בזמן אמת בחוץ גופית ניטור של הפעלת קולטן Odorant מאת Odorant בהשלב אדי
Summary
מבחינה פיזיולוגית, odorant רצפטורים מופעלים על ידי מולקולות odorant בשאיפה בשלב אדי. עם זאת, ביותר מערכות in vitro לנצל שלב נוזלי odorant גירוי. כאן, אנו מציגים שיטה המאפשרת ניטור בזמן אמת במבחנה של הפעלת קולטן odorant על odorant גירוי בשלב אדי.
Abstract
תפיסת הריח מתחיל האינטראקציה של odorants עם רצפטורים odorant (או) בא לידי ביטוי על ידי חוש הריח החישה הניריונים (OSN). ריח זיהוי עוקב אחר ערכת קידוד המשתמשת קומבינטורית, או אחד יכול להיות מופעל על ידי קבוצת odorants בהם odorant אחד יכול להפעיל שילוב של ORs. דרך כזאת קידוד קומבינטורית, אורגניזמים יכולים לזהות ולהבחין בין מספר עצום של מולקולות ריח נדיפים. לפיכך, ריח-ריכוז נתון יכולה להיות מתוארת על ידי תבנית ההפעלה של ORs, אשר הוא ספציפי על כל ריח. במובן הזה, פיצוח המנגנונים המשתמשת המוח להבחין ריח דורש את ההבנה odorant-ניתוח אינטראקציות. זו הסיבה מדוע הקהילה חוש הריח מחויבת “דה orphanize” רצפטורים אלו. קונבנציונאלי מערכות in vitro המשמש לזיהוי odorant- או אינטראקציות נעזרו ומוכנסות המדיה הנייד עם odorant, אשר היא נבדלת הגילוי הטבעי של ריחות באמצעות פירוק odorants אדי לתוך רירית האף לפני בחברת ORs. כאן, אנו מתארים שיטה חדשה מאפשר ניטור בזמן אמת של הפעלת או באמצעות אדים-שלב odorants. השיטה שלנו מתבססת על מדידת שחרור המחנה על ידי הפריה חוץ גופית באמצעות וזמינותו Glosensor. זה גשרים הנוכחי פערים בין גישות ויוו במבחנה ומספק בסיס חיישן כימיים נדיפים ביונים.
Introduction
חוש הריח מאפשר קרקעית חיות לאינטראקציה עם הסביבה כימיים נדיפים שלך כונן התנהגויות ורגשות. ביסודו, מתחיל תהליך זיהוי ריח עם האינטראקציה הראשונה של מולקולות odorant עם מערכת הריח, ברמה של קולטנים (ORs) odorant1. ביונקים, ORs מבוטאים בנפרד חוש הריח נוירונים סנסוריים (OSNs) ממוקם אפיתל חוש הריח2. הם שייכים למשפחת קולטן (GPCR) G-חלבון בשילוב, ליתר דיוק למשפחת אופסין # רודופסין דמוי משנה (המכונה גם מחלקה A). ORs זוג עם מופחתים גרם חלבון Golf הפעלת אשר מוביל המחנה ייצור ואחריו פתיחת ערוצי נוקלאוטיד מחזורית מגודרת, הדור של פוטנציאל פעולה. מקובל כי ההכרתיות ריח מסתמך על דפוס מסוים של ORs מופעל3,4 , ולכן זיהוי ריח מלווה ערכת קידוד המשתמשת קומבינטורית, או אחד יכול להיות מופעל על ידי קבוצת odorants בהם odorant אחד יכול להפעיל שילוב של ORs. דרך כזו קידוד קומבינטורית, זה הוא שמהווה אורגניזמים יכולים לזהות ולהבחין בין מספר עצום של מולקולות ריח נדיפים. אחד המפתחות להבנת איך נתפסים ריחות היא להבין איך ואשר ORs מופעלים על ידי ריח נתון.
בניסיון להבהיר odorant- או אינטראקציות, מבחני פונקציונלי במבחנה שיחקו תפקיד חיוני. הזיהוי של אגוניסט ליגנדים מדיף עבור יתום ORs (או דה-orphanization) כבר שדה פעיל מאוד בעשרים השנים האחרונות, באמצעות שימוש שונים במבחנה, ex-vivo ומבחני פונקציונלי ויוו5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17.
