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Imunologia e Infecção

Verwendung von humaninduzierten, zellabgeleiteten Intestarz-Organoiden zur Untersuchung und Modifizierung des epithelialen Zellschutzes gegen Salmonellen und andere Krankheitserreger

Published: May 12, 2019
doi:
10.3791/59478
, , , , ,
1Wellcome Trust Sanger Institute, 2Department of Medicine,University of Cambridge, 3University of Cardiff

Summary

Die von Menschen verursachte pluripotente Stammzelle (hiPSC)-abgeleitete Darm-Organoide bieten spannende Möglichkeiten, enterische Erkrankungen in vitro zu modellieren. Wir zeigen die Differenzierung von HiPSCs in Darm-Organoide (iHOs), die Stimulation dieser IHOs mit Zytokinen und die Mikroinjektion von Salmonella Typhimurium in das IHO Lumen, die die Untersuchung einer epithelialen Invasion durch diese Erreger.

Abstract

Das Darmsystem “Organoid” (iHO), in dem 3-D-Strukturen, die für die epitheliale Auskleidung des menschlichen Darms repräsentativ sind, aus menschlich induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs) hergestellt und in der Kultur erhalten werden können, bietet eine spannende Gelegenheit, die Erleichterung Die Modellierung der epithelialen Reaktion auf Enterik-Infektionen. In vivo spielen Darmepithelzellen (IEC) eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Darmhomöostase und können Krankheitserreger direkt hemmen, obwohl die Mechanismen, mit denen dies geschieht, nicht vollständig aufgeklärt werden. Es hat sich gezeigt, dass das Cytokin-Interleukin-22 (IL-22) eine Rolle bei der Erhaltung und Abwehr der Darmepithelschranke spielt, einschließlich der Induktion von antimikrobiellen Peptiden und Chemokinen als Reaktion auf Infektionen.

Wir beschreiben die Differenzierung gesunder Kontroll-HiPSCs in iHOs, indem wir ihrem Kulturmedium spezifische Zytokin-Kombinationen zufügten, bevor wir sie in ein Kellermembransystem einbetten. Einmal eingebettet, werden die iHOs in Medien angebaut, ergänzt durch Noggin, R-spondin-1, epidermale Wachstumsfaktor (EGF), CHIR99021, Prostaglandin E2 und Y-27632 dihydrochloride Monohydrate. Wöchentliche Passagen durch manuelle Störung der iHO-Ultraleichtstruktur führen zur Bildung von budgetierten iHOs, wobei einige eine Krypt/villus-Struktur aufweisen. Alle iHOs zeigen ein differenziertes Epithel, das aus Becher-Zellen, enteroendokrinen Zellen, Panit-Zellen und polarisierten Enterozyten besteht, die durch Immunfärbung für bestimmte Marker jeder Zellsubmenge, Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt werden können. (TEM), und quantitative PCR (qPCR). Um die Infektion zu modellieren, werden Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 in das Lumen der IHOs injiziert und für 90 min bei 37 ° C inkubiert, und ein modifizierter Gentamicin-Schutz-Test wird durchgeführt, um die Niveaus der intrazellulären Bakterielle Invasion. Einige IOs werden vor der Infektion auch mit rekombinantem menschlicher IL-22 (rhIL-22) vorbehandelt, um festzustellen, ob dieses Zytokin vor Salmonellen-Infektionen schützt.

Introduction

In den letzten Jahren wurde die Untersuchung von Wirt-Erreger-Interaktionen durch die Entwicklung von “Organoid”-Modellen verstärkt, bei denen 3-D-Darstellungen des Darmepithels aus verschiedenen Vorläufern hergestellt werden können. ‘ Primärartige ‘ Organoide können direkt aus Darmstammzellen gewonnen werden, die aus Darmbiopsien gewonnen werden. Darüber hinaus können Darm-Organoide aus HiPSCs erzeugt werden. Das gleiche kann von zahlreichen Geweben gesagt werden, mit Maga 1, Leber 2,Bauchspeicheldrüse 3, 4,Gehirn5, 6,Lunge7, und Prostata 8 Organoide, die von vielen Forschern verwendet werden, um zu modellieren die Krankheit. Es gibt zahlreiche spannende Anwendungen des Organoidsystems, darunter die Modellierungvon Krebs 9 und das Arzneimittelscreening10, aber hier konzentrieren wir uns auf die Verwendung von iHOs als Infektionsmodell, mit S . Enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) als vorbildlichen Erreger und Vorbehandlung mit IL-22 als Therapie.

In dieser Studie handelt es sich bei den HiPSCs, die zur Erzeugung von iHO verwendet werden, um “Kolf2”-iPSCs, die von einem gesunden Individuum erzeugt werden und von dem Human Induced Pluripotent Stem Cells Initiative Consortium (HipSci; www.hipsci.org), einem Open-Access-Referenz-Panel von charakterisierten HiPSC Linien11. Ein Vorteil der Verwendung von HiPSCs als Vorläufer für Organoide ist, dass inzwischen umfangreiche Banken gesunder Spender-iPSC-Linien zur Verfügung stehen, was bedeutet, dass die Ergebnisse in einer Reihe von Zelllinien mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen validiert werden können. Sollten sich die Forscher außerdem mit spezifischen krankheitsassoziierten einzelnen Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) befassen wollen, ist es möglich, CRISPR/Cas9 zu verwenden, um Mutationen in einer gesunden Zelllinie zu konstruieren, wodurch sowohl eine Mutantenlinie als auch die Isogenen erhalten bleiben. Steuerleiste für den Vergleich12. Unserer Erfahrung nach sind hiPSC-abgeleitete Darm-Organoide größer als ihre primären Pendants und konsistenter in der Kultur, was zu einer weniger technisch anspruchsvollen Mikroinjektion führt und potenziell eine vielfältigere Palette von Krankheitserregern ermöglichen kann. Studierte. IHOs können kryogenisch konserviert werden, und wir haben bis zu einem Jahr iHO-Kulturen propagiert, um Material für Experimente zu produzieren.

