Le cellule t CD8⁺ convenzionali (t_CD8) giocano parti importanti nella sorveglianza immunitaria anticancro. Essi funzionano principalmente nella capacità dei linfociti T citolitici (CTLs) che riconoscono i peptidi antigeni specifici del tumore o associati (AGS) visualizzati all’interno della fessura chiusa delle principali molecole di classe I di istocompatibilità (MHC). I CTL completamente armati utilizzano il loro arsenale citotossico per distruggere le cellule maligne. Anticancro T_CD8 può essere rilevato in circolazione o anche all’interno di masse primarie e metastatiche di molti pazienti oncologici e animali tumorali. Tuttavia, sono spesso anergici o esausti e non riescono a sradicare il cancro. Pertanto, molte modalità immunoterapeutiche sono progettate per aumentare le frequenze T_CD8 anticancro e per ripristinare e potenziare le loro funzioni.

Le proteine tumorali ospitano molti peptidi, alcuni dei quali possono essere immunogenici e potenzialmente immunoprotettivi. Tuttavia, le risposte T_CD8 quantificabili sono suscitate con magnitudini variabili contro pochi peptidi solo. Questo crea una “gerarchia di immunodominanza” tra i cloni T_CD8 ¹. Di conseguenza, immunodominante (ID) T_CD8 occupano prominenti ranghi gerarchici, che è comunemente giudicato dalla loro abbondanza. Al contrario, le cellule T_CD8 il cui recettore delle cellule t (TCR) è specifico per gli epitopi SUBDOMINANTI (SD) si verificano nelle frequenze più basse. Noi e altri abbiamo identificato alcuni dei fattori che dettano o plasmano l’immunodominanza nelle risposte T_CD8 . Questi includono, tra gli altri, la modalità di presentazione AG a naïve T_CD8 (cioè, presentazione diretta, cross-presentazione, cross-dressing)^2,3,4, il tipo di cellule presentanti AG (APCs) partecipando all’attivazione T CD8⁵, l’abbondanza e la stabilità delle proteine AGS^6,7 e l’efficienza e la cinetica del loro degrado da parte dei proteasomi^7,8, il selettività relativa del trasportatore associato alla lavorazione AG (TAP) per i peptidi⁹, l’affinità dei peptidi liberati per le molecole MHC I^9,10, la presenza, le frequenze dei precursori e la diversità di TCR di imparentata t_CD8 in pool di cellule t¹¹,¹²,¹³, Cross-Competition tra le cellule t per l’accesso a APCs^14,15, e la capacità fratricida di t_CD8 cloni¹⁶. Inoltre, l’immunodominanza T_CD8 è sottoposto a meccanismi immunoregolanti mediati da diversi tipi di cellule soppressori, come le cellule t (nTreg) regolatorie naturali (n)¹⁷, la molecola co-inibitoria della superficie cellulare programmata morte-1 (PD-1)¹⁶, e alcuni enzimi intracellulari come indoleamine 2, 3-diossigenasi (ido)¹⁸ e l’obiettivo dei mammiferi della rapamicina (mTOR)¹⁹. È importante notare, tuttavia, che i fattori di cui sopra non sempre completamente conto per l’immunodominanza.

Oltre alla biologia di base dell’immunodominanza T_CD8 , l’esame di questo intrigante fenomeno ha importanti implicazioni nell’immunologia e immunoterapia del cancro. In primo luogo, uno stato ID non conferisce necessariamente su un determinato clone T_CD8 la capacità di prevenire l’iniziazione tumorale o progressione²⁰. Se e come ID e SD T_CD8 contribuiscono all’immunità antitumorale può dipendere dal tipo e l’entità di malignità e il sistema sperimentale impiegato. In secondo luogo, si ritiene che i cloni ID T_CD8 possano essere “troppo visibili” al sistema immunitario e, di conseguenza, più inclini ai meccanismi di tolleranza centrale e/o periferica^16,21. Terzo, i tumori eterogenei possono contenere cellule neoplastiche che evitano il rilevamento da molti, se non la maggior parte, CTLs visualizzando solo uno spettro ristretto di peptidi: MHC complessi. In queste circostanze, T_CD8 risposte di ampiezza insufficiente sono suscettibili di permettersi tali cellule tumorali un vantaggio di sopravvivenza, potenziando così la loro conseguenza²². È per le ragioni di cui sopra che molti vista immunodominanza come un ostacolo per la vaccinazione di successo T_CD8-based e terapie contro il cancro.

