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Imunologia e Infecção

기능 리포터 시스템으로 특정 진 균의 오 번역 비율 측정

Published: April 26, 2019
doi:
10.3791/59453
, , ,
1Centre for Global Health and Infectious Diseases, Collaborative Innovation Centre for the Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases,Tsinghua University School of Medicine

Summary

이 기사에서는 함수의 이득 리포터 시스템을 사용 하 여 모형 진 균, 마이 박테리아 smegmatis에서 번역 오류 및 오 변환의 특정 비율을 측정 하는 두 가지 보완적인 방법을 제시 합니다. 이 방법은 더 높은 처리량 설정에서 낮은 처리량 또는 상대 오류율로 정확한 오류율을 측정 하는 데 사용 될 수 있습니다.

Abstract

유전자를 단백질로 번역 하는 것은 오류가 발생 하기 쉽습니다. 모델 시스템에서의 번역 오차의 평균 비율은 코 돈 당 1/10000으로 추정 되지만, 실제 오류 비율은 연구 되는 종, 환경 및 코 돈을 따라 크게 달라 집니다. 우리는 이전에 마이 코 박테리아가 아미노 아실 화 된 글루타민과 아스파라긴 tRNAs의 생성을 위한 2 단계 통로를 사용 하 고 이것은 특히에 의해 번역 속도의 변조로 인해 상대적으로 높은 오류율과 연관 되어 있음을 보여 주었다 통로의 필수 구성 요소, amidotransferase GatCAB. 우리는 글루타민에서 글루타민 산의 특정 미 란 률을 측정 하기 위해 마이 카 인 균에 사용 하기 위해 대장균 에서의 오 번역 속도를 측정 하는 데 사용 되었던 renilla반딧불 이중 루시퍼 라 제 시스템을 수정 했습니다. 아스파라긴 코 돈을 위한 코 돈과 아스파라긴. 이 리포터 시스템은 특정 오류율의 정확한 추정, 민감도 부족 및 과도 한 조작 단계에 대 한 요구 사항에 적합 하 여 고 처리량 응용 제품에 부적합 했습니다. 따라서, 우리는 Nluc 루시퍼 라 제 및 녹색 형광 단백질 (GFP)을 사용 하는 두 번째 이득 기능 리포터 시스템을 개발 했는데,이는 중간/높은 처리량 설정에 더 많이 사용 됩니다. 우리는이 시스템을 사용 하 여 미 균의 오 번역을 감소 시킬 수 있는 작은 분자로 서 카스가이 신을 확인 했습니다. 여기에서 설명 하는 기자는 특정 유형의 진 균 오 번역을 측정 하는 데 사용 되었지만, 다양 한 모델 시스템에서 다른 유형의 미 번역을 측정 하도록 수정 될 수 있습니다.

Introduction

분자 생물학에 있는 정보의 흐름은 기능적인 단백질에 유전 정보의 번역을 요구 합니다. 모든 생물학 시스템과 마찬가지로, 유전자 번역도 측정 가능한 오류를 수반 합니다. 번역 오류 비율의 추정치는 통상적으로 코 돈 당 약 1/10000으로 인용 된다 (리 바스 드 푸 플 라 나 외.1). 그러나, 오차 율은 10-5 미만에서 0.05/코 돈1,2,3,5미만까지 매우 다양 하다. 3 개 이상의 차수에 걸친 광범위 한 오차 율은 변환 경로의 여러 단계에서 오류가 발생할 수 있다는 사실 때문입니다. 아미노 아실 화6 에서의 확률, 돌연변이 또는 스트레스 유발 오류 7 , 8 , 9 , ( 10) asparaginyl 및 glutaminyl-trnas5또는 리보솜 디코딩 오류에 대 한 생리 적 미 실릴 화 방법. 0.01/코 돈을 나타내는 매우 높은 오류율은 변환 오류가 생리 적 기능1,12 를 수행 할 수 있으며 그 오 번역은 문맥 별13일 수 있다고 제안 했습니다.