In vivo spielen IEC eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Darmhomöostase und können Krankheitserreger direkt hemmen, obwohl die Mechanismen, mit denen dies geschieht, nicht gut verstanden werden. Das Zytokin IL-22 spielt bekanntermaßeneine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Darmepithelialen Barriere 13 und ist als Reaktion auf Infektionen 14 an der Induktion und Sekretion antimikrobieller Peptide und Chemokine beteiligt. Es wird sowohl durch aktivierte T-Zellen (insbesondere Th17-Zellen) als auch durch natürliche Killerzellen (NK) erzeugt und bindet an einen heterodimeren Rezeptor, der aus den Untereinheiten IL-22R1 und IL-10R2 besteht. Der Rezeptor für IL-22 drückt sich grundsätzlich auf IECs aus, was bedeutet, dass es im iHO-Modell möglich ist, die Organoide mit rhIL-22 einfach durch seine Ergänzung zum Kulturmedium 16 vorzubehandeln. Ein Nachteil des Organoidsystems ist, dass es nicht die zugehörige Immunantwort hat, die normalerweise von anderen Immunzellen geliefert wird; Es entstehen jedoch Modelle, die versuchen, Organoide mit Darm-Lymphozyten zu kokulturieren, um diese17,18besserdarzustellen.

Der Einsatz des Mikroinjektionssystems ist der Schlüssel zur Simulation von Infektionen im iHO-Modell, da dies die direkte Zufuhr von Krankheitserregern an die apische Oberfläche des Epithels ermöglicht, wie es bei einer vivo-Infektion der Fall wäre. Die Zugabe von Phenolrot zu der bakteriellen Lösung, die in das iHO injiziert wurde, kennzeichnet die infizierten, und vermeidet so wiederholte Injektionen desselben iHO. Organoide als Gefäße für die Infektionsmodellierung werden immer mehr verwendet,mit Krankheitserregern wie Helicobacterpylori, 19 dem Norovirus,20 dem Rotavirus, 21 Shiga-Toxin-produzierenden Escherichia coli 22, Cryptosporidium23, und das Zika-Virus24 , das sich in diesen Systemen als überleben und vermehren gezeigt hat. Diese Technologie könnte auf eine breitere Palette von Krankheitserregern angewendet werden, insbesondere auf schwer kulturell schwer einzulerkranken Organismen wie Protozoen oder von Menschen eingeschränkte Krankheitserreger, um direkte Informationen über die menschliche Epithelreaktion auf Infektionen zu erhalten.

