היתה נתמכת בחלק על ידי מענקים מהמשרד הספרדי של הכלכלה והתחרותיות (MINECO, גרנט מספר BFU2016-79127-R) ל F.A.T. והמכון הלאומי לבריאות (NIH, גרנט מספר 1R21AI120500) ל L.M.S. ו F.A.T.

Materials

1. Molecular Biology Reagents
Afe I New England BioLabs R0652S 10,000 units/mL
AmpliTaq DNA Polymerase ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) N8080161 5,000 Units/mL
ApaL I New England BioLabs R0507S 10,000 units/mL
Asc I New England BioLabs R0558S 10,000 units/mL
BamH I New England BioLabs R0136S 10,000 units/mL
BstB I New England BioLabs R0519S 20,000 units/mL
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
ElectroMAX DH10B Cells  ThermoFisher Scientific (Invitrogen) 18290015 Electocompetent DH10B cells
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm Bio-Rad 165-2086
Ethanol Merck 100983 Flamable
Isopropanol Merck 109634 Flamable
Large-Construct Kit (10) QIAGEN 12462 For high-purity BAC preparation
LB Broth ThermoFisher Scientific (Invitrogen) 12780029 Can be homemade as well
LB with Agar ThermoFisher Scientific (Invitrogen) 22700041 Can be homemade as well
Methanol Merck 106009 Flamable
Mlu I New England BioLabs R0198S 10,000 units/mL
Oligonucleotides IDT N/A
Plasmid pBeloBAC11 New England BioLabs ER2420S (E4154S)
Plasmid Midi Kit (25) QIAGEN 12143 For midle-scale preparation of BAC plasmids
Pml I New England BioLabs R0532S 20,000 units/mL
Polypropylene tubes (10 mL) DeltaLab 175724 Other commercial sources are acceptable
QIAEX II Gel Extraction Kit (150) QIAGEN 20021 Gel-clean-up kit optimized for DNA fragments larger than 10 kb
Shrimp AlKaline Phosphatase (rSAP) New England BioLabs M0371S 1,000 units/mL
SOC Medium ThermoFisher Scientific (Invitrogen) 15544034 Can be homemade as well
Synthesis of cDNA fragments Bio Basic N/A
T4 DNA Ligase Sigma-Aldrich (Roche) 10481220001 1,000 units/mL
2. Cell Culture Reagents
6-Well Plates ThermoFisher Scientific (Nunc) 140675
12-Well Plates ThermoFisher Scientific (Nunc) 150628
24-Well Plates ThermoFisher Scientific (Nunc) 142485
Agar Noble VWR 214230
Alexa Fluor 488 Conjugate ant-mouse secondary antibody Varies N/A
Biotinylated Anti-Mouse Secondary Antibody Varies N/A
Cell Culture Dishes (100×21 mm) ThermoFisher Scientific (Nunc) 172931
Conical Tubes (15 mL) VWR 525-0150
Conical Tubes (50 mL) VWR 525-0155
Crystal Violet Sigma-Aldrich C6158
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Toxic and carcinogenic
DEAE-Dextran Sigma-Aldrich D9885
DMEM ThermoFisher Scientific (Gibco) 11995065
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher Scientific (HyClone)) SV30160.03
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Toxic and carcinogenic
L-Glutamine ThermoFisher Scientific (Gibco) 25030081
Lipofectamine 2000 ThermoFisher Scientific (Invitrogen) 11668019 Transfection reagent
Nonessential amino acids ThermoFisher Scientific (Gibco) 11140035
Opti-MEM I Reduced Serum Medium ThermoFisher Scientific (Gibco) 31985070 Transfection medium
Pan-flavivirus E protein mAb 4G2 BEI Resources NR-50327
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710-S Toxic and carcinogenic
PBS ThermoFisher Scientific (Gibco) 14190144
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher Scientific (Gibco) 15140122
ProLong Gold Antifade Reagent ThermoFisher Scientific (Invitrogen) P10144
Triton-X-100 Sigma-Aldrich T8787
Vectastain ABC Kit Vector Laboratories Inc PK-4010 Avidin/biotin-based peroxidase kit
Vero Cells ATCC CCL-81
ZIKV E Protein mAb 1176-56 BioFront Technologies BF-1176-56
3. Equipment
Agarose Gel Electrophoresis System Bio-Rad 1704468 Other commercial sources are acceptable
Class II Biosafety CO2 Cabinet Varies N/A Other commercial sources are acceptable
Desktop Refrigrated Centrifuge Varies N/A
Fluorescence Microscope Varies N/A
High-Speed Refrigrated Centrifuge Varies N/A
MicroPulser Electroporator Bio-Rad 1652100 Other machines are acceptable