우리와 다른 사람들은 유전자 번역에서 자연적으로 발생 하는 오류가 특히 환경적 스트레스에 적응 하는 것으로 나타났습니다.1,5,12,14,15 ,18. 마이 코 박테리아에서, 2 단계 간접 글루타민/아스파라긴 trna 아미노 실릴 화 경로19에서 발생 하는 오류,20 은 1 차 항 결핵 항생제 리 famp신과 대 한 현저 하 게 증가 된 내성을 초래 5. 따라서, 우리는 작은 분자로 진 균의 오 번역을 감소 시키는 것이 rifampicin에 의해 죽이는 약효를 줄 수 있다고 추측 했습니다. 우리는 자연적으로 발생 하는 아미노 글 리코 시드를 확인 하 고, 마이 박테리아의 오 번역을 감소 시킬 수 있는 화합물로 서, 시험관 내 및 생체 내에서의 진 균을 죽이는 리페 라이 신-매개 하 고,이를 제한 하 고 세계에서 가장 치명적인 병원 체 인 결핵22 의 글로벌 통제력을 위협 하는 리 프 람 신 저항성21의 출현.

번역 오류를 연구 하기 위해, 오 변환 측정 방법을 사용 해야 합니다. 오 번역의 측정을 위해 개발 된 여러 방법이 있다, 각각 장점과 단점. 간단히 말해서, 정밀 질량 분석 법 기반 방법에는 여러 가지 이점이 있으며, 그 중 가장 중요 한 것은 여러 유형의 변환 오류를 감지 하는 새로운 알고리즘을 사용 하면, 상대적으로 공정한 오 번역 측정이 가능 수행18. 그러나, 질량 분 광 법은 오류가 발생 하기 쉬운 간접적인 tRNA 아미노 아실 화 통로 때문에 마이 코 박테리아에서 발생 하는 미 란도 증의 유형을 정확 하 게 하는 탈 아 미드 화 사건의 측정을 위해 아주 적당 하지 않습니다. 이는 질량 분 광 법 (23)에 대 한 샘플의 처리에서 발생 하는 고주파 비 효소 적 탈 아 미드 화 때문에, 매우 높은 배경 신호를 초래 한다. 따라서,이 통로에 있는 과실의 탐지를 위해, 유전 이득 기능 기자는 명백한 이득을 제안 합니다. 특히 적절 한 기능 향상 기자는 배경 비율이 매우 낮아 매우 낮은 오류율11을 측정할 수 있습니다.