Protocol

1. Kultivierung und Passagung von induzierten pluripotenten Stammzellen NOTE: Alle hier beschriebenen Methoden verwenden handelsübliche menschliche Zelllinien. Alle unten beschriebenen Gewebekulturarbeiten sollten in einer Laminarstromhaube der Klasse II durchgeführt werden. iPSCs werden routinemäßig im Stammzellkulturmedium gepflegt (siehe Materialtabelle), wie es die Herstelleranleitung ist, die eine wochenlange Kultur von iPSCs ermöglicht. iPSCs lassen sich relativ einfach von anderen iPSC-Kultursystemen anpassen. Durchtragen Sie die Zellen, sobald die Kolonien etwa 80% – 90% der Plattenoberfläche bedecken. Bereiten Sie Platten für den Durchgang 1 h vor der Verwendung durch Zugabe von Vitronectin 10 μg/mL verdünnt in Dulbecco phosphatgepufferten Saline (DPBS; ohne Kalzium [Ca] oder Magnesium [Mg]) zu Gewebekultur behandelten Platten. Die Volumina für die Beschichtung sind abhängig von der Plattengröße und finden sich in den Herstelleranweisungen. In dieser Zeit ist die warme Stammzellkultur mittellab und Raumtemperatur (RT). Entfernen Sie die Medien aus den iPSCs, die für die Durchfahrt bereit sind, und waschen Sie die Zellen 2x mit DPBS (ohne Ca oder Mg). Fügen Sie die EDTA-Lösung (siehe Werkstofftabelle) zu den Platten hinzu, um sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche beschichtet und bei RT für 5 – 8 min inkubiert wird. Wenn Löcher in der Mitte der iPSC-Kolonien auftauchen, saugen und werfen Sie die EDTA-Lösung ab. Die Quelle für Stammzellkultur wird zu den Brunnen gebracht; Die iPSCs einige Male durch sanftes Waschen über die Plattenoberfläche ablegen. Die iPSCs werden als Klumpen und nicht als einzelne Zellen eingesetzt, also stellen Sie sicher, dass die EDTA-Lösung nicht zu lange anhält. Bewegen Sie alle ausrangierte iPSCs in ein 15 ml konisches Rohr. Das Vitronektin von den vorgestrichenen Platten aufsaugen und durch Stammzellkulturmedium ersetzen. Die iPSC-Fuste mehrmals umkehren, um sicherzustellen, dass sich die iPSCs nicht am Boden des konischen Rohres angesiedelt haben, und fügen Sie das entsprechende Volumen der Aufhängung hinzu, um eine 1:10-Verdünnung der Zellen auf einer neuen Platte zu geben. Die Splittzüge können je nach iPSC-Wachstumsrate angepasst werden, die zwischen iPSC-Linien variieren kann. Die Platte, um die iPSCs über die Oberfläche zu verteilen und in einen Inkubator bei 37 ° C/5% CO2zu legen. Füttern Sie die iPSCs am Tag nach der Passagung. 2. Differenzierung von iPSCs zum Hindgut Am 0. Tag,teilen Sie die iPSCs auf eine 10 cm gewebe-Kultur-behandelte Schüssel, die mit Vitronectin, wie in Schritt 1.2 beschrieben, in 10 mL Stammzellkulturmedium aufgeteilt wird, ergänzt mit Aktivin A (10 ng/mL) + Grundfaktor für Fibroblasten (bFGF; 12 ng/mL). Die Wachstumsfaktoren direkt vor der Nutzung in die Medien einfügen; Tun Sie dies in allen weiteren Schritten. Am ersten Tag ändernSie die Medien (10 mL Stammzellkulturmedium mit activin A [10 ng/mL] + bFGF [12 ng/mL]). Beginnen Sie am 2. Tag mitder Differenzierung, indem Sie die Medien auf 10 ml Stammzellkulturmedium umstellen, ergänzt durch folgende Wachstumsfaktoren: Aktivierung A (100 ng/mL), bFGF (100 ng/mL), bone morphogenetisches Protein 4 (BMP-4; 10 ng/mL), Phosphoinositol 3- Kinase-Inhibitor LY294002 (10 μM) und GSK3-Inhibitor CHIR99021 (3 μM). Am 3. Tag ändernSie die Medien auf 10 ml Stammzellkulturmedium, ergänzt durch Activin A (100 ng/mL), bFGF (100 ng/mL), BMP-4 (10 ng/mL) und LY294002 (10 μM). Endoderm-Spezifikation, die durch dieses Medium induziert wird, sollte in den nächsten 24 Stunden sichtbare Änderungen an der iPSA-Kolonie-Morphologie zur Folge haben. Am 4. Tag ändernSie die Medien auf 10 mL der RPMI/B27-Medien, ergänzt mit activin A (100 ng/mL) und bFGF (100 ng/mL).NOTE: RPMI/B27-Medien enthalten 500 ml RPMI-Medium mit L-Glutamin-Beilage (siehe Tabelle 1), 10 ml B27-Zuschlag (50x, serumfrei) und 5 mL unwesentliche Aminosäuren. Optional: 5 mL Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL). Filtersterilize vor Gebrauch. Am 5. Tag,ändern Sie die Medien auf 10 mL von RPMI/B-27 Medien mit activin A (50 ng/mL) ergänzt. Am 6. Tag,um mit der Musternatur des hinteren Endoderms zum Hintergut zu beginnen, ändern Sie die Medien auf 10 ml RPMI/B27 Medien, ergänzt mit CHIR99021 (6 μM) + Retinosäure (3 μM). Auf den Tagen 7, 8und 9wiederholen Sie den Schritt 2.7. Während dieser Schritte sollten sichtbare 3-D-Strukturen des Hinterbauch sichtbar werden, die die Oberfläche der Platte bedecken. Am 10. Tag dasresultierende Hintergut in die Kellermembranmatrix einbetten (siehe Materialtabelle). 3. Einbettung des Hindgutes in die Kellermembran-Matrix Machen Sie IHO Basis-Wachstumsmedien (500 ml von fortgeschrittenem Dulbecco es modifizierter Eagle es Medium [DMEM]/F12, 10 mL B27 Beilage [50x, serum frei], 5 mL N2-Beilage [100x, serum frei], 5 mL von 1 M 4-(2-Hydroxyethyl) -1-Piperazineesulbonsäure (HEPES), und 5 ml von Nicht-essenzielle Aminosäuren [100x]. Optional: 5 mL Penicillin-Streptomycin [10.000 U/mL] hinzufügen; Filtersterilize vor dem Gebrauch. Siehe Tabelle 1). Entfernen Sie die Medien von der Hinterbeinflatte und waschen Sie den Teller 1x mit DPBS (ohne Ca oder Mg). 