原子吸纳光谱测量哺乳动物细胞细胞内锌池

过渡和重金属, 如锌、铜、锰和铁, 在食物和污染物的营养物质中都是天然存在的。所有生物都需要不同数量的这些微量营养素;然而, 暴露在高水平是有害的生物。金属采集主要是通过饮食, 但金属也可以通过皮肤^吸入或吸收 1^{,2,3, 4,5}。必须指出, 大气颗粒中金属的存在正在增加, 在很大程度上与健康风险有关。由于人为活动, 在大气颗粒物、雨水和土壤⁶、7中检测到银、砷、镉、铬、汞、镍、铁和铅等重金属含量的增加。这些金属有可能与基本的生理微量元素竞争, 特别是锌和铁, 它们通过使生物过程中的基本酶失活而产生毒性效应。

微量元素锌是氧化还原中性的, 在生物反应中表现为刘易斯酸, 这使得它成为超过10% 的哺乳动物蛋白 8^{, 9 的蛋白质折叠和催化活性所必需的基本辅因子。10};因此, 它是必要的, 为不同的生理功能^8,11。然而, 像许多微量元素一样, 这些金属之间存在着微妙的平衡, 促进了正常的生理功能并产生毒性。在哺乳动物中, 锌缺乏症会导致贫血、发育迟缓、性腺功能低下、皮肤异常、腹泻、脱发、味觉障碍、慢性炎症以及免疫和神经功能受损¹¹、^{12、 13,14,15,16,17,18}。锌过量, 具有细胞毒性, 会损害铜^{19、20、21 等}其他基本金属的吸收。

此外, 铜、铁等一些金属有可能参与有害反应。通过芬顿化学生产活性氧 (ros) 会干扰铁硫簇蛋白的组装, 改变 22^{, 23,24}的脂质代谢^.为了防止这种损害, 细胞利用金属结合的伴侣和转运体来防止毒性的影响。毫无疑问, 必须严格控制金属的稳态, 以确保特定的细胞类型保持适当水平的金属。因此, 非常需要改进准确测量生物样品中微量金属的技术。在发育中的生物体和成熟的生物体中, 在细胞水平、不同的发育阶段以及正常和病理条件下对微量元素的生物需求存在差异。因此, 精确测定组织和全身金属水平是必要的, 以了解组织金属的稳态。

石墨炉原子吸收光谱法 (gf-aas) 是一种高度敏感的技术, 用于小样本量, 使其成为测量生物和环境样品中存在的过渡和重金属的理想选择^25,26,27,28. 此外, 由于该技术的灵敏度高, 已被证明适合于研究钠⁺+ atpase 和胃 h⁺/k +-atpase^的优良输运特性。卵母细胞作为模型系统²⁹。在 GF-AAS 中, 样品中的雾化元素吸收含有感兴趣金属的光源发出的辐射波长, 吸收的辐射与元素的浓度成正比。元素电子激发是在吸收紫外线或可见光辐射时进行的, 过程对每个化学元素来说都是独一无二的。在单个电子过程中, 光子的吸收涉及一个电子从较低的能级移动到原子内的较高能级, 而 GF-AAS 决定了样品吸收的光子的数量, 这与辐射吸收的数量成正比元素在石墨管中雾化。

这种技术的选择性依赖于原子的电子结构, 其中每个元素都有一个特定的吸收/发射谱线。在锌的情况下, 吸收波长为23.9 纳米, 可以与其他金属精确区分。总体而言, GF-AAS 可用于量化具有足够的检测极限 (LOD) 和高灵敏度^{和选择性25的}锌。吸收波长的变化是积分的, 并表现为特定波长和孤立波长的能量吸收峰。根据啤酒-兰伯特定律, 在给定样品中锌的浓度通常是根据已知浓度的标准曲线计算的, 在该曲线中, 吸收率与样品中锌的浓度成正比。然而, 将啤酒-兰伯特方程应用于 GF-AAS 分析也存在一些复杂问题。例如, 样品的雾化和/或非均质浓度的变化会影响金属测量。

