JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Neurociência

Sanntid i Vitro overvåking av Odorant reseptor aktivering av en Odorant i damp fase

Published: April 23, 2019
doi:
10.3791/59446
, , , ,
1Department of Molecular Genetics and Microbiology,Duke University Medical Center, 2Department of Biotechnology and Life Science,Tokyo University of Agriculture and Technology, 3Department of Neurobiology,Duke University Medical Center, 4Department of Mechanical Systems, Engineering,Tokyo University of Agriculture and Technology, 5Institute of Global Innovation Research,Tokyo University of Agriculture and Technology, 6Duke Institute for Brain Sciences,Duke University

Summary

Fysiologisk aktiveres odorant reseptorer av odorant molekyler inhalert i damp fase. Men benytter mest i vitro systemer flytende fase odorant stimulering. Her presenterer vi en metode som gjør at sanntid i vitro overvåking av odorant reseptor aktivisering på odorant stimulering i damp fase.

Abstract

Olfactory oppfatning begynner med samspillet av odorants med odorant reseptorer (eller) uttrykt av olfactory sensoriske neurons (OSN). Lukt anerkjennelse følger en kombinasjon koding ordningen, der en eller kan aktiveres ved et sett med odorants og én odorant kan aktivere en kombinasjon av ORs. Gjennom slike kombinasjon koding, kan organismer oppdage og diskriminere imellom en myriade av flyktige lukt molekyler. Dermed kan en lukt i en gitt konsentrasjon beskrives av en aktivisering mønster av ORs, som er spesifikk for hver lukt. I den forstand, sprengning mekanismer som hjernen bruker oppfatter lukt krever forståelse odorant-OR interaksjoner. Det er derfor luktesans samfunnet er forpliktet til “de-orphanize” disse reseptorene. Konvensjonelle i vitro systemer brukes til å identifisere odorant- eller interaksjoner har utnyttet rugende cellen media med odorant, som er forskjellig fra naturlige påvisning av lukt via damp odorants oppløsning i nasal mucosa før samarbeidsstil ORs. Her beskriver vi en ny metode som tillater sanntids overvåking av OR aktivisering via damp-faset odorants. Vår metode er avhengig av måle leiren utgivelsen av luminescence bruker Glosensor analysen. Det bygger gjeldende gapene mellom i vivo og in vitro tilnærminger og gir et grunnlag for en biomimetic flyktige kjemiske sensor.

Introduction

Luktesans kan terrestriske dyr å samhandle med flyktige kjemiske miljøet å kjøre atferd og følelser. Fundamentalt, lukt søkeprosessen starter med første samspillet av odorant molekyler med olfactory system på nivået av odorant reseptorer (ORs)1. I pattedyr uttrykkes individuelt ORs i olfactory sensoriske neurons (OSNs) ligger i olfactory epitel2. De hører til G-protein kombinert reseptor (GPCR) familien og mer presist til rhodopsin-lignende sub familien (også kalt klasse A). ORs par med stimulerende G protein Golf som aktivering fører til leiren produksjon etterfulgt av åpningen av syklisk nukleotid gated kanaler og generering av handlingen potensialer. Det er akseptert som en odor percept er avhengig av et bestemt mønster i aktivert ORs3,4 og derfor lukt anerkjennelse følger en kombinasjon koding ordningen, der en eller kan aktiveres ved et sett med odorants og én odorant kan aktivere en kombinasjonen av ORs. Og gjennom slike kombinasjon koding, er det postulerte at organismer kan oppdage og diskriminere imellom en myriade av flyktige lukt molekyler. En av nøklene til å forstå hvordan lukt oppfattes er å forstå hvordan og som ORs aktiveres en gitt lukt.

Å belyse odorant- eller interaksjoner, in vitro funksjonelle analyser har spilt en viktig rolle. Identifikasjon av Agonistiske illeluktende ligander for frittstående ORs (OR de orphanization) har vært et svært aktivt felt i de siste tyve årene, ved hjelp av ulike i vitro, ex vivo og i vivo funksjonelle analyser5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17.

