Enkele stap verrijking van een TAP-Tagged histone deacetylase van de gloeiende schimmel Aspergillus nidulans voor enzymatische activiteit assay

1. teelt van A. nidulans Entmateriaal voorbereidingNota: alle stappen behalve de incubatie zouden onder een laminaire stroom kabinet moeten worden uitgevoerd. Streak uit TAP spanning (bijv. TIB 32.12) van de glycerol voorraad (-80 °c) op glucose/XYLOSE minimum middel (GXMM; per liter: 10,0 g van glucose, 0,5 g van xylose, 10 ml van 1 M di-ammonium Tartrate oplossing, 20 ml van 50 × zoute oplossing [per liter: 26,0 g KCl, 26,0 g MgSO4 · 7 H2O, 76,0 g KH2po4, 1 ml chloroform], 1 ml 1.000 × Hutner spoorelementen8) met inbegrip van 1,5% (w/v) agar en de vereiste supplementen zoals beschreven door Todd et al. 20079. Incubeer voor 2 – 3 dagen bij 37 °C.Opmerking: TIB 32.1 bevat een rpdA:: tap Fusion gecontroleerd door een xylose-afleidbaar promotor, xylP(p)10. Dit is de reden waarom xylose is opgenomen in het bovenstaande recept. Weglaten xylose bij het kweken van stammen uitdrukken van constructen die niet onder xylP(p) controle. Bereid een steriele 1,5 mL centrifugebuis met 1,5 mL steriele conidial Suspension Solution (CSS; 0,9% (w/v) NaCl, 0,01% (v/v) polysorbaat 80). Natte een wegwerp inentings lijn in CSS, schraap van conidiën van de plaat van stap 1.1.1 en schort in de buis van stap 1.1.2 op. Overdracht 150 µ L elk van conidial opschorting aan 10 25 cm2 de cultuur kolven van de cel met opening GLB die GXMM agar met inbegrip van supplementen en 200 µ l van CSS bevat. Spreid de conidial suspensie in de kolven uit met een steriele inentings lus en broed de kolven bij 37 °C gedurende 2 – 3 dagen uit. Gebruik 10 mL CSS per kolf om de conidiën te oogsten. Giet de oplossing in een kolf, sluit de kolf stevig af met de meegeleverde schroefstop en schud de kolf krachtig. Na het bevochtigen van de schimmel oppervlak, volledig Schraap de resterende conidiën met een steriele inenting lus. Pass conidiën door 40 µm Cell Strainers geplaatst op een steriele 50 mL centrifugebuis en het verzamelen van de schorsing van vijf kolven in een buis. Centrifugeer de buis bij 1.000 × g voor 10 min. Decanteer de bovendrijvende en hersuspendeer de pellet in 10 mL CSS per tube. Verzamel beide schorsingen in een buis, spoel de lege buis met 40 mL van CSS, toe te voegen aan de schorsing, en centrifugeren zoals beschreven in stap 1.1.9. Decanteer de bovendrijvende en hersuspendeer de conidial pellet in 4 mL CSS. Bereid twee seriële 1:50 verdunningen van de conidial schorsing en bepaal het aantal conidiën in de resulterende 1:2, 500-verdunde schorsing met een tellende kamer zoals beschreven11. Groei en oogsten van mycelia Tijdens het werken onder een laminaire stromings kast, inoculeren een-liter kegelvormige kolven elk met 250 mL van GXMM met inbegrip van passende supplementen bij een dichtheid van 5 × 106 conidiën/ml en Incubeer bij 180 rpm bij 37 °c voor 14 – 16 h. Leg de kaasdoek in een trechter bovenop een kolf en filtreer de mycelia door het doek. Was kort met deioniseerde water. Verwijder zo veel mogelijk vocht door het knijpen van de mycelia gevangen in de kaasdoek tussen eerst de handen en vervolgens papieren handdoeken. Breng de gedroogde mycelia als platte vellen op een plastic bekertje met een schroefdeksel en flits bevriezen met vloeibare stikstof. Dit zorgt voor een hoge oppervlakte/volumeverhouding voor de volgende lyofilisatie proces. Bewaar de bevroren mycelia bij-80 °C voorafgaand aan lyofilisatie.Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken. Lyophilize de mycelia ‘s nachts. Stop het Vries-drogende proces wanneer de temperatuur van mycelia constant blijft (18 – 24 h). Verwijder de bekers en sluit onmiddellijk af met de meegeleverde schroef doppen.Opmerking: bij goed verzegeld, gelyofiliseerde mycelia kan worden opgeslagen voor meerdere weken op RT. 2. single-stap verrijking van TAP-Tagged HDAC (aangepast van Bayram et al. 2012)12 Voorbereiding van buffers en oplossingenNota: Voeg 2-mercaptoethanol (Stéphanie) en protease inhibitors toe aan buffers direct voorafgaand aan gebruik. Filter alle buffers die voor chromatografie door 0,22 µm nitrocellulose membranen worden gebruikt om introductie van onzuiverheden/verontreinigingen aan de chromatografie hars te vermijden. Instructies in de onderstaande stappen verwijzen naar de voorbereiding van 1 L van elke buffer. Store buffers bij 4 °C. De buffer van de extractie (B250): 250 mM NaCl, 100 mM tris-HCl pH 7,5 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM Stéphanie. Los 12,35 g van tris-HCl, 2,62 g van tris (vrije basis) op, en 13,2 g van NaCl in 800 mL van geioniseerd water en voeg 10 mL van een 10% (v/v) TX-100 oplossing toe. Controleer de pH bij RT en pas zo nodig aan op pH 7,5 met ofwel NaOH of HCl [5 M]. Maak tot 1 L en filtreer door een 0,22 µm nitrocellulose membraan. Voeg 35 µ L van Stéphanie per 100 mL buffer (5 mM eindconcentratie) direct voorafgaand aan het gebruik. Wassen buffer 250 (WB250): 250 mM NaCl, 40 mM tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM Stéphanie. Bereid WB250 voor zoals beschreven voor B250 (2.1.1) maar met 3,59 g van tris-HCl, en 2,08 g van tris (vrije basis). Wassen buffer 150 (WB150): 150 mM NaCl, 40 mM tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM Stéphanie. Bereid WB150 voor zoals beschreven voor B250 (2.1.1) maar met 3,59 g van tris-HCl, 2,08 g van tris (vrije basis), en 8,77 g van NaCl. TEV evenwicht buffer (TEB): 150 mM NaCl, 40 mM tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,5 mM EDTA, 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM Stéphanie. Zelfde als WB150, maar Voeg EDTA tot 0,5 mM uiteindelijke concentratie. TEV splijt buffer (TCB): 150 mM NaCl, 40 mM tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,5 mM EDTA, 0,1% (v/v) TX-100, 10% (v/v) glycerol, 5 mM Stéphanie. Bereid zoals beschreven in stap 2.1.1 met 3,59 g van tris-HCl, 2,08 g van tris (vrije basis), en 8,77 g van NaCl voor en voeg 100 mL van glycerol toe alvorens het volume aan 1 L aan te passen. 50 × proteaseremmer cocktail: Los 1 Tablet van een commercieel beschikbare cocktail van proteaseremmers in 1 mL water en op te slaan bij-20 ° c. TBS-T: 50 mM tris-HCl pH 7,6 (RT), 0,9% (w/v) NaCl, 0,1% (v/v) Polysorbaat 20. Bereid zoals beschreven in stap 2.1.1. Gebruik 6,06 g van tris-HCl, 1,40 g van tris (vrije basis), 9 g van NaCl, en 1 mL van Polysorbaat 20. 5 × LSB (Laemmli steekproef buffer): 315 mM tris-HCl pH 6,8 (RT), 25% (v/v) Stéphanie, 50% (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS, 0,05% (w/v) bromophenol blauw. Bereiding van eiwit extract Voeg 1,5 g van gelyofiliseerde mycelia en een slijpen bal in de slijpen pot van een bal molen.Opmerking: verse mycelia kan ook worden gebruikt. Droog de mycelia zo goed mogelijk voor het invriezen en zorg ervoor dat de slijp potten in vloeibare stikstof voor het slijpen van verse mycelia worden voorgekoeld. Grind mycelia tot poeder bij 25 Hz voor 30 s.Opmerking: in gevallen waar geen slijpmachine beschikbaar is, grind mycelia tot een poeder met behulp van een mortel en stamper, zoals beschreven door Bayram et al. 12. Breng mycelium poeder over naar een 15 mL centrifugebuis. Kantel de centrifugebuis met inbegrip van gemalen mycelia om latere mengen van mycelia met buffer mogelijk te maken. Voeg 6 mL ijskoude B250 met inbegrip van 1 × proteaseremmer cocktail per gram mycelium poeder en meng met een kleine spatel tot volledige homogenisering van de ruwe extract wordt bereikt. Bij het gebruik van verse mycelia, verwijzen naar Bayram et al. 12 om de juiste biomassa te bereiken voor de extractiebuffer ratio. Houd de