La neuromodulación, también conocida como transmisión sináptica lenta, impone un fuerte control sobre la función cerebral durante diferentes estados conductuales, como el estrés, la excitación, la atención y la locomoción^{1,2,3, 4}. A pesar de su importancia, el estudio de cuándo y dónde tienen lugar los eventos neuromoduladores todavía está en su infancia. Neuromoduladores, incluyendo acetilcolina, dopamina, noradrenalina, serotonina, y muchos neuropéptidos, activar los receptores acoplados a la proteína G (GPCRs), que a su vez desencadenan las segundas vías mensajeras intracelulares con una amplia ventana de escalas de tiempo que van de segundos a horas. Mientras que cada neuromodulador desencadena un conjunto distinto de eventos de señalización, la vía de la quinasa de campo/proteína A (PKA) es una vía descendente común para muchos neuromoduladores^1,5. La vía del campo/PKA regula la excitabilidad neuronal, latransmisión sináptica y la plasticidad 6,^7,8,9y, por lo tanto, ajusta la dinámica de la red neuronal. Debido a que diferentes neuronas o tipos neuronales expresan diferentes tipos o niveles de receptores neuromoduladores¹⁰, los efectos intracelulares del mismo neuromodulador extracelular pueden ser heterogéneos a través de diferentes neuronas, y por lo tanto, tienen que ser estudiado con resolución celular. Hasta la fecha, sigue siendo difícil monitorear eventos neuromoduladores en neuronas individuales in vivo durante el comportamiento.

Para estudiar la dinámica espaciotemporal de la neuromodulación, se requiere una modalidad de grabación adecuada. La microdiálisis y la voltammetría cíclica de exploración rápida se utilizan con frecuencia para estudiar la liberación de neuromoduladores, pero carecen de la resolución espacial para monitorear los eventos celulares^11,12. Análoga a la dinámica de calcio que se utiliza como un proxy para la actividad eléctrica neuronal en la población por imágenes¹³, la imagen PKA se puede utilizar para leer eventos neuromoduladores a través de una población neuronal a resolución celular. El presente protocolo describe el uso de un reportero mejorado de actividad A-quinasa (AKAR) para monitorear las actividades de PKA in vivo durante el comportamiento animal. El método descrito aquí permite la toma simultánea de imágenes de poblaciones neuronales a resolución subcelular con una resolución temporal que realiza un seguimiento de los eventos neuromoduladores fisiológicos.

Los AKARs están compuestos por un donante y un aceptador de proteínas fluorescentes vinculadas por un péptido de sustrato de fosforilación PKA y un dominio asociado a la cabeza de horquilla (FHA) que se une a la serina fosforilada o trionina del sustrato^14,15. Tras la activación de la vía PKA, el péptido de sustrato de AKAR se fosforila. Como resultado, el dominio FHA se une al péptido de sustrato fosforilado, lo que acerca a los dos fluoróforos, denominado salente el estado cerrado de AKAR. El estado cerrado de un AKAR fosforilado da lugar a un aumento de la transferencia de energía por resonancia de Farster (FRET) entre el donante y los fluoróforos del donante y del aceptador. Dado que la proporción de AKARs fosforilados está relacionada con el nivel de actividad de PKA¹⁶, la cantidad de FRET en una muestra biológica se puede utilizar para cuantificar el nivel de actividad de PKA^{16,17,18, 19,20}.

Las primeras versiones de los AKARs se diseñaron principalmente para imágenes de dos colores ratiométricas^14. Al obtener imágenes más profundas en el tejido cerebral, el método ratiométrico sufre de distorsión de la señal debido a la dispersión de luz dependiente de la longitud de onda^17,18,21. Como se explica a continuación, la microscopía por imágenes de por vida de fluorescencia (FLIM) elimina este problema porque FLIM solo mide los fotones emitidos por el fluoróforo^18,21. Como resultado, la cuantificación FLIM de FRET no se ve afectada por la profundidad tisular¹⁷. Además, se puede utilizar una variante “oscura” (es decir, bajo rendimiento cuántico [QY]) del fluoróforo del aceptador. Esto libera un canal de color para facilitar la medición multiplexada de propiedades neuronales ortogonales a través de imágenes simultáneas de un segundo sensor o un marcador morfológico^17,19,20.

