JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

إنقاذ فيروس زيكا المؤتلف من استنساخ cDNA كروموسوم اصطناعي جرثومي

Published: June 24, 2019
doi:
10.3791/59537
, , , ,
1Department of Microbiology and Immunology,University of Rochester Medical Center, 2Department of Molecular and Cell Biology,Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC), Campus Universidad Autónoma de Madrid

Summary

ويبرز وباء فيروس زيكا الذي أُحدث مؤخراً أهمية وضع نُهُج جينية عكسية لتطوير اللقاحات و/أو الاستراتيجيات العلاجية. هنا، ونحن نصف بروتوكول لإنقاذ فيروس زيكا المؤتلف المعدية من استنساخ cDNA كامل الطول تجميعها في كروموسوم اصطناعي البكتيرية تحت سيطرة الفيروس المضخم للخلايا البشرية المروج الفوري في وقت مبكر.

Abstract

وقد أكد ارتباط عدوى فيروس زيكا (ZIKV) بمضاعفات عصبية خلال الفاشية العالمية الأخيرة والافتقار إلى اللقاحات المعتمدة و/أو مضادات الفيروسات الحاجة الملحة إلى تطوير نظم جينية عكسية من هذا المرض لتيسير دراسة علم الأحياء ZIKV وتطوير النهج العلاجية و / أو الوقائية. ومع ذلك، كما هو الحال مع الفيروسات الفلافية الأخرى، تم إعاقة توليد استنساخ الحمض النووي الريبي المعدي ة بالكامل من ZIKV بسبب سمية التسلسلات الفيروسية أثناء تضخيمها في البكتيريا. للتغلب على هذه المشكلة، قمنا بتطوير نهج غير تقليدي يقوم على استخدام الكروموسومات الاصطناعية البكتيرية (BACs). باستخدام هذا النهج، يتم إنشاء نسخة كاملة الطول من الحمض النووي الريبي من سلالة ZIKV ريو غراندي دو نورتي ناتال (ZIKV-RGN) من أربع شظايا الحمض النووي الاصطناعية وتجميعها في pBeloBAC11 بلازميد نسخة واحدة تحت سيطرة الفيروس المضخم للخلايا البشرية (CMV) المروج الفوري في وقت مبكر. استنساخ CDNA BAC تجميعها مستقرة أثناء الانتشار في البكتيريا، ويتم استرداد المؤتلف المعدية (ص) ZIKV في خلايا فيرو بعد الانسياق من استنساخ CDNA BAC. يوفر البروتوكول الموضح هنا تقنية قوية لتوليد الحيوانات المستنسخة المعدية من الفيروسات الفلافية، بما في ذلك ZIKV، وغيرها من فيروسات الحمض النووي الريبي إيجابية حبلا، ولا سيما تلك التي لديها جينوم كبير التي لديها مشاكل الاستقرار خلال البكتيرية نشر.

Introduction

ZIKV هو عضو يحمله البعوض من جنس فيروس فلافي داخل عائلة Flaviviridae التي تشكل حاليا حالة طوارئ الصحة العامة العالمية1. مثل غيرها من الفيروسات الفلافية، ZIKV هو فيروس RNA مغلفة مع بنية مثل icosahedral الذي يحتوي علىشعور إيجابي، جزيء RNA واحد الذين تقطعت بهم السبل من حوالي 10.8 كيلو بايت (الشكل 1)2. الجينوم الفيروسي يشفر بروتين كبير من حوالي 3423 من الأحماض الأمينية التي تتم معالجتها بواسطة البروتياز الفيروسية والخلوية في ثلاثة بروتينات هيكلية (كابسيد [C]، قبل الغشاء / الغشاء [prM/M]، والمغلف [E]) التي تشارك في تشكيل الجسيمات الفيروسية وسبعة بروتينات غير هيكلية (NS1، NS2A، NS2B، NS3، NS4A، NS4B، وNS5) التي تشارك في النسخ المتماثل الجينوم، وتجميع الفيروسات، والتهرب من الاستجابة المناعية المضيفة (الشكل 1)3.

تاريخيا، وقد ارتبطت عدوى ZIKV مع مرض الحموية خفيفة4،5. ومع ذلك، فإن الوباء المتفجر ة الأخيرة من عدوى زيكف فيجميع أنحاء أمريكا الجنوبية والوسطى، وجنوب المحيط الهادئ، ومنطقة البحر الكاريبي 6،7،8،وارتباطه مع حدوث متلازمة غيلان باريه وصغرالرأس 9،10،11،12،13،غيرت التصور التاريخي وقويت أهمية ZIKV كممرض الإنسان المهم. وبهذا المعنى، فإن تطوير الأدوات الجزيئية، مثل استنساخ الـ cDNA المعدية، سيسهل دراسة مسببات الأمراض الفيروسية وتطوير لقاحات محددة وراثياً وتحديد الأدوية المضادة للفيروسات لعلاج عدوى زيكف. كما هو موضح للفيروسات الفلافية الأخرى، فإن توليد الحيوانات المستنسخة المعدية ZIKV من الصعب بسبب وجود المروجين البكتيرية خفي في الجينوم الفيروسي14 التي تسمح التعبير راشح من البروتينات الفيروسية السامة أثناء انتشار استنساخ cDNA في البكتيريا باستخدام معيار عالية نسخة عدد plasmids15،16،17. وللتغلب على مشكلة السمية هذه، تم بنجاح تنفيذ عدة نُهج غير تقليدية في العامين الماضيين18. وتشمل هذه استخدام منخفضة النسخ عدد بلازميدات19،20، وإدراج الإينترونات لتعطيل المناطق السامة21،22،23،الربط في المختبر من شظايا cDNA 24 , 25, إسكات الطفرة من المروجين البكتيرية خفي موجودة في الجينوم الفيروسي26,27, أمبوليكونات subgenomic المعدية (ISA)28,29, طريقة تجميع جيبسون30 ، واستخدام تفاعل تمديد البوليمرات الدائرية (CPER)31.

هنا، ونحن نصف بروتوكول مفصل للهندسة من استنساخ cDNA كامل الطول من سلالة ZIKV ZIKV-RGN13، وذلك باستخدام BAC للتغلب على مشكلة السمية ، وإنقاذ rZIKV المعدية عن طريق التحويل المباشر للاستنساخ CDNA BAC في فيرو الخلايا32، وهو خط الخلية التي وافقت عليها إدارة الغذاء والدواء (FDA) لتطوير اللقاحات البشرية33. في هذا النظام، يتم تجميع نسخة cDNA كاملة الطول من الجينوم الفيروسي في pBeloBAC1111 BAC (الشكل2A)،وهو بلازميد منخفض الأرقام (نسخة إلى نسختين لكل خلية) مشتقة من عامل F الإشريكية القولونية35، مما يقلل من سمية تسلسل اتلاف الفيروس أثناء انتشاره في البكتيريا. يتم تجميع cDNA الجينوم ZIKV في pBeloBAC11 تحت سيطرة الإنسان CMV المروج الفوري في وقت مبكر، للسماح للتعبير عن الفيروسية (v) RNA في نواة الخلايا المنقولة بواسطة بوليميراز الحمض النووي الريبي الخلوي الثاني، ويحيط بها في 3′-نهاية من قبل التهاب الكبد فيروس دلتا (HDV) ريبوزيم (RZ)، تليها تسلسل هرمون النمو البقري (BGH) إنهاء وإشارات polyadenyy لإنتاج RNAs الاصطناعية تحمل أصيلة 5 ‘- و 3’-ينتهي من الجينوم الفيروسي، على التوالي (الشكل2B). هذا النظام الذي أطلقته cDNA يؤدي إلى التعبير داخل الخلايا من RNA الفيروسية متوجة، مما يسمح باستعادة ZIKV المعدية دون الحاجة إلى خطوة النسخ في المختبر. يوفر نهج BAC منهجية قوية تنطبق على بناء استنساخ cDNA المعدية مستقرة وكاملة التشغيل للفيروسات الفلافية الأخرى، فضلا عن غيرها من الفيروسات RNA إيجابية الذين تقطعت بهم السبل36،37، 38،39،40،41.