buis op het ijs voor 5 minuten. Plaats de buis en een balans buis in een centrifuge en draai bij 40.000 × g voor ≥ 20 min bij 4 °c. Voer evenwicht van IgG hars (stap 2,3) tijdens de centrifuge. Na centrifugeren, verwijder 10 µ L van de bovendrijvende voor SDS-pagina analyse. Plaats het monster in een 1,5 mL buis met 40 µ L water en 12,5 µ L van 5 × LSB; “ex” genoemd in Figuur 1. Verwijder zorgvuldig de bovendrijvende (gewist lysate) met behulp van een serologische pipet en de overdracht op de kolom met de geëquilibreerd IgG kralen (stap 2.3) en strak dicht met behulp van de meegeleverde eind dop. Evenwicht van IgG-hars (uitgevoerd tijdens stap 2.2.7) Bereid een 10 mL wegwerp Chromatografiekolom en pipet 300 µ L van well-resuspended IgG hars (50% drijfmest) in de kolom. Vul de kolom in op 10 mL met B250 en laat de buffer door de zwaartekracht stromen. Voeg 1 mL B250 met inbegrip van 1 × proteaseinhibitor cocktail toe en laat doorstromen. Sluit de onderkant van de kolom. Batch reiniging van TAP-Tagged HDAC Incubeer de Chromatografiekolom met de geëquilibreerd kralen en de ontruimde lysate van stap 2.2.9 op een roterende mixer bij 10 rpm bij 4 °C voor 2 – 4 h. Na de batch bindend, verwijder de dop en open de kolom aan de onderkant van de flow-through te verzamelen. Neem een steekproef voor SDS-pagina analyse zoals die in stap 2.2.8 wordt beschreven; aangeduid als “FT” in Figuur 1. Was kralen met 10 mL WB250. Gebruik eerst 1 mL buffer om opgesloten kralen uit de kolom dop te verwijderen met behulp van een pipetter en breng deze suspensie in één flush over op het vaste hars zodat de kralen opnieuw kunnen worden geschorst. Dan vul de kolom naar de top, sluiten met behulp van een stack Cap en maak verbinding met een peristaltische pomp. Stel een debiet van ca. 1 – 5 mL/min. voorkomen dat de hars droog loopt. Herhaal stap 2.4.4 drie maal voor een totaal van vier wasbeurten met WB250. Was de kralen drie maal met 10 mL TEB zoals beschreven in stap 2.4.4. Sluit de Chromatografiekolom aan de onderkant, opnieuw op te schorten IgG kralen in 1 mL van TCB, en Voeg 20 µl van 50 × proteaseremmer cocktail evenals 10 µ l van TeV (~ 1 mg/ml voorraad, S219V Mutant variant geproduceerd in-House). Cap de kolom en incubeer op een roterende mixer bij 10 rpm bij 4 ° c ‘s nachts te elueer de eiwitcomplexen gebonden via de gecodeerde HDAC.Opmerking: als alternatief uit te voeren TEV Digest bij verhoogde temperatuur (16-25 ° c), die de reactietijd vermindert, echter, is het verhogen van het risico van eiwit degradatie. Op de volgende dag open de kolom en het verzamelen van de eluaat in een 2 mL centrifugebuis. Gebruik 0,7 mL TCB om kralen uit de dop te verwijderen en de wand van de kolom te spoelen. Plaats de kolom op de open 2 mL buis van de vorige stap die zelf is geplaatst binnen een 50 mL centrifugebuis. Breng deze montage in een tafelblad centrifuge en draai bij 300 × g voor 2 min. Dit is de TEV eluaat.Opmerking: gebruik bij het uitvoeren van de tandem affiniteit zuivering de TEV eluaat als input voor de calmodulin affiniteit stap. U ook splitsen de TEV eluaat en gebruik een deel voor HDAC activiteit bepaling en het tweede deel aan de TAP zuivering te voltooien. Verwijder 50 µ L van TEV eluaat en voeg 12,5 µ L van 5 × LSB voor SDS-pagina toe (die als “TE” in cijfers 1 en 2wordt bedoeld) en houd de resterende eluaat op ijs. Om de werkzaamheid van protease elutie te beoordelen, voegt u 2 mL 5% (v/v) azijnzuur toe en Incubeer bij RT gedurende 5 min. Nogmaals, gebruik de eerste mL om de hars opnieuw op te schorten. Verzamel de zure eluaat en opnieuw nemen 50 µ L monster en voeg 12,5 µ L van 5 × LSB (aangeduid als “AE” in Figuur 1). LSB zal geel worden wanneer toegevoegd aan de zure oplossing. Om het zuur te neutraliseren, voeg 10 M NaOH in stappen van 1 µ L toe en meng goed tot de kleur in blauw opnieuw verandert. Re-equilibrate de IgG hars met TBS-T om het zuur te neutraliseren. Bewaar de hars in TBS-T/20% (v/v) ethanol bij 4 °C voor hergebruik met dezelfde gelabelde eiwitten. Opslag van elutie fracties Hoeveelheid van de eluaat in ~ 100 µ L fracties, om meerdere Freeze-dooi cycli te voorkomen. Bevriezen van de hoeveelheid vloeibare stikstof en houd bij-80 °C.Opmerking: monsters opgeslagen op deze manier zal stabiel zijn voor maanden zonder verlies van enzymatische activiteit. 