SimpliAmp Thermal Cycler ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) A24811 Other machines are acceptable
Vortexer Varies N/A
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Friedrich, M. J. WHO Calls Off Global Zika Emergency. JAMA. 317 (3), 246 (2017).
  2. Sirohi, D., et al. The 3.8 Å resolution cryo-EM structure of Zika virus. Science. 352 (6284), 467-470 (2016).
  3. Lindenbach, B. D., Murray, C. J., Thiel, H. J., Rice, C. M., Knipe, D. M., Howley, P. M. Flaviviridae. Fields Virology. , 712-748 (2013).
  4. Boeuf, P., Drummer, H. E., Richards, J. S., Scoullar, M. J., Beeson, J. G. The global threat of Zika virus to pregnancy: epidemiology, clinical perspectives, mechanisms, and impact. BMC Medicine. 14 (1), 112 (2016).
  5. Simpson, D. I. Zika virus infection in man. Transactions of The Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
  6. Campos, G. S., Bandeira, A. C., Sardi, S. I. Zika Virus Outbreak, Bahia, Brazil. Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1885-1886 (2015).
  7. Cao-Lormeau, V. M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
  8. Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: Early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
  9. Costello, A., et al. Defining the syndrome associated with congenital Zika virus infection. Bulletin of the World Health Organization. 94 (6), 406-406A (2016).
  10. Cugola, F. R., et al. The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature. 534 (7606), 267-271 (2016).
  11. do Rosario, M. S., et al. Guillain-Barre Syndrome After Zika Virus Infection in Brazil. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 95 (5), 1157-1160 (2016).
  12. Miner, J. J., et al. Zika Virus Infection during Pregnancy in Mice Causes Placental Damage and Fetal Demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
  13. Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. The New England Journal of Medicine. 374 (10), 951-958 (2016).
  14. Li, D., Aaskov, J., Lott, W. B. Identification of a cryptic prokaryotic promoter within the cDNA encoding the 5′ end of dengue virus RNA genome. PLOS ONE. 6 (3), e18197 (2011).
  15. Aubry, F., Nougairede, A., Gould, E. A., de Lamballerie, X. Flavivirus reverse genetic systems, construction techniques and applications: a historical perspective. Antiviral Research. 114, 67-85 (2015).
  16. Pu, S. Y., et al. Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes. Journal of Virology. 85 (6), 2927-2941 (2011).
  17. Ruggli, N., Rice, C. M. Functional cDNA clones of the Flaviviridae: strategies and applications. Advances in Virus Research. 53, 183-207 (1999).
  18. Avila-Perez, G., Nogales, A., Martin, V., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. Reverse Genetic Approaches for the Generation of Recombinant Zika Virus. Viruses. 10 (11), (2018).
  19. Annamalai, A. S., et al. Zika Virus Encoding Nonglycosylated Envelope Protein Is Attenuated and Defective in Neuroinvasion. Journal of Virology. 91 (23), (2017).
  20. Shan, C., et al. An Infectious cDNA Clone of Zika Virus to Study Viral Virulence Mosquito Transmission, and Antiviral Inhibitors. Cell Host & Microbe. 19 (6), 891-900 (2016).
  21. Liu, Z. Y., et al. Characterization of cis-Acting RNA Elements of Zika Virus by Using a Self-Splicing Ribozyme-Dependent Infectious Clone. Journal of Virology. 91 (21), (2017).
  22. Schwarz, M. C., et al. Rescue of the 1947 Zika Virus Prototype Strain with a Cytomegalovirus Promoter-Driven cDNA Clone. mSphere. 1 (5), (2016).
  23. Tsetsarkin, K. A., et al. A Full-Length Infectious cDNA Clone of Zika Virus from the 2015 Epidemic in Brazil as a Genetic Platform for Studies of Virus-Host Interactions and Vaccine Development. MBio. 7 (4), (2016).
  24. Deng, C. L., et al. Recovery of the Zika virus through an in vitro ligation approach. Journal of General Virology. 98 (7), 1739-1743 (2017).