Protocol

1. بناء استنساخ cDNA المعدية ZIKV في BAC ملاحظة: ويرد وصف لاستراتيجية تجميع ZIKV في BACs لسلالة RGN13 (رقم الانضمام KU527068) (الشكل2). حدد مواقع تقييد فريدة من نوعها متباعدة بشكل مناسب في الجينوم الفيروسي التي هي غائبة في pBeloBAC11 بلازميد (الشكل2A).ملاحظة: بالنسبة لـ ZIKV-RGN، تم اختيار مواقع التقييد Pml I وAfe I وBstB I (المواقع الجينية 3347 و5969 و9127 على التوالي). في حالة عدم توفر مواقع تقييد مناسبة في الجينوم الفيروسي، توليد مواقع تقييد جديدة عن طريق إدخال طفرات النيوكليوتيدات الصامتة في الجينوم الفيروسي أثناء تصميم جزء cDNA. توليد عن طريق التركيب الكيميائي أربع شظايا cDNA تمتد الجينوم كامل الطول (Z1 إلى Z4)، يحيط بها المروج CMV في 5′-نهاية وRZ HDV، وإنهاء BGH، وتسلسل polyadenylation في 3′-نهاية (الشكل 2B). يجب أن يكون كل جزء محاطاً بمواقع التقييد المحددة (الخطوة 1.1).ملاحظة: يتم استخدام جزء Z1 كعمود فقري لاستنساخ بقية الشظايا في pBeloBac11. لهذا الغرض، يجب أن تحتوي على المروج CMV الإنسان ويجب أن يكون محاطا في 5′-نهاية من قبل ApaL I (لاستنساخ هذه القطعة في pBeloBAC11) وAsc I (غائبة في الجينوم الفيروسي)، وفي 3′-نهاية من قبل مواقع تقييد اختيار لتجميع استنساخ المعدية (Pml I ، Afe I، وBstB I) تليها Mlu I (غائبة في الجينوم الفيروسي) وBamH I (لاستنساخ هذه القطعة في pBeloBAC11). يجب أن يحتوي الجزء Z4 على المنطقة الجينية من آخر موقع تقييد تم تحديده (BstB I) إلى نهاية الجينوم الفيروسي، متبوعاً بـ HDV RZ، وإنهاء BGH، وتسلسلات تعدد الإنكار، وموقع تقييد Mlu I (الشكل2B). وبدلاً من ذلك، يمكن توليد شظايا الـ cDNA (Z1-Z4) عن طريق مزيج من التفاعلات المتسلسلة القياسية للنسخ العكسي للبوليميراز (RT-PCRs) وتداخل مركبات البولي ميراك باستخدام القلة. تجميع استنساخ cDNA المعدية عن طريق الاستنساخ المتسلسل من شظايا Z1 إلى Z4 في pBeloBAC11 (الشكل2B). هضم pBeloBAC11 بلازميد وZ1 جزء مع ApaL الأول وBamH الأول. لذلك، مزيج 2 ميكروغرام من pBeloBAC11 بلازميد أو 1 ميكروغرام من Z1 جزء مع 10 ميكرولتر من 10X رد الفعل العازلة، 20 وحدة من كل إنزيم، والماء للوصول إلى حجم نهائي من 100 درجة مئوية. إزالة الفوسفور ية ناقلات BAC باستخدام الجمبري الفوسفاتيز القلوية (SAP). ولهذا الغرض، يضاف 2.5 ميكرولتر (2.5 وحدة) من SAP إلى BAC المهضوم ة والحضانة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. تنقية ناقلات BAC dephosphorylated والجزء Z1 بواسطة الكهربائي هلام أغاروز باستخدام مجموعة تنظيف هلام التجارية الأمثل لتنقية شظايا الحمض النووي أكبر من 10 كيلو بايت (انظر جدول المواد). أداء رد فعل الربط لتوليد بلازميد (ع) BAC-Z1. لهذه الغاية، مزيج 150 نانوغرام من ناقلات BAC المهضومة النقية مع إدراج تنقية باستخدام نسبة الأضراس من ناقلات إلى إدراج 1:3، 1.5 ميكرولتر من 10X T4 الحمض النووي الرباط العازلة التي تحتوي على 10 MM ATP، وحدة واحدة من T4 DNA ligase، والماء إلى حجم نهائي من 15 ميكرولتر. احتضان خليط الربط لمدة 20 ساعة عند 16 درجة مئوية. كتحكم من ال [ليغأيشن] ردّ فعل, ينجز في المتوازي ربط ردّ فعل دون تدرج. الحرارة تعطيل الرباط عن طريق الحضانة في 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.ملاحظة: في حالة السلطات الوطنية المعينة غير الحادة، احتضان رد فعل الربط لمدة 20 ساعة عند 14 درجة مئوية. نظراً للحجم الكبير من ناقلات BAC (الشكل2A)،فمن الضروري استخدام كميات أكبر من ناقلات وإدراج من الأربطة باستخدام بلازميدات التقليدية من أجل زيادة كفاءة الربط. تحويل 50 ميكرولتر من E. coli DH10B الخلايا الكهربائية المختصة مع 2 μL من رد فعل الربط (الخطوة 1.3.5) عن طريق الكهربائي (25 μF السعة، 2.5 كيلوفولت، و 100 Ω المقاومة)، وذلك باستخدام cuvettes الكهربائي المجهزة بأقطاب متباعدة على فترات 0.2 سم، باتباع البروتوكولات القياسية. نقل الخلايا إلى أنبوب البولي بروبلين مع 1 مل من SOC المتوسطة (2٪ تريبتون، 0.5٪ استخراج الخميرة، 0.05٪ NaCl، 2.5 مل ككل، 10 مل ملغ كل2،10 مل ملغ سو4،20 مل الجلوكوز [pH 7.0]) واحتضانلهم في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع يهز لطيف (200-250 دورة في الدقيقة). تُصفيح الخلايا على مرق لوريا (LB) لوحات أغار تحتوي على 12.5 ميكروغرام/مل كلورامفينيكول وتحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. اختيار 8 إلى 12 مستعمرات البكتيرية، وجعل نسخة طبق الأصل على لوحة أجار LB جديدة تحتوي على 12.5 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول، واختبار ما إذا كانت تحتوي على إدراج الصحيح عن طريق تحليل PCR مباشرة باستخدام oligonucleotides محددة. اختيار مستعمرة إيجابية من لوحة النسخة المتماثلة، وتنمو في 100 مل من رطل تحتوي على 12.5 ميكروغرام / مل من الكلورامفينيكول، وعزل CDNA BAC بواسطة طريقة lysis القلوية باستخدام مجموعة ميدي بلازميد التجارية، بعد التوصية لتنقية كبيرة بلازميدات ذات نسخة منخفضة (انظر جدولالمواد).ملاحظة: BAC cDNA التي أعدت من قبل هذه الطريقة يمكن أن تكون ملوثة مع ما يصل إلى 30٪ من الحمض النووي الجيني البكتيري، ولكن من المناسب في الجودة لإجراء تحليل تقييد، والتسلسل، والاستنساخ. اعتمادا على حجم BAC، يمكن الحصول على غلة 4-6 ميكروغرام من بلازميد BAC. التحقق من السلامة الوراثية للحمض النووي الريبي المستنسخة عن طريق تحليل القيود. هضم 500 نانوغرام من بلازميد pBAC-Z1 مع Asc I و Pml I في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة وتأكيد وجود جزء Z1 بواسطة الكهربائي هلام. لمزيد من التأكيد على أن الطفرات غير المرغوب فيها لم يتم إدخالها، تسلسل إدراج مع oligonucleotides محددة. بدءا من pBAC-Z1 بلازميد التي تحتوي على مواقع تقييد مختارة (Pml I, Afe I, BstB I, و Mlu I), استنساخ شظايا بالتتابع Z2 إلى Z4 لتوليد كامل طول المعدية cDNA استنساخ pBAC-ZIKV (الشكل2B),بعد تجريبية مماثلة النهج كما هو موضح أعلاه للجزء Z1 (الخطوات 1-3-1 إلى 1-3-10). 