Redding van recombinante Zika virus uit een bacteriële kunstmatige chromosoom cDNA kloon

1. bouw van een ZIKV infectieuze cDNA kloon in een BAC Opmerking: De strategie voor de assemblage van ZIKV in BACs wordt beschreven voor de RGN stam13 (TOETREDINGS nummer KU527068) (Figuur 2). Selecteer unieke beperkings sites die op de juiste afstand van het virale genoom staan die afwezig zijn in de plasmide pBeloBAC11 (Figuur 2a).Opmerking: Voor ZIKV-RGN werden de beperkings sites PML I, AFE I en BstB I (genomische posities 3.347, 5.969 en 9.127) geselecteerd. In het geval dat er geen geschikte beperkings sites beschikbaar zijn in het virale genoom, genereert u nieuwe beperkings sites door de invoering van stille nucleotide-mutaties in het virale genoom tijdens het ontwerp van het cDNA-fragment. Genereer door chemische synthese vier cDNA-fragmenten over het volledige genoom (Z1 tot Z4), geflankeerd door de promotor CMV op de 5 ‘-end en de HDV rz, de BGH-beëindiging en polyadenylatie sequenties aan de 3 ‘-end ( Figuur 2b). Elk fragment moet worden geflankeerd door de geselecteerde beperkings sites (stap 1,1).Opmerking: Fragment Z1 wordt gebruikt als ruggengraat voor het klonen van de rest van de fragmenten in de pBeloBac11. Daartoe moet het de menselijke CMV-promotor bevatten en moet het worden geflankeerd aan de 5 ‘-end door ApaL I (om dit fragment in pBeloBAC11 te klonen) en ASC I (afwezig in het virale genoom) en op de 3 ‘-end door de beperkingsgebieden geselecteerd voor de assemblage van de infectieuze kloon (PML I , AFE I, en BstB I) gevolgd door MLU I (afwezig in het virale genoom) en BamH I (om dit fragment te klonen in pBeloBAC11). Fragment Z4 moet de genomische regio bevatten van de laatste beperkings site geselecteerd (BstB I) tot het einde van het virale genoom, gevolgd door de HDV RZ, de BGH-beëindiging en polyadenylatie sequenties, en de MLU I-beperkings site (Figuur 2b). Als alternatief kunnen de cDNA-fragmenten (Z1-Z4) worden gegenereerd door een combinatie van standaard reverse transcriptase-polymerase kettingreacties (RT-PCRs) en overlappende PCRs met behulp van specifieke oligonucleotiden. Monteer de infectieuze cDNA-kloon door sequentieel klonen van fragmenten Z1 naar Z4 in pBeloBAC11 (Figuur 2b). Verteren de pBeloBAC11 plasmide en de Z1 fragment met ApaL I en BamH I. Meng hiervoor 2 μg pBeloBAC11 plasmide of 1 μg Z1-fragment met 10 μL 10x-reactiebuffer, 20 eenheden van elk enzym en water om een eindvolume van 100 μL te bereiken. Inbroed bij 37 °C gedurende 2 uur. Defosforylaat de BAC vector met behulp van garnalen alkalische fosfatase (SAP). Voeg daartoe 2,5 μL (2,5 eenheden) SAP toe aan het verteerde BAC en inbroed bij 37 °C gedurende 1 uur. Verwarm het SAP door gedurende 15 minuten te incuberen bij 75 °C. Reinig de gedefosforyleerd BAC vector en fragment Z1 door agarose gel elektroforese met behulp van een commerciële gel clean-up Kit geoptimaliseerd voor de zuivering van DNA-fragmenten groter dan 10 kB (Zie de tabel van de materialen). Voer de ligatie reactie uit om het plasmide (p) BAC-Z1 te genereren. Meng hiertoe 150 ng van gezuiverde, verteerde BAC-vector met de gezuiverde wisselplaat met behulp van een molaire verhouding van vector-naar-insert van 1:3, 1,5 μL van 10x T4 DNA-ligase buffer met 10 mM ATP, één eenheid T4 DNA ligase, en water tot een eindvolume van 15 μL. Inbroed het ligatie mengsel gedurende 20 uur bij 16 °C. Als controle van de ligatie reactie, presteren parallel een ligatie reactie zonder invoegen. Warmte-inactiveren van de ligase door