  25. Widman, D. G., et al. A Reverse Genetics Platform That Spans the Zika Virus Family Tree. mBio. 8 (2), (2017).
  26. Munster, M., et al. A Reverse Genetics System for Zika Virus Based on a Simple Molecular Cloning Strategy. Viruses. 10 (7), (2018).
  27. Zhao, F., et al. Negligible contribution of M2634V substitution to ZIKV pathogenesis in AG6 mice revealed by a bacterial promoter activity reduced infectious clone. Scientific Reports. 8 (1), 10491 (2018).
  28. Atieh, T., Baronti, C., de Lamballerie, X., Nougairede, A. Simple reverse genetics systems for Asian and African Zika viruses. Scientific Reports. 6, 39384 (2016).
  29. Gadea, G., et al. A robust method for the rapid generation of recombinant Zika virus expressing the GFP reporter gene. Virology. 497 (Supplement C), 157-162 (2016).
  30. Weger-Lucarelli, J., et al. Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone. Journal of Virology. 91 (1), (2017).
  31. Setoh, Y. X., et al. De Novo Generation and Characterization of New Zika Virus Isolate Using Sequence Data from a Microcephaly Case. mSphere. 2 (3), (2017).
  32. Marquez-Jurado, S., et al. An Alanine-to-Valine Substitution in the Residue 175 of Zika Virus NS2A Protein Affects Viral RNA Synthesis and Attenuates the Virus In Vivo. Viruses. 10 (10), (2018).
  33. Cheng, B. Y. H., Ortiz-Riaño, E., de la Torre, J. C., Martínez-Sobrido, L. Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  34. Wang, K., Boysen, C., Shizuya, H., Simon, M. I., Hood, L. Complete nucleotide sequence of two generations of a bacterial artificial chromosome cloning vector. BioTechniques. 23 (6), 992-994 (1997).
  35. Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (18), 8794-8797 (1992).
  36. Usme-Ciro, J. A., Lopera, J. A., Enjuanes, L., Almazan, F., Gallego-Gomez, J. C. Development of a novel DNA-launched dengue virus type 2 infectious clone assembled in a bacterial artificial chromosome. Virus Research. 180, 12-22 (2014).
  37. Almazan, F., et al. Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5516-5521 (2000).
  38. Balint, A., et al. Molecular characterization of feline infectious peritonitis virus strain DF-2 and studies of the role of ORF3abc in viral cell tropism. Journal of Virology. 86 (11), 6258-6267 (2012).
  39. St-Jean, J. R., et al. Recovery of a neurovirulent human coronavirus OC43 from an infectious cDNA clone. Journal of Virology. 80 (7), 3670-3674 (2006).
  40. Almazan, F., et al. Construction of a severe acute respiratory syndrome coronavirus infectious cDNA clone and a replicon to study coronavirus RNA synthesis. Journal of Virology. 80 (21), 10900-10906 (2006).
  41. Almazan, F., et al. Engineering a replication-competent, propagation-defective Middle East respiratory syndrome coronavirus as a vaccine candidate. mBio. 4 (5), e00650-e00613 (2013).
  42. Jamsai, D., et al. Targeted modification of a human beta-globin locus BAC clone using GET Recombination and an I-Scei counterselection cassette. Genomics. 82 (1), 68-77 (2003).
  43. Lee, E. C., et al. A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA. Genomics. 73 (1), 56-65 (2001).
  44. Tischer, B. K., von Einem, J., Kaufer, B., Osterrieder, N. Two-step red-mediated recombination for versatile high-efficiency markerless DNA manipulation in Escherichia coli. BioTechniques. 40 (2), 191-197 (2006).

Tags

Zika VirusReverse GeneticsBacterial Artificial ChromosomeCDNA CloneInfectious CloneRNA VirusFlavivirusViral BiologyViral PathogenesisVaccine DevelopmentTransfectionVero Cells

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Ávila-Pérez, G., Park, J., Nogales, A., Almazán, F., Martínez-Sobrido, L. Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone. J. Vis. Exp. (148), e59537, doi:10.3791/59537 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image