מערכות assay במבחנה הם המתאימים ביותר עבור אפיון פונקציונלי מפורט ORs, כולל זיהוי של תחומים פונקציונליים, ומשקעים קריטי של ORs, כמו גם יישומים הנדסיים פוטנציאליים. עם זאת, בהמשך פיתוח מערכות במבחנה יקר עבור ORs היה אתגר, בין היתר בשל קושי עם culturing OSNs וביטוי פונקציונלי של ORs בתאים heterologous. האתגר הראשון היה להקים פרוטוקולים מותרים עבור הביטוי פני שטח התא של ORs פונקציונלי מיפוי של odorant-ניתוח אינטראקציות. מספר קבוצות עצמאית נעזרו שונים גישות5,6,7,8,9,10,11,12, 14,18,19,20. אחד ההישגים המוקדמים נוצר על ידי Krautwurst et al. ב מתויג N-הסופית של ORs עם רצף מקוצרת של אופסין # רודופסין (Rho-תג) ולצפות ביטוי השטח משופרת ב- תאי כליה אנושית עובריים (HEK)13. וריאציות שבוצעו התג המוצמד הרצף או הוא עדיין נתיב חקר לשיפור או ביטוי ופונקציונליות19,21. סאיטו ואח. ואז זיהו חלבון קולטן-הובלת 1 (RTP1), RTP2 אשר להקל או סחר בסמים. 22 גרסה קצרה יותר של RTP1, שנקרא RTP1S, גם הוכח להיות יעיל יותר מאשר החלבון המקורי23. הפיתוח של קו תא (Hana3A) stably המבטאת Golf, REEP1, RTP1 ו- RTP2 24, בשילוב עם השימוש של אדנוזין מחזורית monophosphate (מחנה) כתבים איפשר זיהוי של odorant-ניתוח אינטראקציות. מנגנון לפיו משפחת RTP של חלבונים מקדמת הבעת פני שטח התא ORs עדיין נקבע.
אזהרה אחת משיטות אלה הוקמה היא כי הם מסתמכים על גירוי odorant בשלב נוזלי, כלומר odorants הם התפרקה מראש לתוך מדיום גירוי לעורר תאים על-ידי החלפת המדיום. . זה מאוד שונה מזו התנאים הפיזיולוגיים שבה מולקולות odorant להגיע האפיתל חוש הריח בשלב אדי, להפעיל ORs על-ידי פירוק לתוך רירית האף. כדי להידמות יותר חשיפה גירוי רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, צאנז ואח20 המוצע של assay בהתבסס על אדי גירוי על-ידי החלת טיפת odorant פתרון לתלות מתחת הפנים הפנימי של סרט פלסטיק הניח על ראש תא בארות. הם הקליטו את התגובות סידן על-ידי ניטור קרינה פלואורסצנטית בעוצמה. שיטה זו היה הראשון להשתמש אוויר-שלב odorant גירוי, אבל זה לא התירו הקרנה גדולים או ההפעלה.
. הנה, פיתחנו שיטה חדשה המאפשרת ניטור בזמן אמת של הפעלת או במבחנה באמצעות אדי שלב odorant גירוי על ידי וזמינותו Glosensor (איור 1). Assay הזה שימש בעבר בהקשר של odorant נוזלי גירוי18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31. התא ניטור של luminometer זה equilibrated קודם עם odorant מתאדה לפני הצלחת לקרוא (איור 1א’). Odorant מולקולות הן ואז solvated לתוך המאגר, רחצה Hana3A תאים המבטאים את הניתוח של עניין, RTP1S את החלבונים Glosensor (איור 1B). אם odorant הוא אגוניסט של הניתוח, הניתוח לעבור קונפורמציה מופעל לאגד Golf, מפעיל את cyclase adenylyl (AC) ו בסופו של דבר לגרום רמות המחנה לעלות. המחנה העולה לאגד ולהפעיל את החלבון Glosensor כדי ליצור הפריה חוץ גופית ותזרז luciferin. הארה זו לאחר מכן נרשם על-ידי luminometer ומאפשרת או הפעלת הפיקוח. שיטה זו היא עניין גבוהה בהקשר של deorphanization או כפי שהיא מביאה מערכות in vitro קרוב התפיסה הטבעית של ריחות.