2. إعداد عالية النقاء pBAC-ZIKV لإنقاذ rZIKV المعدية ملاحظة: يتم تنفيذ إعداد على نطاق واسع من استنساخ المعدية pBAC-ZIKV فائقة النقاء، ومناسبة لالتغوط وإنقاذ الفيروسات المعدية، عن طريق اللليس القلوية مع مجموعة تجارية وضعت خصيصا لتنقية BAC (انظر جدول المواد). يجب أن تتضمن المجموعة خطوة هضم exonuclease تعتمد على ATP تزيل تلوث الحمض النووي الجينومي البكتيري، مما يسمح بعزل CDNA BAC مع درجة من النقاء مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة كلوريد السيزيوم. تنمو مستعمرة واحدة من E. القولونية DH10B تحمل استنساخ المعدية pBAC-ZIKV في 5 مل من LB المتوسطة التي تحتوي على 12.5 ميكروغرام / مل من الكلورامفينيكول في 37 درجة مئوية لمدة 8 ساعة مع هز لطيف (200-250 دورة في الدقيقة). إضافة 1 مل من الثقافة البكتيرية (الخطوة 2.1) إلى 500 مل من رطل مع 12.5 ميكروغرام / مل من الكلورامفينيكول في قارورة 2 لتر وتنمو الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 14-16 ساعة (حتى OD600 من 0.6-0.8).ملاحظة: المرق الغني، مثل مرق رائع (السل)، يمكن أن تنتج كثافات الخلايا عالية للغاية، مما أدى إلى انخفاض العائد وأقل نقاء من CDNA BAC. تنقية استنساخ cDNA المعدية BAC عن طريق اللدى القلوية باستخدام مجموعة تجارية وضعت خصيصا لتنقية BAC، وفقا لمواصفات الشركة المصنعة (انظر جدولالمواد). الحفاظ على تنقية BAC cDNA في 4 درجة مئوية. اعتمادا على حجم BAC، يمكن الحصول على غلة 30 ميكروغرام من استنساخ CDNA BAC فائقة النقاء.ملاحظة: لا تجف بيليه الحمض النووي لأكثر من 5 دقائق، كما الإفراط في التجفيف سيجعل من الصعب حل CDNA BAC. بسبب الحجم الكبير لاستنساخ CDNA BAC، تجنب الدوامة أو الأنابيب لمنع القص بلازميد. 3. إنقاذ rZIKV المعدية من استنساخ CDNA BAC عن طريق Transfection من خلايا فيرو ملاحظة: يتم استرداد rZIKV المعدية عن طريق التغوط من خلايا فيرو مع استنساخ cDNA pBAC-ZIKV، وذلك باستخدام كاشف الانعتراب الدهون الموجبة التجارية (انظر جدول المواد; الشكل3). قبل يوم واحد من الانتراب، لوحة على لوحات 6 جيدا 5 × 105 خلايا فيرو / جيدا في وسط النمو (دولبكو تعديل النسر المتوسطة [DMEM] تستكمل مع 5٪ مصل البقر الجنيني [FBS]، 2 mM L-الجلوتامين، و 1٪ الأحماض الأمينية غير الأساسية) دون المضادات الحيوية لرفع 90٪ الطبقات الأحادية الخلية المترافقة بحلول وقت التغوط.ملاحظة: نوصي بإجراء عمليات الإنقاذ من الفيروس في الثلاثية. متساوي المصل خفض المتوسطة (انظر جدول المواد) في درجة حرارة الغرفة وإعداد خليط التغوط في أنابيب microfuge معقمة لكل عينة transfection على النحو التالي. إضافة 4 ميكروغرام من استنساخ CDNA BAC في 250 درجة مئوية من المصل خفض المتوسطة ومزيج بعناية، وتجنب الدوامة لمنع القص بلازميد. في أنبوب منفصل، تمييع 12 ميكرولتر من كاشف التغوط (1 ملغ / مل) (انظر جدولالمواد) في 250 ميكرولتر من المصل خفض المتوسطة، ومزيج من دوامة، وحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. الجمع بين cDNA BAC المخفف ة وكاشف الانقبش (مع نسبة 1:3 من الحمض النووي: الكاشف عبر التغوط)، ومزيج بعناية مع تجنب الدوامة، وحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20-30 دقيقة. خلال فترة الحضانة من CDNA BAC / الانتراب الكاشف، وغسل خلايا فيرو مع متوسط النمو دون المضادات الحيوية وترك الخلايا في 1 مل من المتوسطة الطازجة دون المضادات الحيوية.ملاحظة: إضافة المضادات الحيوية أثناء عملية التغوط قد يقلل من كفاءة التغوط. توزيع قطرة 500 درجة مئوية من خليط الكاشف CDNA/transfection BAC (من الخطوة 3.2.3) على خلايا فيرو، ومزجها عن طريق هز لوحة ذهابا وإيابا، واحتضان الخلايا في حاضنة 2 CO 5٪ المرطبة في 37 درجة مئوية لمدة 6ساعة. إزالة وسيط ة الانفسيد، إضافة 2 مل من متوسط النمو الطازج مع المضادات الحيوية (100 U / مل البنسلين و 100 ميكروغرام / مل ستربيوميسين)، حضانة الخلايا في حاضنة 5٪ CO2 ترطيب في 37 درجة مئوية، والتحقق من كل يوم لتحريض تأثير السيتوباث (CPE ).ملاحظة: ZIKV CPE هو واضح جدا في خلايا فيرو ويتميز بوجود الخلايا المستديرة وbirefringent التي تفصل وتطفو في supernatant ثقافة الأنسجة. جمع aliquots (100 درجة مئوية) من الخلايا Vero الأنسجة ثقافة supernatants (الخطوة 3.5) كل 24 ساعة لتحديد كفاءة استعادة الفيروس عن طريق تقييم وجود ZIKV باستخدام فحص البلاك القياسية على خلايا فيرو الطازجة (الشكل4A). بعد أربعة إلى ستة أيام من التغوط، عندما يكون CPE حوالي 50٪ -75٪ (الشكل4B)،وجمع supernatants زراعة الأنسجة في أنابيب مخروطية 15 مل والطرد المركزي في 2000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية لإزالة الحطامالخلوي. حصاد supernatants التي تحتوي على rZIKV وتجاهل الكريات الخلية. Aliquot supernatant في الأنابيب الجليدية وتخزينها في -80 درجة مئوية لمزيد من تأكيد وجود rZIKV إنقاذها. 4. معايرة rZIKV المستردة قبل يوم واحد من المعايرة، والبذور على لوحات 12 جيدا 2.5 × 105 خلايا فيرو / جيدا في متوسط النمو لرفع 90٪ الخلايا أحادية الطبقات confluent بحلول وقت المعايرة.ملاحظة: نوصي بإجراء معايرة rZIKV المستردة في triplicates. إزالة aliquot من supernatant من الثلاجة (الخطوة 3.8) وجعل تخفيف المسلسل 10 أضعاف في وسط النمو دون FBS. غسل خلايا فيرو 2X مع الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) وإضافة 200 درجة مئوية / جيدا من كل تخفيف الفيروس في الثلاثي. ضع لوحات في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ CO2 عند درجة حرارة 37 درجة مئوية والصخور كل 15 دقيقة لفترة امتصاص 90 دقيقة. إزالة التلقيح الفيروسي، تراكب الخلايا مع 2 مل من متوسط النمو التي تحتوي على 2٪ FBS، 1٪ DEAE-dextran، و 0.6٪ أجار نوبل، وحضانة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2 لمدة 3-4 أيام.