incubatie bij 65 °C gedurende 15 minuten.Opmerking: In het geval van stompe-ended Dna’s, incuberen de ligatie reactie voor 20 uur bij 14 °C. Vanwege de grote grootte van de BAC vector (Figuur 2a), is het essentieel om grotere hoeveelheden vector en insert dan ligaties met behulp van conventionele plasmiden gebruiken om de ligatie-efficiëntie te verhogen. Transformeer 50 μL E. coli DH10B elektrocompetente cellen met 2 μL van de ligatie reactie (stap 1.3.5) door middel van elektroporation (25 μf capaciteit, 2,5 kV en 100 Ω weerstand), met behulp van electroporatie cuvettes uitgerust met elektroden met tussenpozen van 0,2 cm, volgens de standaardprotocollen. Breng de cellen over naar een polypropyleen buis met 1 mL SOC medium (2% Tryptone, 0,5% gistextract, 0,05% NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mm MgSO4, 20 mm glucose [pH 7,0]) en inbroed ze bij 37 °c gedurende 1 uur met zacht schudden (200-250 rpm). Plaat de cellen op de Luria Bouillon (LB) agar-platen met 12,5 μg/mL chlooramfenicol en incuberen ze bij 37 °C gedurende 16 uur. Kies 8 tot 12 bacteriële kolonies, maak een replica op een verse LB agar-plaat met 12,5 μg/mL chlooramfenicol, en test of ze de juiste wisselplaat door directe PCR-analyse met specifieke oligonucleotiden bevatten. Kies een positieve kolonie van de replica plaat, groeien in 100 mL LB bevattende 12,5 μg/mL chlooramfenicol, en isoleren van de BAC cDNA door de alkalische lysis methode met behulp van een commerciële plasmide MIDI Kit, na de aanbeveling voor de zuivering van grote laag-Copy plasmiden (Zie de tabel met materialen).Opmerking: BAC cDNA bereid door deze methode kan worden verontreinigd met maximaal 30% van bacteriële genomisch DNA, maar het is geschikt in kwaliteit voor het uitvoeren van restrictie analyse, sequencing en klonen. Afhankelijk van de grootte van het BAC, kunnen opbrengsten van 4-6 μg van het BAC plasmide worden verkregen. Controleer de genetische integriteit van de gekloonde cDNA door restrictie analyse. Digest 500 ng van het pBAC-Z1 plasmide met ASC I en PML I bij 37 °C gedurende 1 uur en bevestig de aanwezigheid van het fragment Z1 door gel elektroforese. Om verder te bevestigen dat ongewenste mutaties niet zijn geïntroduceerd, volg de sequentie de wisselplaat met specifieke oligonucleotiden. Beginnend bij de plasmide pBAC-Z1 met de geselecteerde beperkings plaatsen (PML I, AFE I, BstB I en MLU I), kloon fragmenten Z2 tot Z4 sequentieel om de volledige infectieuze cDNA-kloon pBAC-ZIKV (Figuur 2b) te genereren, volgende soortgelijke experimentele benaderingen zoals hierboven beschreven voor fragment Z1 (stappen 1.3.1-1.3.10). 2. bereiding van hoogzuivere pBAC-ZIKV voor de redding van infectieuze rZIKV Opmerking: De grootschalige bereiding van een ultrapuur pBAC-ZIKV infectieuze kloon, geschikt voor de transfectie en redding van infectieuze virussen, wordt uitgevoerd door alkalische lyse met een commerciële Kit die speciaal is ontwikkeld voor het zuiveren van BAC (Zie de tabel van Materialen). De kit moet een ATP-afhankelijke exonuclease verterings stap bevatten die bacteriële genomische DNA-besmetting verwijdert, waardoor de isolatie van BAC cDNA met een zuiverheidsgraad vergelijkbaar is met die verkregen met de cesium chloride methode. Kweek een enkele kolonie van E. coli DH10B het dragen van de pbac-zikv infectieuze kloon in 5 ml lb medium met 12,5 μg/ml chlooramfenicol bij 37 °c voor 8 uur met zacht schudden (200-250 rpm). Voeg 1 mL bacteriële kweek (stap 2,1) toe aan 500 mL LB met 12,5 μg/mL chlooramfenicol