VirWaTest, um método de ponto de uso para a detecção de vírus em amostras de água
Summary
Aqui nós apresentamos VirWaTest, que é um método simples, disponível e portátil para a concentração e a deteção dos vírus das amostras da água no ponto do uso.
Abstract
Vírus excretados por seres humanos e animais podem contaminar fontes de água e representam um risco para a saúde humana quando esta água é usada para beber, irrigação de alimentos, lavagem, etc. O indicador clássico de bactérias fecais nem sempre verifica a presença de patógenos virais para que a detecção de patógenos virais e indicadores virais seja relevante para adotar medidas de mitigação de riscos, especialmente em cenários humanitários e em áreas onde as manifestações virais transmitidas pela água são freqüentes.
Atualmente, vários testes comerciais que permitem a quantificação de bactérias indicadoras fecais (FIB) estão disponíveis para testes no ponto de uso. No entanto, tais testes comerciais não estão disponíveis para a detecção de vírus. A detecção de vírus em amostras de água ambiental requer a concentração de vários litros em volumes menores. Além disso, uma vez concentrada, a detecção de vírus depende de métodos como extração de ácidos nucleicos e detecção molecular (por exemplo, reação em cadeia da polimerase [PCR]-ensaios baseados) dos genomas virais.
O método descrito aqui permite a concentração de vírus de amostras de água de 10 L, bem como a extração de ácidos nucleicos virais no ponto de uso, com equipamentos simples e portáteis. Isso permite o teste de amostras de água no ponto de uso para vários vírus e é útil em cenários humanitários, bem como em qualquer contexto onde um laboratório equipado não está disponível. Alternativamente, o método permite concentrar os vírus presentes em amostras de água e o transporte do concentrado para um laboratório à temperatura ambiente para posterior análise.
Introduction
Durante as primeiras fases de qualquer emergência humanitária, o acesso a fontes de água potável, saneamento e higiene são fundamentais para a sobrevivência dos afetados. Portanto, a monitorização da qualidade da água é uma prioridade para prevenir surtos de águas. É bem sabido que a água contaminada é freqüentemente a origem das doenças, mas muitas vezes é difícil determinar as fontes de surtos virais, como o vírus da hepatite E (HEV), mesmo com a disponibilidade de métodos laboratoriais convencionais. O controle da qualidade da água é baseado na quantificação de FIB1,2,3,4. No entanto, tem sido extensivamente documentado que não há correlação entre a ausência de FIB e a presença de patógenos transmitidos por água viral, como rotavírus (RoV), norovírus (NoV) ou HEV5,6. Assim, o uso dos critérios de qualidade da água baseados em FIB pode resultar em uma subestimação dos riscos associados à presença de patógenos virais transmitidas por águas. A vigilância de vírus indicativos, tais como adenovírus humanos (hadv), ou patógenos específicos seria útil na definição da exposição a patógenos virais e identificando a fonte potencial de infecção humana7,8, 9,10 e na validação da eficácia das medidas sanitárias11.
Até agora, a detecção de vírus nesses cenários dependia de pessoal qualificado e logística complexa. VirWaTest (virwatest.org) destina-se ao desenvolvimento de um método simples, acessível e portátil para a concentração e subsequente detecção de vírus de amostras de água no ponto de uso.
A concentração de vírus é baseada no princípio da floculação orgânica de amostras de água de 10 L, pelas quais os vírus são recuperados em volumes menores12,13. Os flocos são recolhidos e adicionados a um tampão que lise os vírus e impede que os ácidos nucleicos da degradação quando armazenados na temperatura ambiente por não mais de 2 semanas.
O método da extração do ácido nucleico é baseado no uso de partículas magnéticas a que os ácidos nucleicos começ adsorbed. Eles podem ser transferidos de um tampão de lavagem para outro e, finalmente, para o tampão de eluição usando uma pipeta magnética à qual as partículas se unem. As suspensões de ácidos nucleicos virais obtidas podem ser enviadas para um laboratório de referência, onde a detecção pode ser realizada usando métodos moleculares baseados em PCR. Para cada extração de ácido nucleico, duas quantidades diferentes são testadas para descartar a inibição enzimática originada pela amostra. Alternativamente, com a disponibilidade mínima do equipamento, os testes de PCR podem ser executados no ponto de uso. Todo o processo é projetado para ser realizado independentemente de uma fonte de alimentação (Figura 1).
Um ensaio quantitativo de PCR para detectar HAdV, excretado por humanos e encontrado em amostras de águas residuais em altas concentrações, foi adaptado para ser executado no ponto de uso. HAdV são usados como indicadores virais fecais humanos. Um PCR para a quantificação do bacteriófago de MS2 foi adaptado igualmente desde que MS2 é usado em VirWaTest como o controle do processo. O método pode ser personalizado para a detecção de qualquer vírus de interesse.
Após o desenvolvimento, o método VirWaTest tem sido aplicado pelos usuários em duas configurações diferentes na República da África Central (RCA) e no Equador, fornecendo feedback sobre a aplicação do protocolo em situações reais.