5 ml Kollagenase-Lösung auf die Platte geben und bei 37 ° C für 5 min inkubieren. Erstellen Sie die Kollagenase-Lösung, indem Sie 500 mg Kollagenase IV-Pulver zu 400 ml fortgeschrittenem DMEM/F12 hinzufügen. Im Anschluss daran 100 ml Serumersatz (siehe Materialtabelle ), 5 ml L-Glutamin (200 mM) und 3,5 μL 2-Mercaptoethanol hinzufügen und die zu mischen. Filtersterilisation der Lösung, sobald das Kollagenasepulver vollständig aufgelöst ist.NOTE: Diese kann bei-20 ° C bis zu 6 Monate bei kleineren Aliquots gelagert werden. Inaktivieren Sie die Kollagenase, indem Sie 5 ml iHO-Basiswachstumsmedien in die Platte einfügen und die Hinterkamm-Zellen mit einem Zellkratzer abkratzen, indem Sie die Hinterwerm-Aufhängung in einem 15 mL-konischen Rohr sammeln. Zentrifuge bei 240 x g für 1 min und Pipette vom Supernatant. 10 ml Medien dazugeben, das Hintergut durch sanftes Pipettieren in kleinere Stücke zerlegen und 1 min mit 95 x g nochmals zentrifuge. Waschen Sie die Zellen 2x in iHO-Basiswachstumsmedien, indem Sie Schritt 3.5 wiederholen. Verlassen Sie die Zellen in einem kleinen Volumen des Basiswachstumsmediums (~ 300 – 500 μL) und fügen Sie die rund 100 μL dieser Lösung zu 1,5 ml Kellermembranmatrix hinzu. Die Matrix muss während dieser Zeit auf Eis bleiben, da sie sich bei RT schnell zu verfestigen beginnt. Eine 24-Brunnen-Platte auf einer Plattenheizung bei 37 ° C aufstellen und 60 μL in einem Brunnen der 24-Well-Platte herausschneiden. Lassen Sie es kurz einstellen und überprüfen Sie die Dichte unter einem Mikroskop. Bei Bedarf die Kellermembranmatrix in Schritten mit einer Rückhaltung versehen, bis die gewünschte Konzentration erreicht ist, und die Lösung in die verbleibenden Brunnen ausloten. Inkubat bei 37 ° C für 10 min; Fügen Sie dann 800 μL iHO-Basiswachstumsmedien hinzu, die Wachstumsfaktoren in den folgenden Konzentrationen der 24-Well-Platte enthalten (siehe Tabelle 1): 500 ng/mL R-spondin-1, 100 ng/mL Noggin, 100 ng/mL epidermal growth factor (EGF), 3 μM CHIR99021, 2.5 μM Prostaglandin E2, und 10 μM Y-27632 dihydrochloride Monohydrat (ROCK-Inhibitor). Ändern Sie die iHO-Basiswachstumsmedien alle 2 – 3 Tage, oder sofort, wenn die Medien zu verfärben beginnen. Nach der ersten Aussaat in die Kellermembranmatrix können Sie die iHOs 7 Tage lang entwickeln, bevor sie sich aufteilen. Am Tag 3 – 4 sollten in der Kultur unterschiedliche Sphären sichtbar sein. Allein für den Medienwandel, weglassen Y-27632, da dies nur bei der Splitting/Aussaat erforderlich ist. 4. Wartung und Durchfahrt von iHOs Um ein schrittweises Auftauen zu ermöglichen, legen Sie das benötigte Volumen der Kellermembranmatrix über Nacht bei 4 ° C über Nacht, 24 Stunden vor der Spaltung, in einen überdachten Eimer. Entfernen Sie die Medien aus den iHOs und ersetzen Sie sie durch 500 μL Zellhebellösung (siehe Materialtabelle) pro Brunnen. Inkubieren Sie bei 4 ° C für 40 – 50 min, an diesem Punkt sollten die iHOs in der Lösung schwimmen. Optional: Verwenden Sie ein Bildgebungssystem in der Haube, um nur iHOs mit der gewünschten Morphologie auszuwählen(siehe Materialtabelle). Die iHO/Zellhebelösung wird sanft in 15 mL konische Rohre gesteckt und versucht, die iHOs nicht aufzubrechen. Die IHOs mit 3 – 5 min absetzen lassen und die supernatanten und einzelnen Zellen entfernen. Resuspend die iHOs in 5 mL des iHO-Basiswachstumsmediums und pipette sie sanft zu waschen. Zentrifuge bei 95 x g für 2 min. Eine 24-Well-Platte auf einer Plattenheizung bei 37 ° C in der Haube aufstellen. Entfernen Sie die Supernatante und erneuern Sie die iHOs in ~ 300 – 500 μL Basiswachstumsmedien, mit einer P1000-Pipette, um die iHOs in kleinere Stücke aufzuteilen. Beachten Sie, dass die Kraft, die angewendet werden muss, abhängig von der iHO-Linie und dem Reifungszustand abhängt, also beginnen Sie sanft, die Kraft zu erhöhen, wenn erforderlich. Platzieren ~ 100 μL des iHOs (das Volumen ist abhängig von der Dichte der Lösung) in 1,5 ml Kellermembranmatrix und Pipette kurz zu mischen. 1 x 60 μL der Kellermembranmatrix in einen Brunnen der 24-Well-Platte geben, für ~ 30 s verfestigen und dann die Dichte unter dem Mikroskop überprüfen. Wenn die Dichte zu niedrig ist, fügen Sie weitere iHOs in die Matrix ein. Wiederholen Sie Schritt 4.8, bis die richtige Dichte erreicht ist, und entdecken Sie dann den Rest der Matrix in eine 24-Well-Platte. Legen Sie es in einen Inkubator bei 37 ° C für 10 min und überlagern Sie ihn dann mit 800 μL Basiswachstumsmedium mit Wachstumsfaktoren, wie in Schritt 3.7 beschrieben. Um die iHOs für ein Invasions-Assay-Experiment vorzubereiten (siehe unten), Passage der iHOs 4 – 5 Tage vor dem Experiment, wie in den Schritten 4.1 – 4.10 beschrieben, aber platzieren 120 μL der Matrix iHO-Lösung, die in Schritt 4,7 in 5 mm Glasbodenmikroinjektionsschalen erzeugt wird. Anstatt die iHO-Aufhängung wie bei der routinemäßigen Passagerung in einem Tröpfchen zu belassen, verteilen Sie den Tropfen über den Boden der Schüssel, um eine dünne Schicht Matrix zu erzeugen. Bedecken Sie es mit 2,5 ml Basiswachstumsmedium plus Wachstumsfaktoren.NOTE: Wenn Antibiotika im Kulturmedium eingesetzt wurden, müssen diese entfernt und durch nichtantibiotische ergänzte Medien für Mikroinjektionsversuche ersetzt werden. 