ملاحظة: فمن الممكن استخدام أغاروز، ميثيل سيلولوز، أو غيرها من وسائل الإعلام تراكب. سوف يختلف الوقت لتشكيل البلاك السليم اعتمادا على تراكب المستخدمة وسلالة ZIKV. إصلاح الخلايا المصابة ZIKV مع 1 مل / جيدا من 4٪ الفورمالديهايد المخفف في PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة، وإزالة تراكب، وتصور لويحات الفيروسية عن طريق تلطيخ لهم مع 0.1٪ الكريستال البنفسجي في 20٪ الميثانول في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. تجاهل البنفسج الكريستال، وغسل 3X بالماء، والسماح لوحات لتجف، وعد يدويا لويحات (الشكل4C،لوحة اليسار). يتم حساب التتر الفيروسي كوحدات تشكيل البلاك لكل ملليلتر (PFU/ml). بدلا من ذلك، يمكن تصور لويحات الفيروسية عن طريق تلطيخ المناعة مع عموم فلافيروس E البروتين الماوس أحادي النسيلة الأجسام المضادة (mAb) 4G2 (الشكل4C،لوحة الحق). لتقييم لويحات ZIKV عن طريق تلطيخ المناعة، بعد تثبيت وإزالة أجار تراكب كما هو موضح أعلاه (في الخطوة 4.5)، وغسل الخلايا 2X مع PBS وpermeabilize لهم عن طريق الحضانة مع 200 € L / جيدا من 0.5٪ تريتون-X100 في PBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة حل نفاذية، وغسل الخلايا 3X مع PBS، ومنعها مع 200 درجة مئوية / جيدا من منع الحل (10٪ FBS في PBS) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.ملاحظة: يمكن استخدام حلول حظر قياسية أخرى (على سبيل المثال، 2.5% BSA في PBS) في هذه الخطوة. إزالة محلول حظر واحتضان الخلايا مع 200 € L / جيدا من pan-flavivirus E البروتين mAb 4G2 المخففة في حل حظر (1 ميكروغرام / مل) لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية.ملاحظة: يمكن استخدام الأجسام المضادة الأخرى mAb أو متعددة النسيلة (pAb) بدلاً من 4G2 لتلطيخ المناعة والكشف عن لويحات فيروسية. غسل الخلايا 3X مع PBS، واحتضانلهم مع 200 درجة مئوية من الأجسام المضادة للماوس المضادة للماوس biotinylated المخففة (بعد توصية الشركة المصنعة) في حل حظر لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية. إزالة الأجسام المضادة الثانوية، وغسل الخلايا 4X مع PBS، وتصور لويحات الفيروسية باستخدام مجموعة بيروكسيداز المستندة إلى أفيدين / البيوتين بعد مواصفات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). 5. تأكيد نجاح الإنقاذ rZIKV ملاحظة: لمزيد من تأكيد هوية الفيروس الذي تم إنقاذه، يتم تحليل تعبير البروتين ZIKV E عن طريق الفلورة المناعية باستخدام الماوس mAb 1176-56 محددة لبروتين ZIKV E (الشكل4D). هذا mAb هو محدد للبروتين ZIKV E، على عكس حالة pan-flavivirus E البروتين mAb 4G2 (الخطوة 4.6.3). بدلاً من ذلك، يمكن تأكيد هوية الفيروس عن طريق التسلسل. قبل يوم واحد من تحليل الفلورة المناعية، تغطية البذور في لوحات 24 جيدا تحتوي على 1 × 105 خلايا فيرو / جيدا في متوسط النمو لرفع 90٪ الطبقات الأحادية الخلية confluent بحلول وقت العدوى. غسل الخلايا 2X مع PBS وتصيبهم مع تعدد العدوى (وزارة الداخلية) من 0.5 PFU / خلية من الفيروس الذي تم إنقاذه في متوسط النمو دون FBS (100 €L / جيدا) في triplicate. حضانة لوحات في 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. بعد الامتزاز الفيروسي، وإزالة التلقيح الفيروسي، إضافة 0.5 مل من وسط النمو الطازج مع 2٪ FBS، واحتضان الخلايا في حاضنة ترطيب CO2 5٪ في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. إزالة supernatant ثقافة الأنسجة، وإصلاح الخلايا مع 150 € L / جيدا من 4٪ بارافورمالدهايد في PBS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وpermeabilize الخلايا مع 150 درجة مئوية / جيدا من 0.5٪ تريتون-X100 في PBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد إزالة محلول نفاذية وغسل الخلايا 3X مع PBS، كتلة الخلايا مع 150 درجة مئوية / جيدا من منع الحل خلال 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.ملاحظة: يتم حظر فحص الخلايا باستخدام حلول حظر بديلة (على سبيل المثال، 2.5% BSA في PBS). إزالة محلول حظر واحتضان الخلايا مع 100 درجة مئوية / جيدا من mAb 1176-56، محددة لبروتين ZIKV E، مخففة في حل حظر (1 ميكروغرام / مل) لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية. غسل الخلايا 3X مع PBS، حضانة لهم في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة مع 100 درجة مئوية / جيدا من اليكسا فلور 488-المترافق الأجسام المضادة للماوس الثانوية المخففة (بعد توصية الشركة المصنعة) في حل حظر، وغسل الخلايا على نطاق واسع مع PBS، و احتضان لهم مع 150 درجة مئوية / جيدا من 4 ‘، 6 ‘-دياميديينو-2-فينيليندول (DAPI؛ 1 ملغ / مل) المخفف 1:200 في PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. غسل الخلايا 3X مع PBS، جبل الأغطية على وسيلة تصاعد antifade (انظر جدولالمواد)، وتحليل العينات تحت المجهر الفلوري.ملاحظة: للتخزين على المدى الطويل، تخزين عينات في 4 درجة مئوية، محمية من الضوء. 6. تضخيم وتوليد المخزونات الفيروسية ملاحظة: وبمجرد التأكد من هوية الفيروس الذي تم إنقاذه (القسم 5)، تضخيم الفيروس على خلايا فيرو وتوليد مخزونات فيروسية لمزيد من الدراسات. تنمو خلايا فيرو في لوحات 100 مم × 21 ملم في التقاء 90٪ وتصيبهم مع وزارة الداخلية من 0.1 PFU / الخلية كما هو موضح من قبل. عندما يكون CPE حوالي 75٪ (حوالي 48-72 ح بعد العدوى)، وجمع supernatant زراعة الأنسجة في أنبوب مخروطي 50 مل والطرد المركزي في 2000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية لإزالة الحطام الخلوي. حصاد supernatant التي تحتوي على rZIKV وتجاهل بيليه الخلية. Aliquot supernatant في الأنابيب الجليدية وتخزينها في -80 درجة مئوية. إزالة aliquot فيروس من الثلاجة وتحديد titer الفيروسية عن طريق البلاك حسب النحو المبين من قبل (القسم 4).