A nosso conhecimento, este é o primeiro procedimento que permite a concentração e a deteção dos vírus no ponto de uso, independente de toda a fonte de alimentação, equipamento grande, e condições de congelação/refrigerando. Recomenda-se a coleta de duas repetições de cada amostra de água, a fim de obter resultados robustos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método VirWaTest permite a concentração de vírus e extração de ácido nucleico de amostras de água no ponto de uso por usuários não experientes. É um protocolo acessível, rápido e simples. A concentração baseia-se no princípio da floculação orgânica utilizando leite desnatado, pelo qual o pH baixo e as condições de alta condutividade tornam as proteínas do leite desnatadas agregadas em flocos os vírus adsorver. Quando o sedimento do flocos, é fácil recolhê-los, fazendo o possível concentrar 10…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O VirWaTest foi um projeto de pesquisa financiado pelo programa de fundos de inovação humanitária (HIF) da ELHRA (aprimorando o aprendizado & pesquisa para assistência humanitária). Os autores reconhecem as equipes de WASH que gentilmente colaboraram neste estudo. A análise de amostras no Equador foi financiada pela Oxfam Ecuador e Dirección de Investigaciones de la Universidad de las Americas (AMB. BRT. 17.01). S. Bofill-mas é um companheiro da Serra-caçador na Universidade de Barcelona.
Materials
| 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) | Solis BioDyne | 08-14-00001 | Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions |
| 8-Microtube Strips with Caps | dD Biolab | 840637 | Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR |
| Aquagenx CBT E. coli Kit | Aquagenx, LLC | ECCBT10 | 10 Tests per Kit |
| Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011674 | Includes 12V car power adapter |
| Bucket Support | GenIUL | 900011648 | Aluminium support |
| Bucket, 10 L | Cater4You | 10LTR | Polypropilene, Tamperproof, Clear color |
| Centrifuge Tube, 50 mL | LabBox | CTSP-E50-050 | Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt |
| Citric Acid 1-Hydrate, 500 g | PanReac AppliChem | 1410181211 | Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram |
| Clear PET Bottle | LabBox | FPET-500-088 | Clear Color, PET, Cap Not Included |
| Difco Skim Milk, 500 g | Becton Dickinson | 232100 | Dehydrated |
| DNA/RNA Shield, 250 mL | Zymo Research | R1100-250 | DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL |
| Easy9 Pipette Controller | LabBox | EAS9-001-001 | 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder |
| Eppendorf Tube, 0.5 mL | Eppendorf | 0030121023 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 5 mL | dD Biolab | 999542 | Polypropylene, Sterile, Graduated |
| Ethanol 96% V/V, 1 L | Panreac AppliChem | 361085-1611 | For UV, IR and HPLC |
| Laboratory Tweezers | LabBox | FORS-007-002 | Thin, Curved End, L= 120 mm |
| Magnetic Stirrer | GenIUL | 900017000 | Battery-powered |
| Marker | dD Biolab | 929203 | Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware |
| Micro Rota-Rack for Microtubes | dD Biolab | 37782 | 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm |
| Mini8 Real-Time PCR Cycler | Coyote Biosciences, China | Mini-8 | Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes |
| NucliSens Lysis Buffer | Biomerieux | 200292 | Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature |
| Open Tip Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | 900136N | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| PE Screw Cap PP28 | LabBox | TP28-004-020 | For PET Bottles |
| pH Indicator Strip | LabBox | WSPH-001-001 | Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack |
| Plastic Test Tube | Quimikals | 300913 | Includes Cap |
| Polyethylene Pasteur Pipette | LabBox | PIPP-003-500 | Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL | Deltalab | 409726 | Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL | Deltalab | 409526G | Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL |
| Powder Powder Detergent | – | – | Regular Powder Soap for washing clothes |
| Power Cables for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011692 | Connection between batteries and magnetic stirrers |
| QuickPick Magnetic Tool | BioNobile | 24001 | Hand-held tool for magnetic particles |
| QuickPick Tips in Box | BioNobile | 24296 | RNase-Free, Autoclaved, 96 Units |
| QuickPick XL gDNA Magnetic Particles | BioNobile | SN51100 | 3.2 mL |
| Sea Salts | Sigma-Aldrich | S9883-500G | An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water |
| Silicone Tubing | LabBox | SILT-006-005 | Roll of 5 Meters, Inner ø x Outer ø= 6 x 10 mm |
| Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 – 100.5% | VWR Chemicals | 28244295 | Pellets, 1 Kg |
| Solar Rotary Platform | SOL-EXPERT Group | 70020 | Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams |
| SOLIScript 1-step Probe Kit | Solis BioDyne | 08-57-00250 | Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions |
| SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit | BioTools | 21.141-4197 | Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer). |
| SpinBar Octhaedral Stirring Magnet | dD Biolab | 045926 | Pivot Ring, L x ø = 38 x 8 mm, Blue |
| Tape-End Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | PN10E1 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Tape-End Serological Pipette, 50 mL | Deltalab | 900043 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Termi-DNA-Tor – Nucleic Acid Remover | BioTools | 22001-4291 | Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL |
| Water Molecular Biology Reagent, 1L | Sigma-Aldrich | W4502-1L | Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered |
| Whirl-Pak Bag, 540 mL | Deltalab | 200361 | Stable bottom |
| Zip Lock Plain Bag | LabBox | BZIP-080-100 | Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm |
Referências
- The Sphere Project. . The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , (2011).
- Bartram, J., et al. . Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , (2009).
- World Health Organization. . Guidelines for Drinking-water Quality. , (2011).
- World Health Organization. . 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , (2015).
- Girones, R., et al. Molecular detection of pathogens in water – The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).
- Rodriguez-Manzano, J., et al. Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water. Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).
- Puig, M., et al. Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).
- Carter, M. J. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection. Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).
- Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage. Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).
- Bofill-Mas, S., et al. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator. Water Research. 96, 308-326 (2016).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).
- International Organization for Standardization. . ISO 10705-1:1995: Water quality – Detection and enumeration of bacteriophages – Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , (1995).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).
- Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).
- Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay. Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820 (2011).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