GF AAS 痕量元素分析所需的金属雾化由三个基本步骤组成。第一步是脱盐, 液体溶剂被蒸发;在熔炉达到约100°c 的温度后留下干燥的化合物。然后, 化合物通过加热从800到 1, 400°c (取决于要分析的元素) 蒸发, 并成为气体。最后, 在气态的化合物被雾化的温度范围从1500到 2, 500°c。如上所述, 感兴趣的金属的浓度的增加将使 GF-AAS 检测到的吸收成比例增加, 但熔炉减少了动态分析范围, 即可以是浓度的工作范围。由仪器确定。因此, 该技术需要低浓度和通过确定啤酒-兰伯特定律的 LOD 和线性极限 (LOL) 来仔细确定该方法的动态范围。LOD 是检测物质所需的最小数量, 定义为矩阵中锌标准偏差的三倍。LOL 是使用啤酒-兰伯特定律可以检测到的最大浓度。

在这项工作中, 我们描述了一个标准的方法来分析锌在整个细胞提取物, 细胞质和核分裂, 以及在增殖和分化培养细胞中的水平 (图 1)。我们将原子核协议的快速隔离调整到不同的细胞系统中, 以防止样品制备过程中的金属损失。所使用的细胞模型有来自小鼠卫星细胞的原代成肌细胞、小鼠神经母细胞 (N2A 或 Neuro2A)、小鼠 3T3 L1 脂肪细胞、人类非致瘤乳房上皮细胞 (MCF10A) 和马丁-达比犬肾上皮 (单元格。这些细胞是从不同的谱系建立的, 是研究体外金属水平的谱系特异性变化的良好模型。

从小鼠卫星细胞中提取的原代成肌细胞构成了一个非常适合的体外模型来研究骨骼肌的分化。在高血清条件下培养时, 这些细胞的增殖速度很快。然后, 低血清条件30导致分化为肌肉谱系^.小鼠神经母细胞瘤 (N2A) 建立细胞系来源于小鼠神经冠。这些细胞呈现神经元和阿米巴状干细胞形态。在分化刺激时, N2A 细胞呈现神经元的几个特性, 如神经丝。N2a 细胞用于调查阿尔茨海默氏症、神经元生长和神经毒性^{31, 32,33}。3T3-l1 小鼠脂肪细胞前建立的细胞系通常用于研究与脂肪生成相关的代谢和生理变化。这些细胞呈现成纤维细胞样的形态, 但一旦刺激分化, 它们就会呈现与脂质合成和甘油三酯积累相关的酶激活。这可以观察到形态的变化, 产生细胞质脂滴 34^,35。MCF10A 是一种非肿瘤乳腺上皮细胞系, 来源于绝经前患有乳腺纤维囊性疾病的妇女 36.它已被广泛用于与乳腺癌有关的生化、分子和细胞研究, 如增殖、细胞迁移和侵袭。马丁-达比犬肾 (MDCK) 上皮细胞系已被广泛用于研究与建立上皮表型相关的性质和分子事件。到达融合后, 这些细胞变得极化, 并建立细胞粘连, 哺乳动物上皮组织的特点 37.

为了测试 AAS 测量哺乳动物细胞中锌含量的能力, 我们分析了这五个细胞系的整体和亚细胞分数 (细胞溶胶和细胞核)。AAS 测量显示, 在这些细胞类型中, 锌的浓度不同。在增殖和分化原代成肌细胞中, 浓度较低 (4 至 7 nmomg/mg), 在4个已建立的细胞系 (蛋白质含量从20到 40 nmomg/mg 不等) 中浓度较高。与增殖细胞相比, 在鉴别原代成肌细胞和神经母细胞瘤细胞时, 锌水平有少量不显著的增加。在分化的脂肪细胞中检测到相反的效果。然而, 增殖的3T3-l1 细胞表现出更高的浓度的金属相比分化的细胞。重要的是, 在这三个细胞系中, 亚细胞分馏表明, 根据细胞的代谢状态, 锌在细胞溶胶和细胞核中分布不同。例如, 在增殖成肌细胞、N2A 细胞和3T3-l1 前脂肪细胞中, 大部分金属被定位到细胞核。在使用特定细胞处理诱导分化时, 锌在这三种细胞类型中定位到细胞溶胶。有趣的是, 与达到融合时相比, 两个上皮细胞系在增殖过程中的锌含量都较高, 在融合处形成了一种特征紧密的单层。在增殖的上皮细胞中, 乳腺细胞系 MCF10A 在细胞溶胶和细胞核之间具有相等的锌分布, 而在肾源性细胞系中, 大部分金属位于细胞核内。在这两种细胞类型中, 当细胞到达汇合处时, 锌主要位于细胞溶胶上。这些结果表明, GF-AAS 是一种在低产量样品中进行元素分析的高度敏感和准确的技术。GF-AAS 与亚细胞分馏相结合, 可用于研究不同细胞系和组织中微量元素的水平。