Representative Results

يسمح البروتوكول الموضح هنا لتوليد استنساخ اتّصال كامل الطول من الـ ZIKV باستخدام BAC لتقليل مشاكل السمية المرتبطة بعدة تسلسلات فلفيروسية. يمكن تحقيق الانتعاش الفعال من rZIKV المعدية من استنساخ CDNA BAC بسهولة بعد التغوط من خلايا فيرو عرضة (الشكل 2). باستخدام هذا البروتوكول، قمنا بإنشاء استنساخ cDNA مستقركامل الطول من سلالة ZIKV RGN32 عن طريق الاستنساخ بالتتابع أربع شظايا cDNA متداخلة في pBeloBAC11BAC 34 باستخدام أساليب الاستنساخ التقليدية وفريدة من نوعها مواقع تقييد موجودة فيالجينوم الفيروسي (الشكل 2). كان يحيط استنساخ cDNA كامل الطول في 5′-نهاية من قبل المروج CMV الإنسان للسماح التعبير عن vRNA في نواة الخلايا المنقولة، وفي 3′-نهاية من قبل RZ HDV تليها تعدد التخصصات BGH وتسلسل الإنهاء، لإنتاج RNAs التي تحتوي على بالضبط 3′-نهاية الجينوم الفيروسي(الشكل2). الاستقرار في البكتيريا من استنساخ CDNA BAC ولدت، جنبا إلى جنب مع التلاعب السهل باستخدام تقنيات الحمض النووي المؤتلف القياسية، يسلط الضوء على إمكانات نهج CDNA BAC للجيل السريع وموثوق بها من استنساخ cDNA مستقرة كاملة الطول من ZIKV وغيرها من الفيروسات الفلافية أو الفيروسات RNA إيجابية تقطعت بهم السبل مع الجينوم الفيروسي غير مستقر. مرة واحدة تم تجميع استنساخ CDNA BAC (الشكل2) ، يمكن استرداد الفيروس المعدية بسهولة بعد الانسياق المباشر للخلايا الفيرو عرضة مع استنساخ CDNA BAC باستخدام liposomes الموجبة(الشكل 3). سمح هذا النظام الذي أطلقته cDNA التعبير داخل الخلايا من vRNAمتوجا ، مما يسمح باستعادة الفيروسات المعدية دون الحاجة إلى خطوة النسخ في المختبر. باستخدام هذا النهج، كنا قادرين على إنقاذ rZIKV-RGN مع titers أعلى من 106 PFU / مل في 5 أيام posttransfection (الشكل4A). وبالإضافة إلى ذلك، تسبب الفيروس الذي تم إنقاذه في وجود CPE واضح (الشكل4B)،وولدت لويحات متجانسة من حوالي 2 ملم في الحجم (الشكل4C)،وتم تأكيد هويته من خلال التسلسل (البيانات غير المعروضة) وتحليل الفلورة المناعية باستخدام mAb محددة للبروتين ZIKV E، 1176-56 (الشكل4D). وتشير البيانات في المختبر إلى أن rZIKV-RGN المستردة تكرارها بكفاءة في خلايا فيرو وإلى مستويات بالمقارنة مع ZIKV الطبيعية عزل32 (البيانات لم تظهر). عموما، تظهر هذه النتائج أن rZIKV المعدية يمكن إنقاذها من استنساخ cDNA كامل طول تجميعها في BAC. الشكل 1 تنظيم الجينوم ZIKV وهيكل فيريون. (أ) منظمة الجينوم: يحتوي ZIKV على RNA إيجابي واحد الذين تقطعت بهم السبل التي يتم ترجمتها كبروتين واحد. تم شق البروتين متعدد البروتين المترجم ة بواسطة البروتياز الفيروسي (الأسهم) والمضيف (الماس) لإنتاج البروتينات الهيكلية كابسيد (C، الأزرق)، مصفوفة (M، البني)، ومغلفة (E، الأخضر)، وسبعة بروتينات غير هيكلية (NS1، NS2A، NS2B، NS3، NS4A، NS4B، وNS5). يشار إلى 5 ‘ و 3 ‘ المناطق غير المترجمة (UTRs) في نهاية الجينوم الفيروسي مع خطوط سوداء. (ب) هيكل فيريون: تم تزيين virions ZIKV مع البروتينات E و M، الراسية في ثنائي ة الدهون مع هيكل مثل icosahedral. تحت الغلاف الفيروسي كان النيوكليوكابسيد الفيروسية تتألف من البروتين C المرتبطة الحمض النووي الريبي الجينومي الفيروسي. وقد تم تكييف هذا الرقم من أفيلا – بيريز وآخرون18. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2 الجمعية من [زكف] [فولّ-لنغث] معدية [كدنا] استنساخ في [بك]. (أ) التمثيل التخطيطي لpBeloBAC11 BAC: الجينات التنظيمية parA، parB، parC،وrepE،وأصل النسخ المتماثل F-عامل (OriS)،والجينات المقاومة للكلورامفينيكول (سمص)، واللاك يتم الإشارة إلى الجين Z. يتم التأكيد على مواقع التقييد ذات الصلة المستخدمة لتجميع استنساخ الـ ZIKV cDNA المعدية. (ب) الجمعية من ZIKV كامل طول استنساخ cDNA المعدية في pBeloBAC11 BAC: أربعة شظايا الحمض النووي المتداخلة (Z1-Z4)، التي تغطي الجينوم ZIKV كامل (الشكل1)وتحيط بها مواقع تقييد المشار إليها، ولدت من قبل المواد الكيميائية التوليف واستنساخها بالتتابع إلى pBeloBAC11 لتوليد المعدية ZIKV cDNA استنساخ pBAC-ZIKV. تم تجميع الـ ZIKV المعدية كاملة الطول تحت سيطرة الفيروس المضخم للخلايا البشرية المروج الفوري في وقت مبكر (CMV) ويحيط بها في 3’-نهاية من قبل ريبوزيم HDV (RZ) وهرمون النمو البقري (BGH) إنهاء وتسلسل polyadenylation. وفيما يلي وصف المختصرات للجينات الفيروسية والعناصر التنظيمية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3 سير العمل لتوليد rZIKV من استنساخ CDNA BAC. تم نقل خلايا فيرو في 90٪ من التقاء في أحادية الطبقة مع ZIKVكامل طول المعدية cDNA استنساخ pBAC-ZIKV (الشكل 2) باستخدام liposomes الموجبة. في 4-6 أيام ما بعد transfection، عندما كان CPE واضح، تم جمع supernatants زراعة الأنسجة التي تحتوي على rZIKV وتقييمها لوجود الفيروس (الشكل4) وتستخدم للتضخيم الفيروسي في خلايا فيرو. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4 الانتعاش والتوصيف في المختبر من rZIKV. (أ) إنقاذ rZIKV المعدية من استنساخ CDNA BAC: خلايا فيرو في 90٪ من التقاء (6-شكل لوحة جيدا، triplicates) كانت وهمية transfected أو transfected مع 4 ميكروغرام / جيدا من pBAC-ZIKV (الشكل3)،وفي الأيام المشار إليها posttransfection، تم تحديد البنفسس الفيروس في الأنسجة ثقافة supernatants عن طريق فحص البلاك (PFU / مل). تشير أشرطة الخطأ إلى انحرافات قياسية عن ثلاث تجارب مختلفة للتغوط. يشير الخط الأسود المنقط إلى حد الكشف (50 PFU/mL). (B) الخلايا الفيروسية CPE: Vero في 90٪ التقاء (6-شكل لوحة جيدا، triplicates) كانت وهمية المصابة (أعلى) أو المصابة (وزارة الداخلية من 0.5 PFU / الخلية) مع rZIKV، وفي 48 ساعة بعد العدوى، تم تقييم وجود CPE عن طريق الفحص المجهري الخفيف. قضبان مقياس = 100 درجة مئوية (C) فحص البلاك الفيروسي وتلطيخ المناعة: خلايا فيرو في 90٪ التقاء (12 جيدا شكل لوحة) كانت مصابة rZIKV، وفي 72 ح بعد العدوى، وتصور لويحات الفيروسية من قبل الكريستال البنفسجي تلطيخ (اليسار) أو عن طريق تلطيخ المناعة ( الحق) باستخدام pan-flavivirus E بروتين mAb 4G2. قضبان مقياس = 5ملم (D) الفلورة المناعية: خلايا فيرو في 90٪ التقاء (24 جيدا شكل لوحة، triplicates) أصيب (وزارة الداخلية من 0.5 PFU / خلية) مع rZIKV، وفي 48 ساعة بعد العدوى، وتحليلها من قبل الفلورة المناعية باستخدام mAb 1176-56، محددة لZIKV E البروتين. كانت النوى الخلوية ملطخة DAPI. يتم عرض صورة مدمجة لخلايا فيرو المصابة بـ ZIKV. يمثل المربع الأبيض في أعلى اليمين صورة مكبرة لخلايا فيرو المصابة بـ ZIKV. قضبان مقياس = 100 درجة.