5. Präsentation von iHOs mit rhIL-22 Aspirieren Sie die Medien aus den iHOs und ersetzen Sie sie 18 Stunden vor dem Invasionsuntergang durch neue Basiswachstumsmedien (die keine Antibiotika enthalten dürfen). Zu einer Endkonzentration von 100 ng/mL. 6. Mikroinjektion von iHOs und Intracellular Invasion Assays Am Tag vor dem Experiment, setzen S. Typhimurium SL1344 Kultur in 10 mL Luria-Bertani-Brühe und inkubieren bei 37 ° C über Nacht mit Schütteln. Am Tag des Experiments, wenn ein Mikroskop mit einer geschlossenen Wärmekammer vorhanden ist, schalten Sie es ein und lassen Sie die Temperatur auf 37 ° C vor Beginn des Tests. Die Bakterienkulturen in DPBS (mit Ca und Mg) verdünnen Sie die Bakterien über Nacht auf eine optische Dichte von 2 bei 600 nm (OD600) und vermischen Sie sie dann 1:1 mit Phenolrot. Laden Sie die Mikroinjektionsschale, die iHOs enthält, auf die Mikroskopbühne, entfernen Sie den Deckel und bringen Sie die iHOs in den Fokus, bereit für den Beginn der Injektion. Schalten Sie den Injektor und die Armsteuerung ein. Stellen Sie sicher, dass der Injektor auf einen Druck von 600 kPa und eine Einspritzzeit von 0,5 s eingestellt ist. Wenn es nicht bereits von der Mikroskop-Stufe abgesichert ist, drehen Sie den Injektionsarm, um sicherzustellen, dass es ist. Richten Sie eine 6 μm Mikroinjektionsbohrspitze ein, indem Sie die Verpackung und den Plastikzylinder von der Nadel entfernen. Den Griffkopf vom injizierenden Arm entfernen. Laden Sie die Bohrspitze mit 10 μL des Inoculums, die Bohrspitze an ihrem stumpfen Ende sanft festigen. Die Bohrspitze in den Griffkopf legen und am Mikroinjektionsarm wieder befestigen. Bewegen Sie den Arm sanft in Position, so dass die Nadel 1 – 2 cm über der Mikroinjektionsschale liegt. Mit der Armsteuerung positioniert man die Nadelspitze in der Mitte der Schale und senkt sie, bis sie gerade über der Oberfläche der Medien liegt. Programmieren Sie die Armkontrollstation, um die Nadel nach allen Injektionen an diesen Punkt zurückzubringen. Fokussieren Sie das Mikroskop auf die iHOs und wählen Sie das Ziel aus, das injiziert werden soll. Positionieren Sie die Nadel oben und rechts des iHO, um injiziert zu werden und bewegen Sie die Nadel nach unten und seitlich in das iHO Lumen. Drücken Sie den Injektionsknopf auf dem Mikroinjektor; Das phenolbefleckte Bakteriengemisch wird aus der Nadel entstehen. Fügen Sie jeden iHO 3x ein. Pro Bedingung mindestens 30 iHOs einspringen.NOTE: Aufgrund der Heterogenität in der iHO-Größe und-Struktur innerhalb einer Kultur ist es notwendig, eine große Anzahl von iHOs zu injizieren, um für Variationen zu kontrollieren. Wenn alle benötigten iHOs injiziert sind, die Mikroinjektionsplatte von der Bühne nehmen, den Deckel ersetzen und die Platte bei 37 ° C für 90 Minuten inkubieren. Nach 90 Minuten die Wachstumsmedien absaugen und durch 3 ml Zellhebellösung ersetzen; Inkubat bei 4 ° C für 45 min. Verschieben Sie die iHOs/Zellhebelösung sanft auf ein 15 mL konisches Rohr mit 5 ml DPBS. Stellen Sie sicher, dass alle injizierten iHOs von der Platte entfernt wurden (spülen Sie die Platte bei Bedarf mit 1 ml DPBS). Zentrifuge bei 370 x g für 3 min. Entfernen Sie den Supernatant und erneuern Sie die iHOs in Basiswachstumsmedien, die Gentamicin bei 0,1 mg/mL enthalten (1 mL Medien hinzufügen; dann verwenden Sie eine P1000-Pipette ~ 50x, um die iHOs aufzubrechen, und fügen Sie 4 mL weitere Medien hinzu). Inkubieren Sie bei 37 ° C für 1 h, um extrazelluläre Bakterien abzutöten. Zentrifugen Sie die iHOs bei 370 x g für 3 min und saugen Sie den Supernatant, so wenig wie möglich. Die iHOs 1x wieder mit DPBS und Zentrifuge waschen.NOTE: Dieser Schritt entfernt Gentamicin, das wichtig ist, da jedes verbleibende Gentamicin intrazelluläre Bakterien abtöten kann, sobald die Zellen lysisch sind. Wiederholen Sie die iHOs in 500 μL Lysepuffer (siehe Materialtabelle) und trennen Sie die Organoide manuell durch Pipetting ~ 50x. Lassen Sie diese Mischung für 5 Minuten bei RT. Die daraus resultierende Lösung in DPBS wird mit 10-1,10-2und 10- 3 Konzentrationen ernsthaft verdünnt. Pipette 3 x 20 μL Tröpfchen der sauberen und verdünnten Lösungen auf vorgewärmte LB-Bagarplatten. Inkubieren Sie über Nacht bei 37 ° C und führen Sie die Kolonieanzählen und Berechnung der Kolonieformeinheiten (CFU) durch. Die Anzahl der Kolonien spiegelt die Anzahl der intrazellulären Bakterien wider, die während des Zelllysierungsprozesses freigesetzt wurden. 7. Zell-Einfrieren und Erholen NOTE: Wie bereits erwähnt, ist es möglich, iHOs kryogenisch zu konservieren und auf Wunsch wieder herzustellen. Die Gefrier-und Auftauprozesse sind im Folgenden beschrieben. Wählen Sie die Brunnen von iHOs, die Sie einfrieren möchten. Fügen Sie die Brunnen mit einer Zellhebelung und einem Inkubat für 40 – 50 min bei 4 ° C hinzu. Die iHOs sollten in der Lösung schwimmen. Die iHOs sanft in ein 15 mL konisches Rohr piptieren und absetzen lassen. Entfernen Sie die Medien und waschen Sie die iHOs 1x mit Basiswachstumsmedien (keine Wachstumsfaktoren). Zentrifuge bei 95 x g für 2 min, entfernen Sie den Supernatant, und ersetzen Sie es durch ein entsprechendes Volumen von Zellgefrieren Medium (siehe Materialtabelle; verwenden Sie das Medium nach den Anweisungen des Herstellers), indem Sie die iHOs in kryogene Ampullen dekantieren. Die Vials über Nacht in einem Gefrierschrank von-80 ° C aufbewahren, um mehr allmähliches Einfrieren zu ermöglichen; Dann auf flüssige Stickstoffspeicherung übertragen. Um die iHOs wieder herzustellen, wird eine kryogene Ampulle bei 37 ° C mit einem Wasser/Perlenbad schnell aufgetünen; Dann schwenkbar sanft den Inhalt in 10 mL Basiswachstumsmedien (keine Wachstumsfaktoren). Lassen Sie die iHOs die Medien durch ~ 300 μL frischer Basiswachstumsmedien besiedeln und ersetzen. Nicht manuell trennen iHOs. Fügen Sie iHOs der Kellermembranmatrix hinzu und zeichnen sie wie in Abschnitt 3 beschrieben aus.