in een kolf van 2 L en kweek de cellen bij 37 °C voor 14-16 h (tot een OD600 van 0,6-0,8).Opmerking: Rijke Bouillon, zoals geweldige Bouillon (TB), kan extreem hoge celdichtheden produceren, wat resulteert in een lagere opbrengst en minder zuiverheid van het BAC cDNA. Reinig de BAC infectieuze cDNA-kloon door alkalische lysis met behulp van een commerciële Kit die speciaal is ontwikkeld voor het zuiveren van BAC, volgens de specificaties van de fabrikant (Zie de tabel met materialen). Houd het gezuiverde BAC cDNA bij 4 °C. Afhankelijk van de grootte van het BAC, kunnen opbrengsten van 30 μg ultrapuur BAC cDNA-kloon worden verkregen.Opmerking: Droog de DNA-pellet niet langer dan 5 min, omdat overdroging het moeilijk zal maken om het BAC cDNA op te lossen. Vanwege de grote omvang van de Bac cDNA kloon, Vermijd grondig of pipetteren om plasmide scheren te voorkomen. 3. redding van infectieuze rZIKV van de kloon van het BAC cDNA door transfectie van Vero-cellen Opmerking: Infectieuze rZIKV wordt teruggewonnen door de transfectie van Vero-cellen met de pBAC-ZIKV cDNA-kloon, met behulp van een commercieel kationisch lipide-transfectiereagens (Zie de tabel met materialen; Figuur 3). Een dag voor de transfectie, plaat op 6-well platen 5 x 105 Vero cellen/goed in groeimedium (Dulbecco’s gemodificeerde eagle’s medium [DMEM] aangevuld met 5% foetaal runderserum [FBS], 2 mm L-glutamine, en 1% niet-essentiële aminozuren) zonder antibiotica om 90% confluente celmonolagen te verhogen tegen de tijd van transfectie.Opmerking: We raden aan om de virus recues in triplicates uit te voeren. Evenwichts serum-verlaagd medium (Zie de tabel met materialen) bij kamertemperatuur en bereid transfectie mengsels in steriele microfugebuis buizen voor elk transfectie monster als volgt. Voeg 4 μg van de kloon van de Bac cDNA toe in 250 μL serum-gereduceerd medium en meng zorgvuldig, waarbij grondig wordt vermeden om plasmide Shearing te voorkomen. Verdun in een aparte buis 12 μL transfectie reagens (1 mg/mL) (Zie de tabel met materialen) in 250 μL serum verlaagd medium, Meng door vortexing en inincuberen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Combineer het verdunde BAC cDNA en het transfectie-reagens (met een 1:3 ratio van DNA: transfectie-reagens), meng zorgvuldig terwijl u vortexing vermijdt en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20-30 min. Was tijdens de incubatieperiode van de reagentmix van het BAC cDNA/transfection Vero-cellen met groeimedium zonder antibiotica en laat de cellen in 1 mL vers medium zonder antibiotica.Opmerking: De toevoeging van antibiotica tijdens het transfectie proces kan de efficiëntie van transfectie verminderen. Verdeel met druppelsgewijs de 500 μL van het BAC cDNA/transfection-reagens mengsel (van stap 3.2.3) op de Vero-cellen, meng ze door de plaat heen en weer te schommelen en incureer de cellen in een 5% Co2 bevoficeerde incubator bij 37 °c gedurende 6 uur. Verwijder het transfectie medium, voeg 2 mL vers groeimedium toe met antibiotica (100 U/mL penicillaire en 100 μg/mL streptomycine), incuberen de cellen in een met 5% CO2 bevoficeerde incubator bij 37 °c en controleer elke dag op de inductie van cytopathisch effect (CPE ).Opmerking: ZIKV CPE is vrij uitgesproken in de Vero-cellen en wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van afgeronde en birefringent cellen die zich losmaken en drijven in de weefselcultuur supernatant. Verzamel aliquots (100 μL) van de Vero Cell tissue-culture supernatanten (stap 3,5) om de 24 uur om de