병원 성 진 균 결핵 으로 실험을 수행 하기 위해서는 전문 시설과 추가 예방 조치가 필요 하므로 비 병원 성 진 균 m. smegmatis 에서 대부분의 실험을 수행 하 고 이전에 두 종 사이의 결과는 광범위 하 게 비교 된다5,21. 간접 tRNA 아미노 아실 화 통로에 의해 생성 된 마이 코 박테리아에서의 오 번역 속도를 측정 하기 위해, 우리는 대장균에서 리보솜 디코딩 오류를 측정 하기 위해 이전에 개발 된 Renilla반딧불 이중 루시퍼 라 제 시스템을 수정 했습니다 . 11 . 진 균에 사용 하십시오. 우리는 3 개의 특정 한 수정을 했습니다: 원래 리포터가 진 균을 효율적으로 표현 하지 않았기 때문에, 서 열이 코 돈에 최적화 되었고, 루시퍼 라 제의 C-말단 3 개의 아미노산이 반딧불이 라 리 신-류 신- 일부 시스템 (24)에서 인신 매매 신호로 서 주석이 추가 되 고, 이소류신-알라닌-발 린 (25)으로 변형 되었다. 원래 리포터는 루시퍼 라 제 돌연변이가 있는 반딧불의 중요 한 리 신 잔류물을 가졌다. 대신, 우리는 심각 하 게 보존 된 아 스 파르테 이트 (D120) 또는 글루타민 산 염 (E144) 잔류물을 각각 아스파라긴 및 글루타민에 각각25 (그림 1)로 돌연변이 시켰다. 리포터는에 피 솜 테 트 라 사이 클린-유도성 플라스 미드 pUV-tetOR에 클로닝 되었다 ( 재료 표참조). 함수 성 기자는 효소/형광 단백질에 심각 하 게 보존 된 기능 잔류물을 돌연변이 하 여 작동 하지 않습니다11,26. 단백질의 기능적 변형을 합성 하는 번역 (또는 이론적으로 전사) 오류는 변환 된 단백질의 서브셋에서 측정 가능한 효소 활성을 초래할 것 이다. 단백질 풍부의 변화를 교정 하기 위해, 돌연변이 리포터는 벤치 마크로 작용 하는 기능적 단백질과 함께 공동 발현 되며, 기능11의 이득에 대 한 정확한 정량화를 가능 하 게 합니다. Renilla반딧불 듀얼 루시퍼 라 제 리포터는 특정 한 마이 박테리아의 오 번역 률5,25 (그림 2 와 섹션 1)를 정확 하 게 측정할 수 있었지만, 신속 하 게 미 번역 속도를 바꾸는 분자의 중/고 처리량 스크리닝에는 적합 하지 않다는 것을 깨달았습니다. 이것은 주로 두 가지 이유, 즉 a) Renilla 루시퍼 라 제의 효능의 상대적인 부족은 미 역 율을 측정 하기 위해 최소 1 mL의 진 균 배양/시료가 필요 하 고 b) 전에 세포의 용 해에 대 한 요구 사항을 의미 합니다 과도 한 수동 처리에 필요한 효소 활성 측정: 진 균 세포는 두껍고 다층의 세포 벽과 용 해에 상대적으로 저항성이 있는 외피를가지고 있습니다. 따라서 우리는 작은 부피 (예를 들어, 96 웰 플레이트 시스템)에서 사용할 수 있고 측정을 위해 세포 용 해를 필요로 하지 않았던 새로운 함수 이득 리포터 시스템을 개발 하고자 했습니다. 우리는 매우 강력한 Nluc 루시퍼 라 제를 사용 하 고 아스파라긴로 돌연변이 할 때 2 개의 로그 기능 손실이 발생 하는 중요 한 아 스 파르테 이트 잔류물을 확인 했습니다 (그림 1). 더욱이, Nluc의 작은 크기는 Nluc가 배양 상층 액으로 분 비 되는 것을 허용 하 고이에 대 한 요구 사항을 회피 할 수 있도록 하는, 진 균27 의 주요 분 비가 있는 항 원 인 85A에서 N-말단 분 지 신호 태그를 갖도록 허용 세포 용 해. 벤치 마크 단백질 인 GFP는 돌연변이 된 Nluc와 동일한 프로모터 로부터 발현 되었으나 통합 된 벡터 로부터 ( 물질의 표를 참조), 온전한 세포 (도321)에서 측정 될 수 있었다. 이러한 장점에도 불구 하 고, Nluc/GFP 리포터 (프로토콜의 섹션 2)에는 또한 단점이 있다: D140N 돌연변이에의 한 Nluc 활성 (100 배)에서 비교적 겸손 한 감소는 극히 낮은 오 번역 속도의 측정을 허용 하지 않을 것 이며, 리포터를 번역 오류의 정확한 측정 보다 스크리닝 도구로 더 적합 하 게 만들기. 또한, Nluc에는 중요 한 글루타민 산 염 잔기가 없습니다. 따라서 아스파라긴-아스파라긴 오류율만 측정 될 수 있습니다. 이 작품에서 설명 하는 일반적인 원칙 연구자 중 하나를 사용 하 여 이러한 기자를 허용 한다 또는 수정 기자는 그들의 모델 시스템에서 다른 특정 번역 오류 비율의 정확 하 고/또는 간편한 측정에 대 한 적절 한. 선택.