Representative Results

Nach Beginn des Differenzierungsprozesses sollten die Zellen das Stadium der definitiven Endoderm-Bildung durchlaufen, gefolgt von einer Hintertragmusterung vor der Einbettung in die Kellermembranmatrix. Spheroide werden sich bilden und Kulturen mit großen Mengen an kontaminiertem Material werden über einen Zeitraum von mehreren Wochen ablöschen, wenn die iHOs reifen. In Abbildung 1 werden exemplarische Bilder des Differenzierungs-, Einbett-und Passationsprozesses gezeigt. Der Aufbau des Mikroinjektionssystems ist wie in Abbildung2 gezeigt. Die iHOs werden mit der Phenol-Reb/Bakterienlösung mikroinjiziert und behalten ihre rote Farbe, so dass infizierte iHOs identifiziert werden können, um Doppelinjektionen zu verhindern. Zählungen von geplatzten intrazellulären Bakterien werden nach dem modifizierten Gentamicin-Schutz-Test durchgeführt; Die Vorahnung mit rhIL-22 schränkt das S ein . Typhimurium-Infektion, bei der nach der rhIL-22-Behandlung weniger intrazelluläre Bakterien beobachtet werden (Abbildung 3). Wir verarbeiten auch routinemäßig infizierte iHOs für die Immunfärbung, oder TEM, um die Visualisierung von Host IEC-bakterielle Interaktionen zu erleichtern (Abbildung4). Abbildung 1: Gleichgewiesene Differenzierung von iPSCs zu iHOs. Repräsentative Abfolge der Differenzierung von iPSCs zu iHOs, die die beobachteten morphologischen Veränderungen und die Wachstumsfaktoren, die erforderlich sind, um diese Veränderungen voranzutreiben, zeigen. Das endgültige Endoderm wird am 4. Tag der Differenzierung gebildet, nach der Exposition gegenüber spezifischen Konzentrationen von Kombinationen von Aktivin A, FGF, BMP-4, LY294002 und CHIR99021. Nach 8 Tagen führt das Muster dieses definitiven Endoderms mit spezifischen Konzentrationen von CHIR99021 und Retinosäure zu einer Hinterballbildung. Nachbettung, spheroische Bildung wird beobachtet. Nach der nachhaltigen Passagierung mit einer unterstützenden Kellermembranmatrix mit einem Medium, das mit Prointestinalausbreitungsfaktoren R-spondin 1, Noggin, EGF, CHIR99021 und Prostaglandin E2 ergänzt wird, dringen die Spheroide in die aufgebrachten iHOs ein. (Bilder wurden bei 4x–10x Vergrößerung aufgenommen). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 2: Mikroinjektion eines iHO mit S. Typhimurium. A) Das Mikroinjektionssystem (siehe Materialtabelle), das in der Umweltkammer eingeschlossen ist; Dies ermöglicht die Einspritzung der iHOs in eine kontrollierte Umgebung (37 ° C/5% CO2). (B) Das bakterielle Inoculum wird mit Hilfe einer Mikrokapillaranlage direkt in das iHO-Lumen geliefert. C) Durch das Mischen von bakteriellen Inokulum mit Phenol-Rot ist klar, welche iHOs infiziert wurden, wodurch doppelte Injektionen desselben iHO vermieden werden. Die Bilder wurden mit 10x Vergrößerung aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Bild 3: Die Vorbehandlung von iHOs, die aus der Kolf2-Zelllinie mit rhIL-22 abgeleitet wird, schränkt die S ein. Typhimurium SL1344 Invasion in Darm-Epithelzellen. Für gentamicin-Schutzuntersuchungen wurden iHOs mit 100 ng/mL rhIL-22 18 h vor einer Infektion behandelt oder unbehandelt gelassen und für 90 min Nachinfektion inkubiert. Die Daten sind Mittel von drei technischen Replikaten für drei biologische Replikate ± SEM. Für die Bedeutungsprüfung wurden Mann-Whitney U-Tests verwendet; P < 0.0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 4: Interaktion der IECs mit S. Typhimurium SL1344. Diese Panels zeigen, dass iHOs , die mit S injiziert werden, in die Lage sind. Typhimurium SL1344 und inkubiert für 3 Stunden, vor der Fixierung und Verarbeitung für (A) Immunfluoreszenz oder (B) Transmissionselektronenmikroskopie. In der Tafel Awerden Bakterien im IHO-Lumen gesehen und interagieren mit dem Epithel. Die Kerne sind mit 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Dilactat (blau), Zellmembranen mit Phalloidin (rot) und Bakterien mit CSA-1 (grün) befleckt. Die Bilder werden bei 20x Vergrößerung aufgenommen. Tafel B zeigt drei verschiedene intrazelluläre Verarbeitungswege von Salmonellen nach der Invasion; Bakterien werden (a) in einer Salmonellagesehen-in der Vakuole enthalten, (b) frei im Zytoplasma, und (c) in der Autophagie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. RPMI/B27 Medium der Teil: Betrag: RPMI 1640 Medien mit Glutamin-Beilage 500 mL B27 serumfreies Zuschlag 50x 10 mL iHO Basiswachstumsmedium der Teil: Betrag: Fortgeschrittene DMEM/F12 500 mL B27 serumfreies Zuschlag 50x 10 mL N2 serumfreies Zuschlag 100x 5 mL HEPES 1 M 5 mL L-Glutamin 200 mM 5 mL Wachstumsfaktoren für iHO Basiswachstumsmedium der Teil: Betrag: Rekombinant menschlicher R-Spondin1 500 ng/mL Recombinant human Noggin 100 ng/mL Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) 100 ng/mL Prostaglandin E2 2,5 μM CHIR99021 3 μM Y-27632 Dihydrochlorid-Monohydrate 10 μM Tabelle 1: Medienrezepte.

Discussion

Dieses Protokoll skizziert die Differenzierung von HiPSCs in iHOs und deren Nutzen als Modell zur Simulation von Entericinfektionen. Im Folgenden erläutern wir die kritischen Schritte im Protokoll und alle Änderungen oder Verbesserungen, die wir vorgenommen haben.

Dieses Protokoll rationalisiert den Differenzierungsprozess von hiPSCsimVergleich zu zuvor veröffentlichten Arbeiten 25. Bisher angewandte Methoden erforderten die Übertragung von HiPSCs von anderen hiPSC-Kultursystemen (z.B. feeder-abhängige HiPSC-Kultur) auf chemisch definierte Medium – Polyvinylalkohol (CDM-PVA). Diese Übertragung auf CDM-PVA dauert in der Regel 2 – 3 Wochen und erfordert eine tägliche Fütterung der HiPSCs. Dieses Protokoll war auch nicht durchgängig wirksam, und einige Differenzierungen scheiterten; Deshalb haben wir die Differenzierung mit den gleichen Wachstumsfaktoren ausgespielt, angefangen bei den HiPSCs, die im Stammzellkulturmedium (statt CDM-PVA) angebaut werden, und dem Austausch von CDM-PVA durch Stammzellkulturmedium während der Differenzierungstage 0 – 3. Dies ist bisher gelungen für die fünf unabhängigen HiPSC-Linien, die den Differenzierungsprozess deutlich schneller und effizienter machen. Dies ermöglicht auch eine wochenlosferische Kultivierung von HiPSCs vor der Differenzierung, was mehr Flexibilität in der hiPSC-Kultur ermöglicht. iHO-Linien, die mit dieser Methode hergestellt werden, wurden für Marker von Darmepithel phänomant, wie wir sie zuvor für die hiPSC-Linien Kolf2, Yemz1 und Lise116 beschrieben haben und erscheinen phänotypisch indistatorisch von iHOs, die mit den vorherigen produziert werden Protokoll.