L’inoculo di topi C57BL/6 topi con il virus simian 40 (SV40)-cellule trasformate che esprimono grande tumore AG (T AG) fornisce un potente sistema preclinico per studiare l’immunodominanza T_CD8 . Questo modello offre diversi vantaggi. In primo luogo, gli epitopi peptidici di questa oncoproteina clinicamente rilevante sono ben caratterizzati in questo ceppo di topo²³ (tabella 1). In secondo luogo, T AG epitopi, che sono chiamati siti I, II/III, IV, e V, trigger T_CD8 risposte che sono sistematicamente disposti nel seguente ordine gerarchico: sito IV > > sito I ≥ sito II/iii > ≫ sito V. di conseguenza, il sito IV specifico T_CD8 montare la risposta più robusta a T AG. Al contrario, i siti I e II/III sono subdominanti e i T_CD8 specifici del sito V sono meno abbondanti e di solito rilevabili solo in assenza di reattività ad altri epitopi^23,24. In terzo luogo, la linea di cellule tumorali T AG⁺ utilizzata nel protocollo qui descritto, vale a dire C57SV cellule di fibrosarcoma, e quelle utilizzate nelle nostre indagini precedenti¹⁶,^{17,18,19 ,25,26}, sono trasformati con frammenti SV40 subgenomici²⁵. Pertanto, essi non sono in grado di assemblare e rilasciare SV40 virioni che potrebbero potenzialmente infettare host APCs. Inoltre, le cellule C57SV sono prive di molecole classiche costimulatorie come CD80 (B7-1), CD86 (B7-2) e CD137 ligando (4-1BBL)¹⁶. Gli attributi di cui sopra rendono queste linee ideali per l’esame dell’attivazione in vivo T_CD8 tramite cross-adescamento. L’adescamento incrociato è una via importante nell’indurre le risposte T_CD8 , in particolare quelle lanciate contro le cellule tumorali di origine non ematopoietica che non riescono a prime cellule T naïve direttamente²⁵.

Le frequenze e/o le funzioni antitumor T_CD8 possono essere monitorate dalla colorazione del TETRAMERO MHC I, dalla colorazione intracellulare per le citochine effettrici (ad es. interferone [IFN]-γ) o dalle molecole lisiche (ad es. perforina), dai dosaggi di immunospot (ELISPOT) collegati agli enzimi ed ex saggi di citotossicità in vivo. Sin dalla loro nascita negli anni novanta²⁷,²⁸, i saggi di uccisione in vivo di carbossilfluorite succinimidilestere (CFSE) hanno consentito la valutazione delle risposte citotossiche mediate da CTLs antivirali^{29,30 , 31}, antitumorale CTLs^16,32, cellule Natural Killer (NK)³³, cellule di Natural Killer T (iNKT) invarianti di glycolipid-reattivo³⁴, e pre-esistenti e de novo donatori specifici alloanticorpi²⁶. Pertanto, le loro applicazioni possono essere di interesse per un ampio pubblico, compresi ma non limitati a investigatori che lavorano nelle aree di immunologia e immunoterapia tumorale, immunità anti-patogeni, e la progettazione preventiva e terapeutica del vaccino.

Per valutare la citotossicità cellulare-mediata in scenari tipici, due popolazioni di splenociti ingenui che mostrano una AG irrilevante o una AG (s) cognata sono etichettate con due diverse dosi di CFSE, mescolate in numero uguale e iniettato in naïve (controllo) o killer topi che ospitano cellule. La presenza/assenza di ogni popolazione bersaglio viene quindi esaminata dalla citometria a flusso.

Abbiamo ottimizzato e impiegato i saggi di uccisione in vivo nei nostri studi sull’immunodominanza nelle risposte antivirali e antitumore T CD8^12,16,17. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per la valutazione simultanea di ID e SD T_CD8 risposte agli epitopi di t AG, che possono essere prontamente adottati per indagini simili in altri sistemi sperimentali. Forniamo anche risultati rappresentativi che dimostrano che la deplezione delle cellule nTreg e il blocco PD-1 possono migliorare selettivamente l’IDt_CD8-e la citotossicità indotta da SD t CD8, rispettivamente. Alla fine, discuteremo i molteplici vantaggi dei saggi di uccisione in vivo e di alcuni dei loro limiti intrinseci.