Protocol

1. Renilla반딧불 이중 루시퍼 라 제 리포터 참고: 이 메서드의 시각적 표현은 그림 2를 참조 하십시오. -80 ° c 재고에서 2 mL의 7H9 배지를 사용 하 여 진 균 리포터 균 주를 접종 합니다. 야생 형 이중 루시퍼 라 제 뿐만 아니라 돌연변이 Renilla (리포터) 균 주는 오 번역 속도의 계산을 허용 하기 위해 사용 될 필요가 있습니다 (1.7 단계 참조). OD600 이 정지 단계 (od > 3)에 도달할 때까지 1 ~ 2 일 동안 37 ° c에서 흔 드세요. 약 0.1-0.5의 주위에 OD600nm 에 희석 하십시오. 일반적인 실험을 위해, 3 개의 독립적인 생물학 복제 문화를 사용 하십시오. 유도성 프로모터에 의해 제어 되는 리포터 발현의 테 트 라 사이 클린 아날로그 유도 제 (ATC)는 50 ng/mL의 최종 농도로. 카스가이 친의 효과를 측정 하는 것은 번역 속도21에서 카스가이 신 (표시 된 용량에 대해 그림 4 참조)과 같은 시간에 다른 복용량을 추가 합니다. 각 리포터에 대해 적어도 하나의 비 유도 된 제어를 포함 하는 것이 중요 하다는 점에 유의 한다. 배양-4-6 h에서 37 ° c에 대 한 문화를 유도 한다. 세균 배양 액을 2 mL 튜브로 이송 하 고, 실 온에서 5 분 동안 3220 x g 에서 원심 분리 하 여 박테리아를 펠 렛 한다. 상층 액을 버리십시오. 이중 증류수로 희석 (1:1) 하는 1x 패시브 용 해 완충 액 (루시퍼 라 제 키트에 의해 공급 됨)의 40 μ l를 첨가 하 여 박테리아를 교란 시킵니다. 재현 탁 박테리아 용 해물을 흰색 96 웰 플레이트, 시료 당 한 개의 웰에 옮겨 넣고 실 온에서 20 분간 흔들어 줍니다.주의: 용 해 완충 액 (30 분 이상)에 박테리아를 과다 하 게 배양 하지 마십시오. 각 웰에 반딧불 기질 80 μ l를 추가 하 고 15 초 동안 흔들어서 1000 ms로 루미 노 미터에의 한 발광을 통합 시간으로 측정 하십시오. 자동 인젝터 또는 멀티 채널 파이 펫을 사용 하 여 파이 펫 팅 오류를 방지 하십시오. 각 웰에 렌 딜 라 기판의 80 μ l를 추가 하 고 15 초 동안 흔들어 준 후 1000 ms와 함께 루미 노 미터에의 한 발광을 통합 시간으로 측정 하십시오. 배경 발광을 빼는 방법-측정 된 값에서 야생 형 m. smegmatis (예: 기자를 포함 하지 않음) 또는 유도 되지 않은 리포터 파쇄 물을 사용 하 여 측정 했습니다. 