In vitro analysen systemer er best egnet for detaljert funksjonelle karakterisering av ORs, inkludert identifisering det funksjonelle og kritisk rester av ORs, samt mulige tekniske programmer. Men har videre utvikling av verdifulle i vitro systemer for ORs vært en utfordring, delvis på grunn av problemer med dyrking OSNs og funksjonelle uttrykk for ORs i heterologous celler. Den første utfordringen var å etablere protokoller som tillatt til cellen overflaten uttrykk for funksjonell ORs i tilordningen av odorant-OR interaksjoner. Flere uavhengige grupper har utnyttet ulike tilnærminger5,6,7,8,9,10,11,12, 14,18,19,20. En av de tidligste prestasjonene ble gjort av Krautwurst et al. i merket N-terminus av ORs med en forkortet sekvens av rhodopsin (Rho-koden) og observert forbedret overflaten uttrykk i menneskelige embryonale nyre (HEK) celler13. Variasjoner gjort i koden knyttet til OR sekvensen er fortsatt en bane utforsket for å forbedre OR uttrykk og funksjonalitet19,21. Saito et al. deretter identifisert reseptor-transport protein 1 (RTP1) og RTP2 som letter OR menneskehandel. 22 en kortere versjon av RTP1, kalt RTP1S, har også vist å være enda mer effektiv enn den opprinnelige protein23. Utviklingen av en celle linje (Hana3A) som uttrykker stabilt Golf, REEP1, RTP1 og RTP2 24, kombinert med bruk av syklisk adenosin monofosfat (cAMP) journalister har aktivert identifikasjon av odorant-OR interaksjoner. Mekanismen som RTP familien av proteiner fremmer celle overflaten uttrykk for ORs gjenstår å fastsettes.

En påminnelse av disse etablerte metoder er at de er avhengige av odorant stimulering i flytende fase, betyr at odorants pre oppløst i en stimulering medium og stimulere celler ved å erstatte medium. Dette er svært forskjellig fra de fysiologiske forholdene der odorant molekyler nå olfactory epitel i damp fase og aktivere ORs ved oppløsningen til nasal mucosa. Slik nærmere fysiologisk relevante stimulans eksponering, Sanz et al.20 foreslått en analyse basert på damp stimulering ved å bruke en dråpe odorant løsning å henge under indre overfor en plastfilm på oversiden av cellen brønner. De spilte inn kalsium svar ved å overvåke fluorescens intensitet. Denne metoden var først til å bruke air-fase odorant stimulering, men det gjorde ikke tillate en stor screening av OR aktivisering.

Her utviklet vi en ny metode som gir sanntids overvåking av i vitro OR aktivisering via damp fasen odorant stimulering av Glosensor analysen (figur 1). Denne analysen er brukt tidligere i forbindelse med flytende odorant stimulering18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31. overvåking chamber of the luminometer er første equilibrated med fordampede odorant før plate lese (figur 1A). Odorant molekyler er da solvated inn i bufferen, bading Hana3A celler uttrykke eller interesse, RTP1S og Glosensor proteiner (figur 1B). Hvis odorant er en Agonistiske av OR, vil eller bytte til en aktivert konformasjon binde Golf, aktivere adenylyl cyclase (AC) og til slutt føre til leiren nivåer å stige. Denne stigende leiren vil binde til og aktivere Glosensor protein for å generere luminescence utløse luciferin. Denne luminescence deretter spilles av på luminometer og gjør OR aktivisering overvåking. Denne metoden er av høy rente i sammenheng med OR deorphanization som det bringer i vitro systemer nærmere til naturlige oppfatning av lukt.

Protocol

1. Hana3A celler kultur Forberede M10 (minst viktig Medium (MEM) pluss 10% v/v fosterets bovin serum (FBS)) og M10PSF (M10 pluss 100 µg/mL penicillin-streptomycin og 1,25 µg/mL amfotericin B). Kultur cellene i 10 mL av M10PSF i en 100 mm celle kultur parabol i en inkubator satt på 37 ° C og 5% karbondioksid (CO2). Dele cellene hver 2 dager i 20% forholdet: når 100% samløpet av celler (ca 1.1 x 107 celler) er observert under fase kontrast mikroskop, aspire media og…

Representative Results

Vi vist responsen av tre mus ORs, Olfr746, Olfr124 og Olfr1093 bruker cinnamaldehyde damp stimulering (Figur 3). Samtidig, vi brukte en tom vektor kontroll (Rho-pCI) for å sikre at odorant-indusert aktiviteter testet ORs var bestemt (Figur 3A). Sanntid aktivering av ORs på damp odorant stimulans var overvåket over 20 målesykluser. Dataene for hver var godt først normalisert tom vektor kontroll gjennomsnitt verdi for hver syklus (<strong cla…