efficiëntie van het herstel van het virus te bepalen door de aanwezigheid van zikv te beoordelen aan de hand van een standaard plaque test op verse Vero-cellen (figuur 4a). Na vier tot zes dagen van transfectie, wanneer de CPE ongeveer 50%-75% (figuur 4b) is, verzamel dan de weefselkweek supernatanten in 15 ml conische buizen en centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c om cellulair puin te verwijderen. Oogst de supernatanten die rzikv bevatten en gooi de celpellets weg. Aliquot de supernatant in cryotubes en bewaar ze bij-80 °C om de aanwezigheid van geredde rZIKV verder te bevestigen. 4. titratie van teruggewonnen rZIKV Een dag voor titratie, zaad op 12-well platen 2,5 x 105 Vero cellen/goed in groeimedium te verhogen 90% confluente celmonolayers op het moment van titratie.Opmerking: Wij adviseren het uitvoeren van de titratie van de herstelde rZIKV in triplicaten. Verwijder een aliquot van de supernatant uit de vriezer (stap 3,8) en maak seriële 10-voudige verdunningen in groeimedium zonder FBS. Was de Vero-cellen 2x met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en voeg 200 μL/goed toe van elke virus verdunning in drievlaat. Plaats de platen in een 5% CO2 bevoficeerde incubator bij 37 °c en steen elke 15 minuten gedurende een adsorptie periode van 90 minuten. Verwijder het virale inoculum, overlay de cellen met 2 mL groeimedium met 2% FBS, 1% DEAE-dextran, en 0,6% agar Noble, en incuberen bij 37 °C onder 5% co2 voor 3-4 dagen.Opmerking: Het is mogelijk om agarose, methylcellulose of andere overlay media te gebruiken. De tijd voor de juiste plaque vorming zal variëren afhankelijk van de overlay gebruikt en de ZIKV stam. Fix ZIKV-geïnfecteerde cellen met 1 mL/goed van 4% formaldehyde verdund in PBS bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, verwijder de overlay, en visualiseer de virale plaques door ze te kleuren met 0,1% kristalviolet in 20% methanol bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Gooi het kristalviolet weg, was 3x met water, laat de platen drogen en Tel handmatig de plaques (figuur 4c, linker paneel). Virale titer wordt berekend als plaquevormende eenheden per milliliter (PFU/ml). Als alternatief kunnen virale plaques worden gevisualiseerd door immunokleuring met het pan-Flavivirus E Protein Mouse monoklonaal antilichaam (mAb) 4G2 (figuur 4c, rechter paneel). Om ZIKV plaques te evalueren door middel van immunokleuring, na de bevestiging en verwijdering van de overlay agar zoals hierboven beschreven (in stap 4,5), was de cellen 2x met PBS en permeabiliseer ze door te incuberen met 200 μL/goed van 0,5% Triton-X100 in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de permeabilization-oplossing, was de cellen 3x met PBS en Blokkeer ze met 200 μL/goed van de blokkerende oplossing (10% FBS in PBS) voor 1 uur bij kamertemperatuur.Opmerking: In deze stap kunnen andere standaard blokkerende oplossingen (bijv. 2,5% BSA in PBS) worden gebruikt. Verwijder de blokkerende oplossing en inbroed de cellen met 200 μL/goed van het pan-Flavivirus E proteïne mAb 4G2 verdund in blokkerende oplossing (1 μg/mL) gedurende 1 uur bij 37 °C.Opmerking: Andere mAb of Polyklonale antilichamen (pAb) kunnen worden gebruikt in plaats van 4G2 voor de immunokleuring en detectie van virale plaques. Was de cellen 3x met PBS en infiltreer ze met 200 μL biotinyleerd anti-muis secundair antilichaam verdund (volgens de aanbeveling van de fabrikant) in blokkerende oplossing voor 1 uur bij 37 °c. Verwijder het secundaire antilichaam, was de cellen 4x met PBS en visualiseer de virale plaques met behulp van een op avidin/biotin gebaseerde peroxidase Kit volgens de specificaties van de fabrikant (Zie de tabel met materialen). 