Protocol
Representative Results
Discussion
התפיסה של ריח תלויה באופן מהותי ההפעלה של ORs. כתוצאה מכך, הבנה של הפונקציונליות שלהם נדרש כדי לפצח את המנגנון מורכבות המשתמשות המוח להבחין סביבתו כימיים נדיפים. עם זאת, ההבנה של תהליך זה יש כבר הקשו על ידי הקשיים בהקמת שיטה חזקה למסך את הרפרטואר או פונקציונליות נגד odorants במבחנה. תא והביט…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH (DC014423 ו- DC016224), את ההגנה מתקדם פרוייקט הסוכנות RealNose פרוייקט מחקר. YF נשאר באוניברסיטת דיוק עם תמיכה כספית מתוכנית JSPS לרשתות קידום אסטרטגי בינלאומי להאיץ את זרימת הדם של מוכשרים החוקרים (R2801). אנו מודים Kaleem סהר על עריכה של כתב היד.
Materials
| 0.05 % trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% Trypsin – EDTA (1x), phenol red – store at 4°C |
| 100 mm cell culture dish | BD Falcon | 353003 | 100 mm x 20 mm cell culture dish |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352099 | 17 mm x 120 mm conical tubes |
| 96-well plate | Corning | 3843 | 96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Amphotericin B 250 µg/mL – store at 4°C |
| centrifuge machine | Jouan | C312 | Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL |
| Class II Type A/B3 fumehood | NUAIRE | NU-407-500 | fumehood for cell culturing |
| FBS | Gibco | 16000-044 | Fetal Bovine Serum – store at -20°C |
| GloSensor cAMP Reagent | Promega | E1290 | GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate – store at -20°C |
| Incubator 37 °C; 5 % CO2 | Fisher Scientific | 11-676-604 | Incubator for cell culturing |
| Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent – store at 4°C |
| Luminometer POLARstar OPTIMA | BMG LABTECH | discontinued | 96 well plate reader for luminescence |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | Solvent for odorants – store at room temperature |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Corning cellgro | 10-010-CV | Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine – store at 4°C |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin – store at -20°C |
| pGlosensor | Promega | E2301 | pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid – store at 4°C |
| phase contrast microscope | Leica | 090-131.001 | phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives |
| RTP1S | H. Matsunami lab | – | 100 ng/µL plasmid – store at 4°C |
Referências
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Serizawa, S., Miyamichi, K., Sakano, H. One neuron-one receptor rule in the mouse olfactory system. Trends in Genetics. 20 (12), 648-653 (2004).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Peterlin, Z., Firestein, S., Rogers, M. E. The state of the art of odorant receptor deorphanization: a report from the orphanage. The Journal of General Physiology. 143 (5), 527-542 (2014).
- Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science Signal. 2 (60), (2009).
- Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2, 4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods. Chemical Senses. 42 (3), 181-193 (2017).
- Nishizumi, H., Sakano, H. Decoding and deorphanizing an olfactory map. Nature Neuroscience. 18 (10), 1432 (2015).
- Wetzel, C. H., et al. Functional expression and characterization of a Drosophila odorant receptor in a heterologous cell system. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (16), 9377-9380 (2001).
- Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (7), 4040-4045 (1999).
- Levasseur, G., et al. Ligand-specific dose-response of heterologously expressed olfactory receptors. European Journal Of Biochemistry. 270 (13), 2905-2912 (2003).
- Zhao, H., et al. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
- Krautwurst, D., Yau, K. -. W., Reed, R. R. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell. 95 (7), 917-926 (1998).
- Wetzel, C. H., et al. Specificity and Sensitivity of a Human Olfactory Receptor Functionally Expressed in Human Embryonic Kidney 293 Cells andXenopus Laevis Oocytes. Journal of Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
- Kajiya, K., et al. Molecular bases of odor discrimination: reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. Journal of Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
- Jiang, Y., et al. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1446 (2015).
- Von Der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1455 (2015).
- Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. A butter aroma recombinate activates human class-I odorant receptors. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (43), 9410-9420 (2015).
- Noe, F., et al. IL-6-HaloTag® enables live-cell plasma membrane staining, flow cytometry, functional expression, and de-orphaning of recombinant odorant receptors. Journal of Biological Methods. 4 (4), 81 (2017).
- Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -. C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical Senses. 30 (1), 69-80 (2005).