Discussion

تشكل استنساخات الـ cDNA المعدية أدوات جزيئية أساسية للبحوث الأساسية لفيروسات الحمض النووي الريبي وتطوير اللقاحات و/أو تحديد الاستراتيجيات المضادة للفيروسات. ومع ذلك، بالنسبة للعديد من فيروسات الحمض النووي الريبي التي تقطعت بها السبل الإيجابية، بما في ذلك الفيروسات الفلافية، فإن توليد استنساخ cDNA المعدية أمر صعب بسبب عدم استقرار cDNAs المستنسخة عند انتشارها في البكتيريا باستخدام بلازميدات عالية الأرقام عالية النسخ القياسية. في حالة ZIKV وغيرها من الفيروسات الفلافية، وهذا عدم الاستقرار يرجع أساسا إلى التعبير راشح من البروتينات الفيروسية السامة من المروجين البكتيرية خفي موجودة في الجينوم الفيروسي14،15،16،17 . هنا، ونحن نصف بروتوكول بديل وقوي لتوليد مستقرة ZIKV كامل طول استنساخ cDNA المعدية كبلازميد واحد، استنادا إلى استخدام pBeloBAC11BAC (الشكل2A)للتغلب على مشكلة السمية، واستخدام CMV المروج للسماح للتعبير عن vRNA في نواة الخلايا المنقولة، وRZ HDV لتوليد vRNAs مع دقيقة 3′-ينتهي (الشكل2B). باستخدام هذه الطريقة، قمنا بنجاح ولدت استنساخ المعدية مستقرة تماما من سلالة ZIKV RGN التي تسمح استرداد كفاءة وموثوق بها من rZIKV المعدية بعد الانفعال المباشر للخلايا فيرو عرضة (الشكل3 و الشكل4).

وقد بذلت جهود ضخمة في السنوات القليلة الماضية للتغلب على مشاكل عدم الاستقرار المرتبطة باستنساخ الحمض النووي الريبي المعديZIKV، وقد تم تنفيذ العديد من النهج بنجاح18، بما في ذلك الربط في المختبر من شظايا cDNA24 ، 25، بلازميدس نسخة منخفضة19،20، وتعطيل المروجين البكتيرية خفي عن طريق إدخال الطفرات الصامتة26،27، إدراج intron21، 22 , 23، وطريقة تجميع جيبسون30، وطريقة ISA28،29، واستخدام CPER31. على الرغم من أن هذه النهج التغلب على مشكلة السمية ومفيدة لتوليد الحيوانات المستنسخة CDNA المعدية ZIKV، وبعضها شاقة والحالية العديد من العيوب، بما في ذلك الحاجة إلى التعليب في المختبر وخطوات النسخ التي تقلل من الفيروس كفاءة الانتعاش أو إدخال عدد كبير من الطفرات الصامتة لتعطيل المروج البكتيري ة الخفية التي يمكن أن تؤثر على اللياقة البدنية الفيروسية، من بين أمور أخرى. ويقدم النهج الموصوف في هذا البروتوكول المزايا التالية. ط) وBAC بلازميد pBeloBAC1134 لديه النسخ المتماثل رقابة صارمة، والحفاظ على نسخة واحدة أو نسختين من بلازميد لكل خلية، مما يقلل من السمية ويسمح بصيانة مستقرة في البكتيريا من cDNAs غير مستقر. ‘2’ إن انتشار وتعديل بلازميدات BAC تكاد تكون مماثلة للتعديلات البسيطة الموصوفة في هذا البروتوكول للتعامل مع شظايا BAC-DNA الكبيرة الحجم والبلازميدات ذات النسخ المنخفضة. وتجدر الإشارة إلى أن استنساخ CDNA BAC يمكن أيضا أن تعدل إلى E. القولونية عن طريق إعادة تركيب متجانسة باستخدام نظام إعادة تركيب الأحمر42،43،44. التعبير داخل الخلايا من VRNA ZIKV متوجواستعادة الفيروسات المعدية دون الحاجة إلى خطوة النسخ في المختبر. ‘4’ يتم توليد rZIKV المعدية بعد التغوط المباشر للخلايا المعرضة (على سبيل المثال، فيرو) مع استنساخ CDNA BAC. بما أنّ [دنا] [ترّكأيشن] في [دمنس] [ترّكأيشن] أكثر فعّالة من [رنا] [ترّفكأيشن], الفيروس إستعادة فعالية مع ال [بك] مقاربة [هيغر] من أنّ يلاحظ يستعمل [رنا] نسخ, يقلّل الرقم الممرات في ثقافة خلايا أن يلد مخزون فيروسيّة و, وبالتالي، الحد من إدخال الطفرات غير المرغوب فيها عن طريق التكيف ثقافة الخلية.