수정 된 값을 사용 하 여 DN이 돌연변이 리포터 변형의 활동을 참조 하는 다음 수학식11,25를 사용 하 여 각 조건의 오 번역 비율을 계산 합니다. 2. nluc/GFP 리포터 참고: 이 메서드의 시각적 표현은 그림 3을 참조 하십시오. 세균 리포터 균 주를-80 ° c의 주식에서 2 mL의 7H9 배지로 접종 합니다. OD600 이 정지 단계 (od > 3)에 도달할 때까지 1 ~ 2 일 동안 37 ° c에서 흔 드세요. 50 mL의 서브 컬쳐를 7H9 배지로 하 고 OD600 이 늦은 정지 단계에 도달할 때까지 성장 한다 (> 4). 96 웰 플레이트에 박테리아를 인용 하기 전에, 50 ng/mL의 최종 농도에서 ATC를 추가 하 고 잘 섞는다. 벌크 배양의 유도는 모든 웰이 동일한 양의 유도 인자를 포함 하 고 리포터의 유도가 동기화 되도록 보장 합니다. 깨끗 하 고 둥근 바닥의 96-웰 플레이트에 박테리아를 분 비 하 고, 각 웰에는 100 μ l의 볼륨을 제공 합니다. 미 란에 영향을 미치는 작은 분자에 대 한 화면을 하기 위해, 표시 된 농도에 화합물을 추가 하 여 우물을 선택 합니다. 이 프로토콜의 목적상, 그림 5에 나타난 복용량에서 카스가 야 신을 그림으로 사용 하십시오. 다른 복용량을 추가 합니다 카스 gamycin를 선택 우물 (각 실험 그룹은 적어도 두 개의 생물학적 복제를 포함 해야 합니다). 16-20 시간 동안 37 ° c에서 샘플을 흔들어 유도 하십시오.참고: 필름으로 판을 밀봉 할 필요가 있다. 또한, 모든에 지 웰은 시험 우물에서 증발을 제한 하기 위해 멸 균 수의 적어도 200 μ l로 채워질 필요가 있습니다. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 각 웰에서 80 μ l를 복용 하 고 샘플을 검은색 96-웰 플레이트 (형광 신호 측정을 최대화 하는)로 전송 하십시오. 루미 노 미터의 GFP 신호를 적분 시간으로 20ms로 측정 합니다. GFP 신호를 측정 한 후에, 플레이트를 3220 x g 에서 10 50 분 동안 원심 분리기를 흰색 바닥 96-웰 플레이트 (형광 신호 측정을 최대화 하는)에 넣고, nluc 기판의 50 μ l를 각 웰에 추가 하 고, 잘 섞어 1000 ms로 루미 노 미터에의 한 발광을 적분 시간으로 측정 한다. 수정 된 Nluc 발광 값을 GFP 형광으로 나누어 Nluc/GFP 비율을 결정 하십시오 .이 측정 (임의 단위)은 아스파라긴의 오 번역을 위한 아 스 파르테 이트의 상대적인 척도입니다.