Las imágenes FLIM cuantifican el tiempo que un fluoróforo pasa en el estado excitado, es decir, la vida útil de la fluorescencia¹⁸. El regreso de un fluoróforo al estado de tierra, por lo tanto el final del estado excitado, a menudo conconcomita con la emisión de un fotón. Aunque la emisión de un fotón para una molécula excitada individual es estocástica, en una población la vida media de fluorescencia es una característica de ese fluoróforo en particular. Cuando una población pura de fluoróforos se excita simultáneamente, la fluorescencia resultante seguirá una sola decadencia exponencial. La constante de tiempo de esta decaimiento exponencial corresponde a la vida útil media de la fluorescencia, que normalmente oscila entre uno y cuatro nanosegundos para las proteínas fluorescentes. El regreso de un fluoróforo de donante excitado al estado de tierra también puede ocurrir por FRET. En presencia de FRET, se reduce la vida útil de fluorescencia del fluoróforo del donante. Los AKARs sin fosforilar exhiben una vida útil de fluorescencia de donante relativamente más larga. Tras la fosforilación por PKA, el sensor exhibe una vida útil más corta porque los fluoróforos del donante y del aceptador se acercan entre sí y se incrementa el FRET. Por lo tanto, la cuantificación de la vida útil de la fluorescencia en una población de AKARs representa el nivel de actividad de PKA.

Las primeras versiones de los AKARs no se han utilizado con éxito para imágenes in vivo con resolución de una sola célula. Esto se debe principalmente a la baja amplitud de la señal de los sensores AKAR a las activaciones fisiológicas¹⁷. Recientemente, al comparar sistemáticamente los sensores AKAR disponibles para la microscopía de imágenes de por vida de fluorescencia de dos fotones (2pFLIM), se descubrió que un sensor llamado FLIM-AKAR supera a los sensores alternativos. Además, se desarrollaron una serie de variantes FLIM-AKAR llamadas AKARs (tAKARs) específicas para visualizar la actividad de PKA en ubicaciones subcelulares específicas: microtúbulos (tAKAR), citosol (tAKAR), actina (tAKAR), actina filamentosa (tAKAR), membrana (tAKAR), y la densidad postsináptica (tAKAR). Entre los tAKAR, el tAKAR aumentó la amplitud de la señal provocada por la noradrenalina en 2,7 veces. Esto es consistente con el conocimiento de que la mayoría de PKA en las neuronas están ancladas a microtúbulos en el estado de reposo^22,23. tAKAR fue el mejor intérprete entre los AKAR existentes para 2pFLIM. Además, el tAKAR detectó actividad de PKA fisiológicamente relevante provocada por múltiples neuromoduladores, y la expresión de tAKAR no alteró las funciones neuronales¹⁷.

Recientemente, tAKAR se utilizó con éxito para visualizar las actividades de PKA en ratones de afeitar fijos^17. Se demostró que la locomoción forzada desencadenó la actividad de PKA en el soma de las neuronas de capa superficial (capa 1 a 3, hasta una profundidad de 300 m de pia) en el motor, barril y cortices visuales. La actividad de PKA desencadenada por la locomoción dependía en parte de la señalización a través de receptores adrenérgicos y receptores de dopamina D1, pero no fue afectada por un antagonista del receptor de dopamina D2. Este trabajo ilustra la capacidad de los tAKARs para rastrear eventos de neuromodulación in vivo usando 2pFLIM.

En el protocolo actual, todo el método para la creación de imágenes de actividad PKA en ratones despiertos fijos durante un paradigma de locomoción forzado se describe en seis pasos. En primer lugar, la adición de capacidades 2pFLIM a un microscopio convencional de dos fotones (Figura1). En segundo lugar, la construcción de una cinta de correr motorizada (Figura2). En tercer lugar, la expresión del sensor tAKAR en la corteza del ratón por la electroporación utero (IUE) de los plásmidos de ADN, o la inyección estereotaxcócica del virus asociado al adeno (AAV). Se han publicado previamente excelentes protocolos para cirugías para IUE^24,25 e inyección estereotaxia de partículas virales^26. Los parámetros clave que utilizamos se describen a continuación. En adelante, la instalación de una ventana craneal. Excelentes protocolos han sido publicados previamente para la cirugía de ventana craneal^27,28. Se describen varios pasos que se han modificado desde los protocolos estándar. Quinto, actuando in vivo 2pFLIM. En sexto lugar, los análisis de imágenes 2pFLIM (Figura3 y Figura 4). Este enfoque debe ser fácilmente aplicable a muchos otros paradigmas de comportamiento fijos en la cabeza y áreas cerebrales.