Nach der Aussaat benötigen iHOs mindestens einen Monat routinemäßige Passagen, wobei alle 4 – 7 Tage geteilt werden, um die Reifung zu erleichtern. Beachten Sie, dass es je nach verwendetem iPSC-Linie und der Dichte der ursprünglichen Kultur einige Abweichungen in der iHO-Entwicklung geben wird. In den ersten Passagen wird es sichtbar kontaminierende Zellen geben, die keine iHOs sind. Diese werden schließlich sterben, so dass eine saubere Kultur der sphärischen und nach etwa 4 Wochen budded iOs. Darüber hinaus kann ein Bildgebungssystem in der Haube verwendet werden, um nur iOs mit der gewünschten Morphologie auszuwählen und zu durchlaufen. Je nach Wachstumsrate und Dichte müssen die iHOs alle 6 – 7 Tage geteilt werden. Wenn eines der folgenden Ereignisse auftritt, sollten die iHOs vor diesem Punkt gespalten werden: Die leuchtenden Hohlräume der iHOs beginnen sich mit toten Zellen zu füllen, die Kellermembranmatrix beginnt sich zu zerfallen, die iHOs beginnen aus der Kellermembranmatrix zu wachsen, oder auch die Kultur ist Dicht und die Medien beginnen sehr schnell gelb zu werden.

Sobald die iHO-Kultur etabliert ist, wenn sich das Erscheinungsbild der iOs zu irgendeinem Zeitpunkt ändert oder anders ist als erwartet (zum Beispiel bleiben die Kulturen sphärisch, statt zu buddeln), sollte die Phenotypisierung über Immunhistochemie und QPCR für Zellmarker sein. Wiederholte, um sicherzustellen, dass die Differenzierung der Zelltypen innerhalb der iHOs (z.B. Bewaffenzellen, Panitenzellen) intakt bleibt. Wenn die iHOs nicht mehr differenziert sind, dann sollten sie weggeworfen und neu differenziert werden oder eine frühere Passage der iHOs aufgetaut und neu konstituiert werden. Wenn die iOs aufhören, zu unterscheiden, sind die möglichen Ursachen das Alter der Kultur (wenn es über 6 Monate alt ist), die Aktivität der Wachstumsfaktoren (stellen Sie sicher, dass diese nach den Anweisungen des Herstellers wieder hergestellt und in kleinen Aliquossen eingefroren werden, um zu vermeiden, In der Regel sollte es nur einmal pro Woche zu Durchgangssperren kommen, und wenn die iOs regelmäßig manuell zu stark voneinander getrennt werden, werden sie nicht mehr vollständig zu unterscheiden).

Wir stellten über RNA-Sequenzierung fest, dass IL-22-Stimulation 18 h vor der Infektion antimikrobielle Gene und diejenigen, die in der Barriereverteidigung Phenotyp beteiligt sind. Vor der Verwendung von neuen iHsO für Assays mit Vorläufigkeit mit rhIL-22 (oder einem alternativen Zytokin, wenn das System dafür verwendet wird), ist es ratsam, die Aktivität von Genen zu überprüfen, die bekannt sind, dass sie von der Zytokin (im Fall von IL-22) , haben wir DUOX2 und LCN2) über qPCR nach der Stimulation der iHOs verwendet, um den Ausdruck des Rezeptors und die intakte Signalgebung zu gewährleisten. Vor der ersten Verwendung von IL-22 haben wir auch Immunhistochemie durchgeführt, um den IL-22-Rezeptor auf iHOs zu lokalisieren, um festzustellen, dass der Ausdruck des IL-22-Rezeptors basal war, was bedeutet, dass die Prätimulation einfach durch Zugabe von rhIL-22 zur iHO-Kultur erreicht werden konnte. das Mittel. Wenn jedoch ein Rezeptor apisch ausgedrückt wird, muss dieses Protokoll eventuell angepasst werden, um Liganden apisch zu liefern.