Representative Results

이 작품에 사용 된 두 리포터 시스템의 일반적인 개요를 보여주는 만화는 도 1에 도시 되어 있다. 프로토콜의 섹션 1에 대 한 개요는 그림 2 와 그림 3의 섹션 2에 대 한 개요와 같습니다. 이 균의 오 번역에 대 한 카스가이 친의 효과를 도 4에 나타내 었으 며, renilla반딧불 리포터 시스템으로 측정 하였다. 카 츠 gamycin 행동의 특이성을 보여주기 위해, 리포터는 또한 Ksga 가 결실 된 m. smegmatis 의 변형으로 표현 되었다 (∆ ksga). KsgA는 rRNA 디 메 틸 트랜스퍼 라 제이 고, ksga-결실 된 균 주는 카스가 감 ycin에 상대적으로 내성 이다. 또한,도 5에 나타난 바와 같이 nluc/GFP 리포터를 이용 하 여 번역을 측정 하였다. 그림 1 : 두 가지 기능 향상 리포터 시스템을 보여주는 만화. (A) renilla반딧불 리포터 시스템은 융합 단백질로 발현 되 고 테 트 라 사이 클린 유도성 프로모터의 제어 하에 2 개의 루시퍼 라 제 효소로 구성 된다. 야생 형 이중 효소의 발현은 레닌 과 반딧불 luciferases (top) 모두의 높은 측정 가능한 활성을 초래 한다. 중요 한 아 스 파르테 이트 잔류물, D120의 돌연변이는 아스파라긴에 레닌 효소 (D120N) 비활성을 렌더링 하지만, 반딧불 루시퍼 라 제은 여전히 활성 이다. 아 스 파르테 이트에 대 한 아스파라긴의 잘못 된 번역 (이 경우, 생리 적으로 미 아실 화 된 Asp-trna의 trna5에서,21)은 변환 된 renilla 단백질의 작은 비율을 초래 하 여 활동을 얻고, 측정할 수 있습니다. 돌연변이 리포터의 Renilla/반딧불의 활동 비교는 야생 형 이중 효소와 비교 하 여 아스파라긴의 스 파르테 이트 미 번역 속도에 대 한 계산을 허용 한다. (B) nluc/GFP 리포터 시스템은 유사한 원리로 작동 한다. 돌연변이 된 Nluc (D140N) 유전자는 주요 분 비 된 진 균 단백질을 항 원 85A에서 유래한 N-말단 분 비가 신호를 가진다. Nluc 및 gfp 유전자는 모두 동일한 테 트 라 사이 클린-유도성 프로모터 로부터 발현 되어, 상대 발현 벤치 마크로 서의 gfp의 사용을 허용 한다. 야생 형 Nluc 제어 변형의 부족을 주의:이 리포터는 주로 상대 오 번역 속도의 측정이 기본 화면에 충분 한 스크리닝에 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 2 : Renilla반딧불 리포터를 사용 하 여 번역 속도를 측정 하는 개요 (프로토콜의 제 1 항). 루시퍼 라 제 리포터를 발현 하는 플라스 미드로 형질 전환 된 m. smegmatis의 신선한 문화가 성장 하 고 있습니다. 리포터 발현이 유도 되 고, 시험용 화합물 또는 조건이 시험 된다. 다음 4-6 h 리포터 발현, 배양은 펠 릿 및 용 해 및 용 해물은 루시퍼 라 제 활동에 대 한 테스트 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3 : 번역 율 측정의 개요 Nluc-GFP 리포터 (프로토콜의 제 2 항). Nluc 및 GFP 기자로 형질 전환 된 m. smegmatis의 신선한 문화는 시험 될 모든 판을 위한 충분 한 부피로 성장 합니다 (10 mL/96 웰 플레이트를 가정). 세균 배양을 각각의 웰에 피 펫 팅 하기 직전에, 상기 리포터를 벌크 배양에 첨가 하 여 발현을 유도 한다. 밤새 흔들어 우물을 배양 합니다. 상대적인 오 디 션 속도를 측정 하려면 (형광 검출의 민감도를 높이기 위해) 검은 판으로 배양을 전송 하 고, GFP 형광을 측정 한 다음, 플레이트를 아래로 돌려 박테리아를 펠 릿으로 돌립니다. Nluc 활성 측정을 위해 상층 액을 흰 판으로 옮겨 준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 4 : Renilla의 반딧불 리포터를 사용 하 여 다른 균 주에 있는 카스 gamycin의 존재에 대 한 미 번역 속도를 측정 한 대표적인 결과입니다. 아스파라긴에 대 한 아 스 파르테 이트의 미 번역 율 (A) 야생 형 m. smegmatis 및 (B)는 renilla-반딧불 이중으로 측정 된 것으로 서, kga (∆ ksga)와 함께 처리 한 후에, ksga 에 대 한 균 주가 삭제 된다. 기자. 배양은 세포 용 해 및 측정 전에 6 시간 동안 표시 된 용량 (마이크로 그램/밀리 리터)에서 카스가이 신으로 치료 되었습니다. 수정 된 렌/FF 비율 (y 축)은 아스파라긴의 미 번역 속도에 대 한 스 파르테 이트를 나타냅니다. Ksga 의 삭제는 카스 gamycin에 의해 변조에 더 저항 하는 더 높은 기준선 미 번역 속도를 초래 한다. 막대는 표준 편차를 오류로 하는 평균값을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 5 : Nluc-GFP 리포터를 사용 하 여 카 즈 gamycin의 존재 하에서의 미 번역 속도를 측정 한 대표적인 결과. 아스파라긴에 대 한 아 스 파르테 이트의 상대적인 미 번역 율은 nluc/GFP 리포터에 의해 측정 된 바와 같이, 카 즈 gamycin (ksg)의 하룻밤 (16 시간)으로 처리 하였다. 막대는 표준 편차를 오류로 하는 평균값을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