وأخيرا، فإن إمكانات نهج BAC تدعمها الاستخدام الناجح لهذه الطريقة (مع تعديلات طفيفة) لهندسة استنساخ cDNA المعدية من الفيروسات الفلافية الأخرى، بما في ذلك فيروس حمى الضنك36، والعديد من الفيروسات الإكليلية ذات التأثير الكبير في صحة الإنسان والحيوان، مثل فيروس التهاب المعدة والأمعاء القابل للنقل37 (TGEV)، فيروس التهاب البريتوني المعدي القطط38 (FIPV)، فيروس كورونا البشري OC4339 (HCoV-OC43)، فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الالتهاب الحاد الوخيم (HCoV-OC43)، فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الالتهاب اللاإرادي الحاد الوخيم40 (SARS-CoV)، وفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية41 (MERS-CoV)، من بين أمور أخرى.

وفي البروتوكول الوارد وصفه هنا، هناك خطوتان حاسمتان ينبغي النظر فيهما. أحد الاعتبارات الهامة هو تحديد مواقع تقييد فريدة مناسبة في الجينوم الفيروسي التي هي غائبة في بلازميد BAC. وفي حالة عدم توافر مواقع تقييد كافية، يمكن إنشاء مواقع تقييد جديدة أثناء تصميم الاستنساخ عن طريق إدخال طفرات النيوكليوتيدات الصامتة. وثمة مسألة هامة أخرى هي أن بلازميدات BAC موجودة في نسخة واحدة أو نسختين فقط لكل خلية، وبالتالي، يتم الحصول على غلة منخفضة من بلازميدات BAC مع تلوث عال من الحمض النووي الجينومي البكتيري باستخدام بروتوكولات قياسية مصممة لعالية وعالية بلازميدات متوسطة النسخ. يتم التغلب على هذه المشكلة المحتملة بسهولة باستخدام كميات كبيرة من الثقافة وتنقية بلازميد BAC مع مجموعة تجارية وضعت خصيصا لتنقية BAC.

وباختصار، قمنا بتطوير نهج وراثي عكسي قوي ZIKV على أساس استخدام BAC التي يمكن تكييفها لتوليد مستقرة وفعالة تماما استنساخ الحمض النووي الريبي المعدية من فيروسات الحمض النووي الريبي الأخرى التي تقطعت بها السبل الإيجابية لتسهيل دراسة بيولوجيا هذه الفيروسات وتطوير اللقاحات و/أو لتسهيل تحديد الأدوية المضادة للفيروسات.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ويود المؤلفان أن يشكرا كارلا غوميز على مساعدتها التقنية في جيل استنساخ الـ BAC cDNA وSnezhana Dimitrova على مساعدتها في إعداد الفيديو. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا ً بمنح من وزارة الاقتصاد والقدرة التنافسية الإسبانية (MINECO, grant number BFU2016-79127-R) إلى F.A.T. والمعاهد الوطنية للصحة (NIH, grant number 1R21AI120500) إلى L.M.S. and F.A.T.

