Изоляция и количественная оценка клеток кисти от мыши Tracheas
Summary
Клетки кисти являются редкими холинергическими химиосенсорными эпителиальными клетками, встречаемыми в наивной трахееемышиной. Из-за их ограниченного числа, ex vivo оценки их функциональной роли в иммунитете дыхательных путей и ремоделирования является сложной задачей. Мы описываем метод изоляции клеток трахеальной кисти цитометрией потока.
Abstract
Клетки трахеальной кисти являются холинергическими химиосенсорными эпителиальными клетками, готовыми передавать сигналы из просвета дыхательных путей в иммунную и нервную системы. Они являются частью семейства химиосенсорных эпителиальных клеток, которые включают пучки клеток в слизистой оболочке кишечника, клетки кисти в трахеее, а также одиночные химиосенсорные и микровильные клетки в слизистой оболочке носа. Химиосенсорные клетки в различных эпителиальных отсеках имеют ключевые внутриклеточные маркеры и основную транскрипционную подпись, но также демонстрируют значительную транскрипционную неоднородность, вероятно отражающую местную тканевую среду. Изоляция клеток трахеальной кисти от одноклеточных суспензий требуется для детального определения функции этих редких эпителиальных клеток, но их изоляция является сложной задачей, потенциально из-за тесного взаимодействия между клетками трахеальной кисти и нервными окончаниями или из-за состава плотных и адополителей дыхательных путей. Здесь мы описываем процедуру изоляции клеток кисти от эпителия трахеи мыши. Метод основан на первоначальном отделении трахеального эпителия от субмукозы, что позволяет последующую более короткую инкубацию эпителиального листа папаном. Эта процедура предлагает быстрое и удобное решение для цитометрической сортировки потока и функционального анализа жизнеспособных клеток трахеальной кисти.
Introduction
Клетки кисти принадлежат к классу химиосенсорных эпителиальных клеток, характеризующихся выражением рецепторов горького вкуса и трансдукционного механизма вкусовых рецепторов, найденных в клетках вкусовых рецепторов. В отличие от вкусовых рецепторов, химиосенсорные эпителиальные клетки разбросаны по эпителиальным поверхностям и называются одиночными химиосенсорными клетками (SCCs) и микровилусовыми клетками в носовом эпителии1,2, клетками кисти в трахее 3,4, и пучка клеток в кишечнике5,6. Эпителиальные клетки, выражающие рецепторы горького вкуса и механизмы с переводом горького вкуса, также находятся в мочеиспускательном канале 7,8 и слуховой трубке9. Клетки кисти дыхательных путей имеют уникальные функции в нейрогенных и иммунных дыхательных путей реакции. Они ацетилхолина производства химиосенсорных клеток, которые вызывают защитные дыхательные рефлексы при активации с горькими соединениями и бактериальных метаболитов, как кворум зондирующих веществ10. Клетки кисти дыхательных путей также являются доминирующим эпителиальным источником IL-25, который регулируетвоспаление аэроаллергена 2 типа в дыхательных путях 3.
Характеристика полного транскриптома нижних клеток кисти дыхательных путей и их реакция на экологические раздражители была ограничена их низким числом в эпителии трахеи и очень ограниченное число за пределами больших бронхов10. Методы, используемые для изоляции химиосенсорных клеток от кишечного эпителия, не дали пропорционально высоких чисел от трахеи, возможно, из-за интимных контактов клеток трахеальной кисти с нервными окончаниями10 или других ткани конкретных факторов в дыхательной слизистой оболочки, таких как состав приверженцев и плотные белки соединения. Последние сообщения об успешной изоляции клеток трахеальной кисти в более высоких числах для одноклеточного анализа секвенирования РНК использовали либо 2 ч инкубации с папаин или 18 ч инкубации с pronase11,12. Поскольку более длительные инкубации с пищеварительными ферментами могут снизить жизнеспособность клеток и изменить транскрипционный профиль клеток из переваренных тканей13,это может предвзято сравнительный анализ с другими химиосенсорными эпителиальными популяциями.