Die Fallstricke bezüglich des Mikroinjektionssystems stehen in der Regel im Zusammenhang mit der Feinheit der für die Injektion benötigten Nadeln. Hier verwenden wir handelsübliche Bohrtipps mit 6 μm Lumen. Es ist möglich, die Injektionsnadeln aus Glaskapillaren zu ziehen 26, obwohl dies weniger gleichmäßig sein kann, was zu Leckagen von der Nadelspitze oder inkonsistenten Volumina führt, die in die iHOs injiziert werden. Es ist wichtig, sicher zu sein, dass die Injektion in das iHO-Lumen erfolgt ist, was ein Grund für die Verwendung von Phenolrot als Farbstoff ist; Die iOs werden sich sichtbar ausdehnen und das rote Inoculum halten, was die Gewissheit darüber ermöglicht, welche IHOs injiziert wurden. Gelegentlich verstopfen Nadeln mit Schutt aus der iHO-Wand; Wenn dies der Fall ist, entfernen Sie die Nadelspitze aus dem Inneren des iHO und drücken Sie den sauberen Knopf auf dem Mikroinjektionssystem. Dadurch entsteht eine kurze Phase höheren Luftdrucks, die die Blockade beseitigen sollte. Es wird auch zu einer Leckage des bakteriellen Inokulums auf die Platte führen; Wenn dies geschieht, sollte daher die saubere Wirkung auf allen Platten wiederholt werden, um die Gleichheit der bakteriellen inoculum pro Platte zu gewährleisten. Ein großer Vorteil der hiPSC-abgeleiteten iHOs ist ihre Größe. Darminorganisoide von Mäusen und primären menschlichen Organoiden sind viel kleiner (bis zu ~ 100 μm und 100 – 300 μm, bzw. 27, gegenüber 250 – 1500 μm für hiPSC-abgeleitete iHOs), was bedeutet, dass die Injektionen großer Mengen von Organoiden langsamer werden. Auf diese Weise können größere Injektionsversuche in den hiPSC-abgeleiteten iHOs getestet werden. Es ist auch möglich, die Leuchtinhalte der iHOs zu untersuchen, indem man sie postinfektion erntet und die iHOs manuell in DPBS zerlegt, wodurch ihre Leuchtinhalte freigesetzt werden. Für die Mikroinjektion empfehlen wir eine hohe Bakterienkonzentration. Wir haben festgestellt, dass niedrigere Konzentrationen nicht ausreichten, um eine Antwort der IEC zu generieren, die die iHOs umfassten. Darüber hinaus war es schwierig, internalisierte Bakterien mit Hilfe der Mikroskopie nachträglich zu lokalisieren. Die Inoculum müssen möglicherweise für verschiedene Bakterienstämme optimiert werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass hiPSC-abgeleitete iHOs ein vielversprechendes Modell für die direkte Trennung der epithelialen Reaktion auf Entzündungen darstellen, sei es durch die Untersuchung von intrazellulären Invasionszahlen, die Bildgebung, die Messung des Zytokinspiegels bei den iHO-Supernatanten oder die Ernte der RNA, um Studie Transkriptionsänderungen nach der Exposition gegenüber Krankheitserregern. Ihr Nutzen wird in Zukunft noch deutlicher werden, um Infektionsmodelle für menschenbeschränkte Krankheitserreger zu etablieren und die Möglichkeiten zu nutzen, diese Technologie zu nutzen, um die Forschung durch die Untersuchung spezifischer krankheitsbedingter genetischer Mutationen zu personalisieren. Und die Reaktionen der Drogen.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch die Unterstützung des Wellcome Trust, der Gates Foundation und des Cambridge Biomedical Research Centre unterstützt. E.A.L. ist ein klinischer Doktorand, der vom Wellcome Trust unterstützt wird.

Materials

2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
5 mm glass bottom injection dishes MatTek corporation P50G-0-14-F
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634010
Alexa fluor 647 phalloidin Life Technologies A22287 Use at 1:1000 concentration
B27 serum-free supplement Life Technologies 17504044 Stock concentration 50x, final concentration 1x
BMP-4 recombinant human protein R&D PHC9534 Stock concentration 10 μg/mL, final concentration 10 ng/mL
Cell recovery solution (cell lifting solution) BD 354253
CHIR99021 Abcam  ab120890-5mg Stock concentration 3 mM, final concentration 3 µM
Collagenase, type IV powder Life Technologies 17104019 Reconstitute at 0.1%
Corning cryogenic vials Corning 430487
Costar TC treated 24 well culture plates Corning CLS3527
DAPI dilactate Sigma-Aldrich D9564-10MG Use at 10 nM concentration
Dulbecco’s PBS (No MgCl2 or CaCl2) Life Technologies 14190-144
Dulbecco’s PBS (with MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8662-100ML
Epidermal growth factor R&D 236-EG-200 Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL
Eppendorf TransferMan NK2 (microinjection system) Eppendorf 920000011
Eppendorf Femtojet express  (microinjection system) Eppendorf 5248 000.017
Essential 8 Flex medium kit (stem cell culture medium) Life Technologies A2858501
EVOS XL imaging system (in-hood imaging system)
Gentamicin Sigma-Aldrich G1272-10ML Stock concentration 10 mg/mL, final concentration 0.1 mg/mL
Goat anti-Salmonella, CSA-1 Insight Biotechnology 02-91-99 Use at 1:20 concentration
HEPES 1 M Life Technologies 15630056
KnockOut Serum Replacement (setrum replacment) Gibco 10828010
GlutaMAX supplement (glutamine supplement ThermoFisher
L-glutamine Life Technologies A2916801 Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM
LY294002 Promega UK V1201 Stock concentration 50 mM, final concentration 10μM
Matrigel, GFR, phenol free (basement membrane matrix) Corning 356231
MEM non-essential amino acids  solution (100x) Gibco 11140035
N2 serum-free supplement Life Technologies 17502048 Stock concentration 100x, final concentration 1x
Penicillin-streptomycin Life Technologies 15140163 Stock concentration 10,000 U/mL, final concentration 100 U/mL
Phenol red Sigma-Aldrich P0290-100ML
Piezo Drill Tip Mouse ICSI, 25° tip angle, 6 µm inner diameter Eppendorf 5195000087
Prostaglandin E2 Sigma P0409-1MG Stock concentration 2.5 mM, final concentration 2.5 mM
Recombinant human FGF basic R&D 233-FB-025 Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL
Recombinant human IL-22 R&D 6057-NG-100 Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL
Recombinant human Noggin R&D 6057-NG-100 Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL 
Recombinant human R-spondin1 R&D 4645-RS-025 Stock concentration 25 mg/mL, final concentration 500 ng/mL
Recombinant human/mouse/rat Activin A R&D 338-AC-050 Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL
Recovery cell culture freezing medium (cell freezing medium) Gibco 12648010
Retinoic acid Sigma-Aldrich  R2625-50MG Stock concentration 3μM, final concentration 3mM
RPMI 1640 media with Glutamax supplement (RPMI Medium with L-glutamine supplement) Life Technologies 61870010
Triton X-100 (cell lysis buffer) Sigma-Aldrich RES9690T-A101X Use at 1% concentration
Versene (EDTA solution) Life Technologies 15040066
Vitronectin XF Stemcell Technologies  7180
Y-27632 dihydrochloride monohydrate Sigma-Aldrich Y0503-1MG Stock concentration 3 mM, final concentration 10 mM
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Referências

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Lees, E. A., Forbester, J. L., Forrest, S., Kane, L., Goulding, D., Dougan, G. Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens. J. Vis. Exp. (147), e59478, doi:10.3791/59478 (2019).
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