여기에 설명 된 프로토콜은 다양 한 유기 체에서의 번역 속도 측정을 위해 조정 될 수 있습니다. 프로토콜을 다른 시스템에 적용할 때 염두에 두어야 하는 여러 가지 고려 사항이 있습니다. 먼저 측정의 목적을 고려해 야 합니다. 함수 이득 리포터를 사용 하 여 번역 속도를 정확 하 게 측정 하기 위해 필요한 것은 (a) 강력한 판독 분석 (예: 효소 기능,이 경우 루시퍼 라 제 활성)을 광범위 한 선형 범위로 하는 것입니다. 또한 (b) 리포터 단백질의 중요 한 잔류물에서 돌연변이가 상실 되어 예상 되는 오 번역 속도 보다 아래에 있는 기능 손실이 매우 심각 하다는 것을 찾아본다. 예를 들어, 측정 되는 예상 되는 오 번역 속도가 대략 10-3/코 돈 인 경우, 함수 돌연변이의 손실은 1000 보다 커야 합니다; 그렇지 않으면, 오 번역 이벤트의 더 낮은 범위는 민감하게 감지 되지 않습니다. 마지막으로, 기능 기자를 사용 하 여 번역 속도를 정확 하 게 측정 하기 위해 (c) 강력한 벤치 마크 리포터가 필요 합니다-이 경우 프로토콜의 섹션 1에 대 한 반딧불이 루시퍼 라 제. 이상적으로 벤치 마크 리포터는 돌연변이 된 효소 리포터에 융합 되어야 하며 (모든 의도 및 목적을 위해) 모두 등 몰 비율로 표현 된다는 것을 보장 합니다. 벤치 마크 (및 기본 리포터) 판독은 노출 된 환경에 섭 동에 견고 해야 합니다. 예를 들어, 야생 형 GFP의 형광은 pH28의 변화로 인 한 교란에 매우 민감 하며,이는 대 식 세포에 상주 하는 포식 된 진 균에서의 오 번역 속도 측정을 위한 벤치 마크로 부적합 하 게 만드는 것입니다. pH 729이 하입니다. 한편, 소 분자 스크리닝과 같은 어플리케이션의 경우, 일차 화면에 대 한 가장 중요 한 고려 사항은 측정의 재현성 (즉, 정밀도와는 대조적으로), 수동 핸들링의 최소화 및 작은 문화권 볼륨입니다. 번역 속도의 정확한 측정은 덜 중요 하며 이차 분석으로 수행 될 수 있습니다. 마지막으로, 루시퍼 라 제 효소의 효소 기능에 기초 하 여이 프로토콜에서 설명 하는 기자는 세균 인구의 오 번역 율만을 측정 하지만 단일 세포 이질성에 대 한 정보를 제공 할 수 없다는 점에 유의 해야 합니다 번역 속도의 변동. 적응형 표현 형 (31)32에서의 단일 전지 가변성의 중요성을 감안할 때, 오 번역 이벤트의 측정을 위한 형광 리포터가 개발 되었다12,33 , 마이 균의 오 번역 측정을 포함 하 여5.

오 번역의 측정을 위한 요구 사항을 고려 하는 것은,이 프로토콜에 기술 된 것과 같은 유전 이득 기능 기자는 한 종류의 미 번역 (즉, 하나를 위한 아미노산 치환)만 측정할 수 있음에 유의 해야 합니다. 코 돈) 당. 따라서 다른 오 번역 이벤트의 측정을 위해 여러 개의 기자 들이 필요 합니다. 예를 들어, lysyl에의 한 위치에서의 리보솜 코 돈에의 한 리 포 솜 디코딩 오류에의 한 오 번역의 측정을 위해, 적어도 16 명의 기자 들이 요구 된다2,3,11. 고정밀 질량 분 광 법 및 생물 정보학은 다양 한 유형의 오 번역 이벤트를 동시에 잠재적으로 식별할 수 있도록18; 그러나, 이러한 방법 또한 경고와 함께 제공. 일반적으로, 그들은 함수의 이득 기자 보다 덜 정확 합니다. 더욱이, 앞서 언급 한 바와 같이, 그들은 특정 유형의 오 번역을 검출 하는 데 적합 하지 않으며, 즉 비 효소 적 탈 아 미드 화 (23)와 함께 수축 될 수 있는 것 들이다. 최종적으로, 질량 분 광 법은 중간 또는 높은 처리량 스크리닝을 위한 판독으로 서 부적합 하다.