Здесь мы сообщаем метод для изоляции клеток трахеи кисти для секвенирования РНК3. Лечение трахеи с высокодозной дезасе отделяет эпителий от субмукозы. Последующее переваривание эпителиального листа с папаином позволяет отлично восстановить эту структурную клетку.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы обнаружили, что сочетание высокодозного лечения диспазы в течение 40 минут с последующим коротким лечением папаина (30 мин) обеспечивает оптимальный протокол для пищеварения трахеи и изоляции клеток кисти. Эта комбинация позволяет избежать обширного пищеварения и производит наивысш…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Адама Чикиоэ (Adam Chicoine) из Бригама и женского центра иммунологии Flow Core за помощь в сортировке цитометрической сортировки потока. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения Гранты R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N.A.B), U19 AI095219 (N.A.B., L.G.B) и K08 AI132723 (L.G.B), а также Американской академией аллергии, астмы и иммунологии (AAAAI)/ Премия по респираторным заболеваниям (N.A.B.), лауреатом премии Фонда ААААИ (L.G.B.), премией молодых новаторов Стивена и Джуди Кайе (N.A.B.), Фондом Джойслин К. Остин для развития карьеры женщин-медиков (L.G.B.), а также премией щедрое пожертвование семьи Виник (L.G.B.).
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) | Abcam | cat# ab5450 | |
| APC anti-mouse CD326 (EpCAM) (G8.8) | Biolegend | cat#118214 | |
| APC Rat IgG2a, k isotype control | Biolegend | cat#400511 | |
| DAPI | Biolegend | cat#422801 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies/Molecular Probes | cat#A-11055 | |
| Normal Goat IgG | R&D Systems | cat#AB-108-C | |
| Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) | Biolegend | cat#103126 | |
| Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control | Biolegend | cat#400627 | |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | cat#101320 | |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| Dispase | Gibco | cat# 17105041 | |
| DNase I | Sigma | cat# 10104159001 | |
| HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter | Boston BioProducts | cat# PY-912 | |
| Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) | Boston BioProducts | cat# BSS-355 | |
| L-Cysteine | Sigma | cat# C7352 | |
| Leupeptin trifluoroacetate salt | Sigma | cat# L2023 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | cat# P3125 | |
| Propidium iodide | Sigma | cat# P4170 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) | The Jackson Laboratory | 7902 | |
| Equipment | |||
| LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope | Zeiss | ||
| LSRFortessa | BD | 647465 | |
| Disposable equipment | |||
| 1.5 mL sterile tubes | Thomas Scientific | 1157C86 | |
| 5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 x 75 mm style | Falcon | 14-959-1A | |
| 50 mL Polypropylene conical tube, 30 x 115 mm style | Falcon | 352098 | |
| Feather Disposable Scalpel no.12 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Petri dish, 100 x 15 mm Style | Falcon | 351029 | |
| Sterile cell strainer, 100 μm | Fisherbrand | cat#22363549 |
Referências
- Tizzano, M., et al. Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).
- Genovese, F., Tizzano, M. Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade. PLoS One. 13 (9), 0202754 (2018).
- Bankova, L. G., et al. The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation. Science Immunology. 3 (28), (2018).
- Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules. Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).
- Nadjsombati, M. S., et al. Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit. Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).
- von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).
- Deckmann, K., et al. Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).
- Liu, S., et al. Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues. Frontiers in Physiology. 8, 849 (2017).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube. Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
- Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system. Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
- Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice. Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).
- Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).
- Rock, J. R., et al. Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways. Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).
- Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
- Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets. Frontiers in Pharmacology. 7, 107 (2016).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
- Kaiser, O., et al. Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain. PLoS One. 8 (12), 80490 (2013).
- Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes. Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).
- Kohanski, M. A., et al. Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).
- Patel, N. N., et al. Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps. International Forum of Allergy & Rhinology. , (2018).
- Kouzaki, H., O’Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2. The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).
- Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells. The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).
- Nishikado, H., et al. Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).