3. analyse van reiniging door SDS-pagina en het westelijke bevlekken Gebruik standaardprotocollen voor het gieten van SDS-Polyacrylamide gels of gebruik precast gels13. Denature gel monsters van de vorige sectie bij 95 ° c voor 5 min, centrifuge op ≥ 15.000 × g voor 5 min, en de belasting op 12% gels. Aanbevolen laad volumes worden gegeven in de legende van Figuur 1. Electrophorese de monsters in 1 × tris-Glycine SDS-pagina Running buffer op 180 V constante voor 60 – 70 min, totdat de bromophenol Blauwe marker van de SDS-pagina laden buffer begint te migreren uit de gel. Gebruik standaardprotocollen voor zilver kleuring van de gels. Gebruik bijvoorbeeld het Protocol van Blum et al. 198714 dat is ook compatibel met MS Analysis. Gebruik standaardprotocollen voor het westelijke bevlekken15. Voor de generatie van representatieve resultaten hieronder, werd een commercieel beschikbare Bevlekkende systeem gebruikt. Sonde vlekken met in de handel verkrijgbare anti-calmodulin bindende proteïne (anti-CBP) antilichaam in 5% (w/v) melkpoeder in TBS-T bij 4 °C ‘s nachts.Opmerking: anti-CBP antilichaam is gericht tegen het deel van de TAP-tag nog steeds aanwezig na TEV splitsing. Gebruik standaardprotocollen voor opsporing en ontwikkeling van blots. Bijvoorbeeld, anti-Rabbit IgG-alkaline fosfatase geconjugeerde en een BVIE/NBT kleurontwikkeling substraat werden gebruikt voor de generatie van representatieve resultaten hieronder. 4. deacetylase assay met behulp van in vitro [3H] acetaat-gelabelde kip reticulocyte histonen (aangepast van Trojer et al. 2003)4 Refereer naar het Protocol van Kölle et al. 199816 voor de bereiding van [3H] acetaat-gelabelde kip reticulocyte histonen. Per test voorwaarde plaats drie 1,5 mL centrifuge buizen op ijs voor metingen in triplo. Ook voor te bereiden drie buizen voor buffer-only achtergrond controle. Zet 25 µ L van WB150 in elke buis en voeg 25 µ L van de TEV eluaat van stap 2.4.11 en houden op ijs. Verwarm een buis incubator voor op 25 °C. Gebruik 15 s intervallen (Stopwatch) voor de toevoeging van 10 µ L van gelabelde histonen [1,5 mg/mL] aan elke buis. Voordat u begint met de Assay, nemen 10 µ L van de [3H] acetaat-label kip histonen en start de stopwatch. Vijf seconden na de start, voeg de gelabelde histonen, sluit de buis stevig, Vortex, en zet het in de incubator. Gebruik 15 s intervallen voor de toevoeging van 10 µ L van gelabelde histonen en ga verder zoals beschreven in de vorige stap. Na 60 min incubatie toe te voegen 50 µ L van stop oplossing (1 M HCl/0.4 M azijnzuur) aan elke buis in 15 s intervallen; Vortex onmiddellijk. Na de toevoeging van de zure oplossing, de assay mix is stabiel en kan worden gehouden op RT tot de volgende stap. Voeg 800 µ L van ethylacetaat aan elke buis toe om het vrijgegeven [3H] azijnzuur te halen. Sluit de tubes en Vortex elke tube voor 5 s. Plaats de buis in een micro centrifuge en draai bij 10.000 × g voor 10 min bij RT. In de tussentijd, bereiden een fonkeling flacon per assay monster en voeg 3 mL fonkeling cocktail voor hydrofobe monsters. Na centrifugeren (stap 2,12), voorzichtig overdracht 600 µ L van de bovenste organische fase naar de geprepareerde fonkeling buizen en sluit de buizen stevig. Meet de radioactiviteit die overeenkomt met de HDAC activiteit in een vloeibare fonkeling teller.