Materials

1. Molecular Biology Reagents
Afe I New England BioLabs R0652S 10,000 units/mL
AmpliTaq DNA Polymerase ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) N8080161 5,000 Units/mL
ApaL I New England BioLabs R0507S 10,000 units/mL
Asc I New England BioLabs R0558S 10,000 units/mL
BamH I New England BioLabs R0136S 10,000 units/mL
BstB I New England BioLabs R0519S 20,000 units/mL
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
ElectroMAX DH10B Cells  ThermoFisher Scientific (Invitrogen) 18290015 Electocompetent DH10B cells
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm Bio-Rad 165-2086
Ethanol Merck 100983 Flamable
Isopropanol Merck 109634 Flamable
Large-Construct Kit (10) QIAGEN 12462 For high-purity BAC preparation
LB Broth ThermoFisher Scientific (Invitrogen) 12780029 Can be homemade as well
LB with Agar ThermoFisher Scientific (Invitrogen) 22700041 Can be homemade as well
Methanol Merck 106009 Flamable
Mlu I New England BioLabs R0198S 10,000 units/mL
Oligonucleotides IDT N/A
Plasmid pBeloBAC11 New England BioLabs ER2420S (E4154S)
Plasmid Midi Kit (25) QIAGEN 12143 For midle-scale preparation of BAC plasmids
Pml I New England BioLabs R0532S 20,000 units/mL
Polypropylene tubes (10 mL) DeltaLab 175724 Other commercial sources are acceptable
QIAEX II Gel Extraction Kit (150) QIAGEN 20021 Gel-clean-up kit optimized for DNA fragments larger than 10 kb
Shrimp AlKaline Phosphatase (rSAP) New England BioLabs M0371S 1,000 units/mL
SOC Medium ThermoFisher Scientific (Invitrogen) 15544034 Can be homemade as well
Synthesis of cDNA fragments Bio Basic N/A
T4 DNA Ligase Sigma-Aldrich (Roche) 10481220001 1,000 units/mL
2. Cell Culture Reagents
6-Well Plates ThermoFisher Scientific (Nunc) 140675
12-Well Plates ThermoFisher Scientific (Nunc) 150628
24-Well Plates ThermoFisher Scientific (Nunc) 142485
Agar Noble VWR 214230
Alexa Fluor 488 Conjugate ant-mouse secondary antibody Varies N/A
Biotinylated Anti-Mouse Secondary Antibody Varies N/A
Cell Culture Dishes (100×21 mm) ThermoFisher Scientific (Nunc) 172931
Conical Tubes (15 mL) VWR 525-0150
Conical Tubes (50 mL) VWR 525-0155
Crystal Violet Sigma-Aldrich C6158
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Toxic and carcinogenic
DEAE-Dextran Sigma-Aldrich D9885
DMEM ThermoFisher Scientific (Gibco) 11995065
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher Scientific (HyClone)) SV30160.03
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Toxic and carcinogenic
L-Glutamine ThermoFisher Scientific (Gibco) 25030081
Lipofectamine 2000 ThermoFisher Scientific (Invitrogen) 11668019 Transfection reagent
Nonessential amino acids ThermoFisher Scientific (Gibco) 11140035
Opti-MEM I Reduced Serum Medium ThermoFisher Scientific (Gibco) 31985070 Transfection medium
Pan-flavivirus E protein mAb 4G2 BEI Resources NR-50327
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710-S Toxic and carcinogenic
PBS ThermoFisher Scientific (Gibco) 14190144
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher Scientific (Gibco) 15140122
ProLong Gold Antifade Reagent ThermoFisher Scientific (Invitrogen) P10144
Triton-X-100 Sigma-Aldrich T8787
Vectastain ABC Kit Vector Laboratories Inc PK-4010 Avidin/biotin-based peroxidase kit
Vero Cells ATCC CCL-81
ZIKV E Protein mAb 1176-56 BioFront Technologies BF-1176-56
3. Equipment
Agarose Gel Electrophoresis System Bio-Rad 1704468 Other commercial sources are acceptable
Class II Biosafety CO2 Cabinet Varies N/A Other commercial sources are acceptable
Desktop Refrigrated Centrifuge Varies N/A
Fluorescence Microscope Varies N/A
High-Speed Refrigrated Centrifuge Varies N/A
MicroPulser Electroporator Bio-Rad 1652100 Other machines are acceptable
SimpliAmp Thermal Cycler ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) A24811 Other machines are acceptable
Vortexer Varies N/A
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Friedrich, M. J. WHO Calls Off Global Zika Emergency. JAMA. 317 (3), 246 (2017).
  2. Sirohi, D., et al. The 3.8 Å resolution cryo-EM structure of Zika virus. Science. 352 (6284), 467-470 (2016).
  3. Lindenbach, B. D., Murray, C. J., Thiel, H. J., Rice, C. M., Knipe, D. M., Howley, P. M. Flaviviridae. Fields Virology. , 712-748 (2013).
  4. Boeuf, P., Drummer, H. E., Richards, J. S., Scoullar, M. J., Beeson, J. G. The global threat of Zika virus to pregnancy: epidemiology, clinical perspectives, mechanisms, and impact. BMC Medicine. 14 (1), 112 (2016).
  5. Simpson, D. I. Zika virus infection in man. Transactions of The Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
  6. Campos, G. S., Bandeira, A. C., Sardi, S. I. Zika Virus Outbreak, Bahia, Brazil. Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1885-1886 (2015).
  7. Cao-Lormeau, V. M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
  8. Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: Early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
  9. Costello, A., et al. Defining the syndrome associated with congenital Zika virus infection. Bulletin of the World Health Organization. 94 (6), 406-406A (2016).
  10. Cugola, F. R., et al. The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature. 534 (7606), 267-271 (2016).
  11. do Rosario, M. S., et al. Guillain-Barre Syndrome After Zika Virus Infection in Brazil. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 95 (5), 1157-1160 (2016).
  12. Miner, J. J., et al. Zika Virus Infection during Pregnancy in Mice Causes Placental Damage and Fetal Demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
  13. Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. The New England Journal of Medicine. 374 (10), 951-958 (2016).
  14. Li, D., Aaskov, J., Lott, W. B. Identification of a cryptic prokaryotic promoter within the cDNA encoding the 5′ end of dengue virus RNA genome. PLOS ONE. 6 (3), e18197 (2011).
  15. Aubry, F., Nougairede, A., Gould, E. A., de Lamballerie, X. Flavivirus reverse genetic systems, construction techniques and applications: a historical perspective. Antiviral Research. 114, 67-85 (2015).
  16. Pu, S. Y., et al. Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes. Journal of Virology. 85 (6), 2927-2941 (2011).
  17. Ruggli, N., Rice, C. M. Functional cDNA clones of the Flaviviridae: strategies and applications. Advances in Virus Research. 53, 183-207 (1999).
  18. Avila-Perez, G., Nogales, A., Martin, V., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. Reverse Genetic Approaches for the Generation of Recombinant Zika Virus. Viruses. 10 (11), (2018).
  19. Annamalai, A. S., et al. Zika Virus Encoding Nonglycosylated Envelope Protein Is Attenuated and Defective in Neuroinvasion. Journal of Virology. 91 (23), (2017).
  20. Shan, C., et al. An Infectious cDNA Clone of Zika Virus to Study Viral Virulence Mosquito Transmission, and Antiviral Inhibitors. Cell Host & Microbe. 19 (6), 891-900 (2016).
  21. Liu, Z. Y., et al. Characterization of cis-Acting RNA Elements of Zika Virus by Using a Self-Splicing Ribozyme-Dependent Infectious Clone. Journal of Virology. 91 (21), (2017).
  22. Schwarz, M. C., et al. Rescue of the 1947 Zika Virus Prototype Strain with a Cytomegalovirus Promoter-Driven cDNA Clone. mSphere. 1 (5), (2016).
  23. Tsetsarkin, K. A., et al. A Full-Length Infectious cDNA Clone of Zika Virus from the 2015 Epidemic in Brazil as a Genetic Platform for Studies of Virus-Host Interactions and Vaccine Development. MBio. 7 (4), (2016).
  24. Deng, C. L., et al. Recovery of the Zika virus through an in vitro ligation approach. Journal of General Virology. 98 (7), 1739-1743 (2017).
  25. Widman, D. G., et al. A Reverse Genetics Platform That Spans the Zika Virus Family Tree. mBio. 8 (2), (2017).
  26. Munster, M., et al. A Reverse Genetics System for Zika Virus Based on a Simple Molecular Cloning Strategy. Viruses. 10 (7), (2018).
  27. Zhao, F., et al. Negligible contribution of M2634V substitution to ZIKV pathogenesis in AG6 mice revealed by a bacterial promoter activity reduced infectious clone. Scientific Reports. 8 (1), 10491 (2018).
  28. Atieh, T., Baronti, C., de Lamballerie, X., Nougairede, A. Simple reverse genetics systems for Asian and African Zika viruses. Scientific Reports. 6, 39384 (2016).
  29. Gadea, G., et al. A robust method for the rapid generation of recombinant Zika virus expressing the GFP reporter gene. Virology. 497 (Supplement C), 157-162 (2016).
  30. Weger-Lucarelli, J., et al. Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone. Journal of Virology. 91 (1), (2017).
  31. Setoh, Y. X., et al. De Novo Generation and Characterization of New Zika Virus Isolate Using Sequence Data from a Microcephaly Case. mSphere. 2 (3), (2017).
  32. Marquez-Jurado, S., et al. An Alanine-to-Valine Substitution in the Residue 175 of Zika Virus NS2A Protein Affects Viral RNA Synthesis and Attenuates the Virus In Vivo. Viruses. 10 (10), (2018).
  33. Cheng, B. Y. H., Ortiz-Riaño, E., de la Torre, J. C., Martínez-Sobrido, L. Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  34. Wang, K., Boysen, C., Shizuya, H., Simon, M. I., Hood, L. Complete nucleotide sequence of two generations of a bacterial artificial chromosome cloning vector. BioTechniques. 23 (6), 992-994 (1997).
  35. Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (18), 8794-8797 (1992).
  36. Usme-Ciro, J. A., Lopera, J. A., Enjuanes, L., Almazan, F., Gallego-Gomez, J. C. Development of a novel DNA-launched dengue virus type 2 infectious clone assembled in a bacterial artificial chromosome. Virus Research. 180, 12-22 (2014).
  37. Almazan, F., et al. Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5516-5521 (2000).
  38. Balint, A., et al. Molecular characterization of feline infectious peritonitis virus strain DF-2 and studies of the role of ORF3abc in viral cell tropism. Journal of Virology. 86 (11), 6258-6267 (2012).
  39. St-Jean, J. R., et al. Recovery of a neurovirulent human coronavirus OC43 from an infectious cDNA clone. Journal of Virology. 80 (7), 3670-3674 (2006).
  40. Almazan, F., et al. Construction of a severe acute respiratory syndrome coronavirus infectious cDNA clone and a replicon to study coronavirus RNA synthesis. Journal of Virology. 80 (21), 10900-10906 (2006).
  41. Almazan, F., et al. Engineering a replication-competent, propagation-defective Middle East respiratory syndrome coronavirus as a vaccine candidate. mBio. 4 (5), e00650-e00613 (2013).
  42. Jamsai, D., et al. Targeted modification of a human beta-globin locus BAC clone using GET Recombination and an I-Scei counterselection cassette. Genomics. 82 (1), 68-77 (2003).
  43. Lee, E. C., et al. A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA. Genomics. 73 (1), 56-65 (2001).
  44. Tischer, B. K., von Einem, J., Kaufer, B., Osterrieder, N. Two-step red-mediated recombination for versatile high-efficiency markerless DNA manipulation in Escherichia coli. BioTechniques. 40 (2), 191-197 (2006).

Tags

Zika VirusReverse GeneticsBacterial Artificial ChromosomeCDNA CloneInfectious CloneRNA VirusFlavivirusViral BiologyViral PathogenesisVaccine DevelopmentTransfectionVero Cells

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Ávila-Pérez, G., Park, J., Nogales, A., Almazán, F., Martínez-Sobrido, L. Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone. J. Vis. Exp. (148), e59537, doi:10.3791/59537 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image