Discussion

Oppfatningen av lukt er fundamentalt avhengig aktivering av ORs. Følgelig kreves forståelse av funksjonaliteten å sprekk de komplekse mekanismene som hjernen bruker oppfatter sin flyktige kjemisk miljø. Imidlertid har forståelse av denne prosessen vært hemmet av vanskelighetene med å etablere en robust metode til skjermen OR repertoaret funksjonalitet mot odorants i vitro. Celle overflaten og heterologous uttrykk for ORs har vært delvis løst ved etableringen av merket reseptorer13</sup…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra NIH (DC014423 og DC016224) og Defense Advanced Research Project Agency RealNose prosjektet. YF bodde ved Duke University med finansiell støtte fra JSP Program for fremme strategiske internasjonale nettverk å akselerere sirkulasjon av dyktige forskere (R2801). Vi takker Sahar Kaleem for redigering av manuskriptet.

Materials

0.05 % trypsin-EDTA Gibco 25300-054 0.05% Trypsin – EDTA (1x), phenol red – store at 4°C
100 mm cell culture dish  BD Falcon 353003 100 mm x 20 mm cell culture dish 
15 mL tube BD Falcon 352099 17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate Corning 3843 96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin Gibco 15290-018 Amphotericin B 250 µg/mL – store at 4°C
centrifuge machine Jouan C312 Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood NUAIRE NU-407-500 fumehood for cell culturing
FBS Gibco 16000-044 Fetal Bovine Serum – store at -20°C
GloSensor cAMP Reagent Promega E1290 GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate – store at -20°C
Incubator 37 °C; 5 % CO2 Fisher Scientific 11-676-604 Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent Invitrogen 11668-019 Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent – store at 4°C
Luminometer POLARstar OPTIMA BMG LABTECH discontinued 96 well plate reader for luminescence
Mineral oil Sigma M8410 Solvent for odorants – store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM) Corning cellgro 10-010-CV Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine – store at 4°C
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich P4333 Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin – store at -20°C
pGlosensor Promega E2301 pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid – store at 4°C
phase contrast microscope Leica 090-131.001 phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S H. Matsunami lab – 100 ng/µL plasmid – store at 4°C
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
  2. Serizawa, S., Miyamichi, K., Sakano, H. One neuron-one receptor rule in the mouse olfactory system. Trends in Genetics. 20 (12), 648-653 (2004).
  3. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
  4. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
  5. Peterlin, Z., Firestein, S., Rogers, M. E. The state of the art of odorant receptor deorphanization: a report from the orphanage. The Journal of General Physiology. 143 (5), 527-542 (2014).
  6. Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science Signal. 2 (60), (2009).
  7. Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2, 4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods. Chemical Senses. 42 (3), 181-193 (2017).
  8. Nishizumi, H., Sakano, H. Decoding and deorphanizing an olfactory map. Nature Neuroscience. 18 (10), 1432 (2015).
  9. Wetzel, C. H., et al. Functional expression and characterization of a Drosophila odorant receptor in a heterologous cell system. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (16), 9377-9380 (2001).
  10. Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (7), 4040-4045 (1999).
  11. Levasseur, G., et al. Ligand-specific dose-response of heterologously expressed olfactory receptors. European Journal Of Biochemistry. 270 (13), 2905-2912 (2003).
  12. Zhao, H., et al. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
  13. Krautwurst, D., Yau, K. -. W., Reed, R. R. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell. 95 (7), 917-926 (1998).
  14. Wetzel, C. H., et al. Specificity and Sensitivity of a Human Olfactory Receptor Functionally Expressed in Human Embryonic Kidney 293 Cells andXenopus Laevis Oocytes. Journal of Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
  15. Kajiya, K., et al. Molecular bases of odor discrimination: reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. Journal of Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
  16. Jiang, Y., et al. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1446 (2015).
  17. Von Der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1455 (2015).
  18. Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. A butter aroma recombinate activates human class-I odorant receptors. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (43), 9410-9420 (2015).
  19. Noe, F., et al. IL-6-HaloTag® enables live-cell plasma membrane staining, flow cytometry, functional expression, and de-orphaning of recombinant odorant receptors. Journal of Biological Methods. 4 (4), 81 (2017).