다른 시스템에서의 오 번역의 측정을 위한 이러한 기자 및 프로토콜의 적응을 위해, 추가 고려 사항은 원하는 모델 시스템에서 리포터의 강력한 발현을 포함 한다. 우리는 처음에 수정 없이 우리의 진 균 시스템에 Farabaugh와 동료에 의해 개발 된 이중 루시퍼 라 제 시스템을 사용 하는 것을 시도 했지만, 리포터 표현의 부족으로 인해 성공 하지 못했다. 광범위 한 문제 해결은 코 돈-최적화와 리포터의 경미한 서 열 변형이 모두 견고한 식25 를 허용 하도록 요구 되었다는 것을 확인 했습니다 (위 참조). 다른 시스템에서 사용 하기 위해서는 기자 들의 유사한 조정이 필요할 것 이라고 생각할 수 있습니다.

마지막으로, 측정 중인 오 번역 이벤트의 유형을 고려해 야 합니다. 예를 들어, 스톱 코 돈 판독을 측정 해야 하는 경우 (넌센스 억제), 정지 코 돈의 손실 기능 돌연변이는 일차 리포터 단백질34의 경계 영역 내에 도입 될 필요가 있다. 그렇지 않으면 중요 한 잔류물을 회복 하는 특정 말도 안 되는 사건 (그리고 따라서 리포터 기능)만이 분석에 의해 측정 될 것 이며,이는 잠재적으로 진정한 미 번역 비율의 실질적인 과소 평가로 이어질 것입니다. 많은 수의 유기 체1,12,13,35에서 번역 오류가 가능한 적응형 역할을 수행 한다는 증거가 증가 하 고 있다. 그러나, 오 번역 이벤트의 측정은 여전히 작은에 제한, 모델 종의 성장 이기는 하지만. 미 역을 측정 하는 민감한 방법의 적응은 생리학 및 병리학에서 번역 오류의 역할에 대 한 과학자의 이해를 더욱 높일 수 있는 잠재력을가지고 있습니다.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 빌과 멜 린다 게이츠 재단 (OPP1109789), 중국의 국립 자연 과학 재단 (31570129), 그리고 B.J. B.J.에 의학의 칭화 대학 학교에서 창업 자금에서 보조금에 의해 지원 되었습니다. (207487/17z).

Materials

Middlebrook 7H9 BD Difco 271310
anhydrotetracycline Cayman Chemical  10009542
kasugamycin sigma K4013
Dual-luciferase reporter assay system promega E1960
Nano-Glo luciferase assay promega N1120
Fluoroskan Ascent FL luminometer Thermo /
Assay Plate, 96 Well White, Flat Bottom High Binding, No Lid Costar 3922
Assay Plate, 96 Well Black, Flat Bottom High Biding, No Lid Costar 3925
96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid Costar 3599
Non-commercial reagents (plasmids)
pUV-TetOR-RenFF NA NA episomal shuttle plasmid that allows tetracycline-inducible expression of the wild-type dual luciferase reporter
pUV-TetOR-Ren-D120N-FF dual-luciferase reporter with mutated Renilla
pUV-TetOR-Ag85ASec-Nluc-D140N NA NA episomal shuttle plasmid with a tetracyclin-inducible secretable version of mutated Nluc luciferase
pMC1S-GFP NA NA Mycobacterial integrated (L5 site) vector for tetracycline-inducible expression of GFP
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Referências

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MycobacteriumMistranslation RatesGain-of-function ReporterNluc/GFP AssayAntibiotic ToleranceProtein Synthesis Errors7H9 MediumOD 600ATCKsgPassive Lysis BufferFirefly SubstrateRenilla SubstrateLuminometer

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Chen, Y., Pan, M., Chen, Y., Javid, B. Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems. J. Vis. Exp. (146), e59453, doi:10.3791/59453 (2019).
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