5. bevestiging van succesvolle rZIKV redding Opmerking: Om de identiteit van het gered virus verder te bevestigen, wordt ZIKV E eiwit expressie geanalyseerd door immunofluorescentie met behulp van de muis mAb 1176-56 specifiek voor ZIKV E eiwit (figuur 4D). Deze mAb is specifiek voor ZIKV E-eiwitten, in tegenstelling tot de situatie van het pan-Flavivirus E proteïne mAb 4G2 (stap 4.6.3). Als alternatief kan de virus identiteit worden bevestigd door sequencing. Een dag vóór de immunofluorescentie analyse wordt het zaad afgedekt in 24-goed platen met 1 x 105 Vero-cellen/goed in het groeimedium om 90% confluente celmonolagen te verhogen tegen de tijd van infectie. Was de cellen 2x met PBS en besmetten ze met een multipliciteit van infectie (MOI) van 0,5 PFU/cel van het geredde virus in het groeimedium zonder FBS (100 μL/goed) in drievat. Inincuberen van de platen bij 37 °C gedurende 90 min. Na virale adsorptie, verwijder het virale entmateriaal, Voeg 0,5 mL vers groeimedium toe met 2% FBS en inculeer de cellen in een 5% CO2 bevoficeerde incubator bij 37 °c voor 48 h. Verwijder de weefselkweek supernatant, Fixeer de cellen met 150 μL/goed van 4% Paraformaldehyde in PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en permeabiliseer de cellen met 150 μL/goed van 0,5% Triton-X100 in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Na het verwijderen van de permeabilization oplossing en het wassen van de cellen 3x met PBS, Blokkeer de cellen met 150 μL/goed van blokkerende oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.Opmerking: Celscan wordt geblokkeerd met alternatieve blokkerende oplossingen (bijv. 2,5% BSA in PBS). Verwijder de blokkerende oplossing en inbroed de cellen met 100 μL/goed van mAb 1176-56, specifiek voor ZIKV E-eiwit, verdund in blokkerende oplossing (1 μg/mL) voor 1 uur bij 37 °C. Was de cellen 3x met PBS, inbroed ze bij kamertemperatuur gedurende 1 uur met 100 μL/goed van Alexa Fluor 488-geconjugeerde anti-muis secundair antilichaam verdund (volgens de aanbeveling van de fabrikant) in blokkerende oplossing, was de cellen uitgebreid met PBS, en inbroed ze met 150 μL/goed van 4 ‘, 6 ‘-diamidino-2-fenylindole (DAPI; 1 mg/mL) verdund 1:200 in PBS bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Was de cellen 3x met PBS, Monteer de dekstroken op een anti fade-bevestigings medium (Zie de tabel met materialen) en analyseer de monsters onder een fluorescentiemicroscoop.Opmerking: Voor langdurige opslag, bewaren van monsters bij 4 °C, beschermd tegen licht. 6. versterking en aanmaak van virale voorraden Opmerking: Zodra de identiteit van het geredde virus is bevestigd (rubriek 5), versterkt u het virus op de Vero-cellen en genereert u virale voorraden voor verdere studies. Grow Vero cellen in 100 mm x 21 mm platen bij 90% samenvloeiing en infecteren ze met een MOI van 0,1 PFU/cel zoals eerder beschreven. Wanneer de CPE ongeveer 75% (ongeveer 48-72 h na infectie) is, verzamel dan de weefselkweek supernatant in een conische buis van 50 mL en centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c om het cellulaire puin te verwijderen. Oogst de supernatant met rZIKV en gooi de celpellet weg. Aliquot de supernatant in cryotubes en bewaar ze bij-80 °C. Verwijder een virus aliquot uit de vriezer en bepaal de virale titer met plaque assay zoals eerder beschreven (rubriek 4).