  20. Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -. C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical Senses. 30 (1), 69-80 (2005).
  21. Shepard, B. D., Natarajan, N., Protzko, R. J., Acres, O. W., Pluznick, J. L. A cleavable N-terminal signal peptide promotes widespread olfactory receptor surface expression in HEK293T cells. PLoS One. 8 (7), 68758 (2013).
  22. Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
  23. Wu, L., Pan, Y., Chen, G. -. Q., Matsunami, H., Zhuang, H. Receptor-Transporting Protein 1 Short (RTP1S) Mediates the Translocation and Activation of Odorant Receptors by Acting through Multiple Steps. Journal of Biological Chemistry. , (2012).
  24. Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature Protocols. 3 (9), 1402 (2008).
  25. Zhang, Y., Pan, Y., Matsunami, H., Zhuang, H. Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay. Journal of Visualized Experiments. (128), e55831 (2017).
  26. Li, S., et al. Smelling sulfur: Copper and silver regulate the response of human odorant receptor OR2T11 to low-molecular-weight thiols. Journal of the American Chemical Society. 138 (40), 13281-13288 (2016).
  27. Ahmed, L., et al. Molecular mechanism of activation of human musk receptors OR5AN1 and OR1A1 by (R)-muscone and diverse other musk-smelling compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (17), 3950-3958 (2018).
  28. Duan, X., et al. Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (9), 3492-3497 (2012).
  29. Sekharan, S., et al. QM/MM model of the mouse olfactory receptor MOR244-3 validated by site-directed mutagenesis experiments. Biophysical journal. 107 (5), 5-8 (2014).
  30. Liu, M. T., et al. Carbon chain shape selectivity by the mouse olfactory receptor OR-I7. Organic & Biomolecular Chemistry. 16 (14), 2541-2548 (2018).
  31. Li, Y., et al. Aldehyde Recognition and Discrimination by Mammalian Odorant Receptors via Functional Group-Specific Hydration Chemistry. ACS Chemical Biology. 9 (11), 2563-2571 (2014).
  32. Kida, H., et al. Vapor detection and discrimination with a panel of odorant receptors. Nature Communications. 9 (1), 4556 (2018).
  33. Yu, Y., et al. Responsiveness of G protein-coupled odorant receptors is partially attributed to the activation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (48), 14966-14971 (2015).
  34. de March, C. A., et al. Conserved residues control Activation of mammalian G protein-coupled odorant receptors. Journal of the American Chemical Society. 137 (26), 8611-8616 (2015).
  35. de March, C. A., et al. Odorant receptor 7D4 activation dynamics. Angewandte Chemie. 130 (17), 4644-4648 (2018).
  36. Kim, S. -. K., Goddard, W. A. Predicted 3D structures of olfactory receptors with details of odorant binding to OR1G1. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 28 (12), 1175-1190 (2014).
  37. de March, C. A., Kim, S. K., Antonczak, S., Goddard, W. A., Golebiowski, J. G protein-coupled odorant receptors: From sequence to structure. Protein Science. 24 (9), 1543-1548 (2015).
  38. Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS Genetics. 8 (7), 1002821 (2012).
  39. Mainland, J. D., et al. The missense of smell: functional variability in the human odorant receptor repertoire. Nature Neuroscience. 17 (1), 114 (2014).
  40. Meister, M. On the dimensionality of odor space. Elife. 4, 07865 (2015).
  41. Bushdid, C., Magnasco, M. O., Vosshall, L. B., Keller, A. Humans can discriminate more than 1 trillion olfactory stimuli. Science. 343 (6177), 1370-1372 (2014).
  42. Gerkin, R. C., Castro, J. B. The number of olfactory stimuli that humans can discriminate is still unknown. Elife. 4, 08127 (2015).
  43. Shirasu, M., et al. Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors. Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).
  44. Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468 (2007).
  45. McRae, J. F., et al. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the “grassy” smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical Senses. 37 (7), 585-593 (2012).
  46. de March, C. A., Ryu, S., Sicard, G., Moon, C., Golebiowski, J. Structure-odour relationships reviewed in the postgenomic era. Flavour and Fragrance Journal. 30 (5), 342-361 (2015).
  47. Olson, M. J., Martin, J. L., LaRosa, A. C., Brady, A. N., Pohl, L. R. Immunohistochemical localization of carboxylesterase in the nasal mucosa of rats. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 41 (2), 307-311 (1993).
  48. Nagashima, A., Touhara, K. Enzymatic conversion of odorants in nasal mucus affects olfactory glomerular activation patterns and odor perception. Journal of Neuroscience. 30 (48), 16391-16398 (2010).

Tags

Odorant ReceptorIn Vitro MonitoringVapor PhaseBiosensorOdor PerceptionCell CultureReal-timeM10 PSFTrypsin-EDTA96-well Plate

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
de March, C. A., Fukutani, Y., Vihani, A., Kida, H., Matsunami, H. Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase. J. Vis. Exp. (146), e59446, doi:10.3791/59446 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image