- Shepard, B. D., Natarajan, N., Protzko, R. J., Acres, O. W., Pluznick, J. L. A cleavable N-terminal signal peptide promotes widespread olfactory receptor surface expression in HEK293T cells. PLoS One. 8 (7), 68758 (2013).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
- Wu, L., Pan, Y., Chen, G. -. Q., Matsunami, H., Zhuang, H. Receptor-Transporting Protein 1 Short (RTP1S) Mediates the Translocation and Activation of Odorant Receptors by Acting through Multiple Steps. Journal of Biological Chemistry. , (2012).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature Protocols. 3 (9), 1402 (2008).
- Zhang, Y., Pan, Y., Matsunami, H., Zhuang, H. Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay. Journal of Visualized Experiments. (128), e55831 (2017).
- Li, S., et al. Smelling sulfur: Copper and silver regulate the response of human odorant receptor OR2T11 to low-molecular-weight thiols. Journal of the American Chemical Society. 138 (40), 13281-13288 (2016).
- Ahmed, L., et al. Molecular mechanism of activation of human musk receptors OR5AN1 and OR1A1 by (R)-muscone and diverse other musk-smelling compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (17), 3950-3958 (2018).
- Duan, X., et al. Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (9), 3492-3497 (2012).
- Sekharan, S., et al. QM/MM model of the mouse olfactory receptor MOR244-3 validated by site-directed mutagenesis experiments. Biophysical journal. 107 (5), 5-8 (2014).
- Liu, M. T., et al. Carbon chain shape selectivity by the mouse olfactory receptor OR-I7. Organic & Biomolecular Chemistry. 16 (14), 2541-2548 (2018).
- Li, Y., et al. Aldehyde Recognition and Discrimination by Mammalian Odorant Receptors via Functional Group-Specific Hydration Chemistry. ACS Chemical Biology. 9 (11), 2563-2571 (2014).
- Kida, H., et al. Vapor detection and discrimination with a panel of odorant receptors. Nature Communications. 9 (1), 4556 (2018).
- Yu, Y., et al. Responsiveness of G protein-coupled odorant receptors is partially attributed to the activation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (48), 14966-14971 (2015).
- de March, C. A., et al. Conserved residues control Activation of mammalian G protein-coupled odorant receptors. Journal of the American Chemical Society. 137 (26), 8611-8616 (2015).
- de March, C. A., et al. Odorant receptor 7D4 activation dynamics. Angewandte Chemie. 130 (17), 4644-4648 (2018).
- Kim, S. -. K., Goddard, W. A. Predicted 3D structures of olfactory receptors with details of odorant binding to OR1G1. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 28 (12), 1175-1190 (2014).
- de March, C. A., Kim, S. K., Antonczak, S., Goddard, W. A., Golebiowski, J. G protein-coupled odorant receptors: From sequence to structure. Protein Science. 24 (9), 1543-1548 (2015).
- Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS Genetics. 8 (7), 1002821 (2012).
- Mainland, J. D., et al. The missense of smell: functional variability in the human odorant receptor repertoire. Nature Neuroscience. 17 (1), 114 (2014).
- Meister, M. On the dimensionality of odor space. Elife. 4, 07865 (2015).
- Bushdid, C., Magnasco, M. O., Vosshall, L. B., Keller, A. Humans can discriminate more than 1 trillion olfactory stimuli. Science. 343 (6177), 1370-1372 (2014).
- Gerkin, R. C., Castro, J. B. The number of olfactory stimuli that humans can discriminate is still unknown. Elife. 4, 08127 (2015).
- Shirasu, M., et al. Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors. Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).
- Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468 (2007).
- McRae, J. F., et al. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the “grassy” smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical Senses. 37 (7), 585-593 (2012).
- de March, C. A., Ryu, S., Sicard, G., Moon, C., Golebiowski, J. Structure-odour relationships reviewed in the postgenomic era. Flavour and Fragrance Journal. 30 (5), 342-361 (2015).
- Olson, M. J., Martin, J. L., LaRosa, A. C., Brady, A. N., Pohl, L. R. Immunohistochemical localization of carboxylesterase in the nasal mucosa of rats. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 41 (2), 307-311 (1993).
- Nagashima, A., Touhara, K. Enzymatic conversion of odorants in nasal mucus affects olfactory glomerular activation patterns and odor perception. Journal of Neuroscience. 30 (48), 16391-16398 (2010).
