استراتيجيات غير الغازية للتلاعب المزمن من النشاط العصبي الذي تسيطر عليه DREADD
Summary
هنا نقوم بوصف طريقتين غير الغازية للسيطرة المزمنة على النشاط العصبي باستخدام علم الوراثة الكيميائية في الفئران. واستخدمت قطرات العين لتسليم كلوزابين-N-أكسيد (CNO) يوميا. كما نقوم بوصف طريقتين لإطالة فترة إدارة CNO في مياه الشرب. هذه الاستراتيجيات للسيطرة العصبية المزمنة تتطلب الحد الأدنى من التدخل الحد من الإجهاد الحيوانات.
Abstract
وقد ظهرت استراتيجيات علم الوراثة الكيميائية كأدوات موثوق بها للتحكم عن بعد في النشاط العصبي. من بين هذه, مستقبلات مصمم تفعيلها حصرا من قبل مصمم الأدوية (DREADDs) أصبحت النهج الأكثر شعبية علم الالوراثة الكيميائية المستخدمة في علم الأعصاب الحديثة. معظم الدراسات تقديم كلوزابين-N-أكسيد ليجاند (CNO) باستخدام حقن واحد داخل اقابي، وهو مناسب لتنشيط / تثبيط حاد من السكان الخلايا العصبية المستهدفة. ومع ذلك، لا يوجد سوى عدد قليل من الأمثلة على استراتيجيات التشكيل المزمن للخلايا العصبية التي تسيطر عليها DREADD، ومعظمها يعتمد على استخدام أنظمة التسليم التي تتطلب التدخل الجراحي. هنا، ونحن توسيع على اثنين من الاستراتيجيات غير الغازية لتقديم CNO ligand للتلاعب المزمن السكان العصبية في الفئران. كان يتم إعطاء CNO إما باستخدام قطرات العين المتكررة (اليومية)، أو بشكل مزمن من خلال مياه الشرب في الحيوان. هذه النماذج غير الغازية تؤدي إلى تنشيط قوي لمستقبلات المصمم التي استمرت في جميع أنحاء العلاجات CNO. الطرق الموصوفة هنا توفر بدائل للسيطرة المزمنة بوساطة DREADD من النشاط العصبي، وقد تكون مفيدة للتجارب المصممة لتقييم السلوك في الحيوانات المتحركة بحرية، مع التركيز على أساليب التسليم CNO أقل الغازية.
Introduction
وقد سمحت التطورات التقنية في مجال علم الأعصاب العلماء لتحديد ومراقبة نشاط مجموعات معينة من الخلايا العصبية1. وقد ساهم هذا في فهم أفضل لأساس الدوائر العصبية وتأثيرها على السلوك الحيواني، وكذلك، مراجعة العقائد الراسخة2،3. ومن بين هذه الأدوات الجديدة، كان للاستراتيجيات الوراثية البصرية والكيميائية تأثير عميق ليس فقط على نوعية الاكتشافات ولكن أيضا على الطريقة التي يتم بها تصور التجارب وتصميمها4. في هذه المخطوطة، نركز على استراتيجيات علم الوراثة الكيميائية للسيطرة على تنشيط الخلايا العصبية من خلال استراتيجيات مستقبلات ligand هندسية. مستقبلات مصمم تفعيلها حصرا من قبل مصمم الأدوية (DREADDs) تمثل واحدة من الأدوات الكيميائية الوراثية الأكثر شعبية للتحكم عن بعد من النشاط العصبي, كما استعرض روث 20165. DREADDs الاستفادة المعدلة مستقبلات أستيل موسكارينيالتي يتم تفعيلها على وجه التحديد من قبل ليجانت خاملة, كلوزابين-N-أكسيد (CNO)6.
معظم الدراسات استخدام CNO تدار عن طريق الحقن داخل اقاب (i.p.) ، والتي تسيطر بشكل فعال على الجرعة وتوقيت تنشيط مستقبلات هندسية بطريقة حادة. ومع ذلك، عندما يكون التنشيط DREADD المتكررة أو المزمنة مطلوبة، يصبح استخدام حقن i.p. متعددة غير ممكن. لمعالجة هذه المسألة، تم الإبلاغ عن استراتيجيات مختلفة لتسليم CNO المزمن، بما في ذلك المضخات الصغيرة المزروعة7 والقنية داخل الجمجمة8،9. إلى درجات مختلفة، كل هذه الاستراتيجيات تسبب الإجهاد والألم الحيوانات10،وتتطلب التدخل الجراحي الذي يمكن أن يكون له أيضا تأثير مباشر على الاستجابات السلوكية ليتم اختبارها11. هنا، ونحن نصف ثلاث استراتيجيات غير الغازية لتسليم CNO المزمنة.
لهذا الغرض، تم حقن الفئران مجسما في الحصين مع فيروس الأيدينو المرتبطة (AAV) ترميز نسخة هندسية من مستقبلات موسكارينيك M3 المحفزة (hM3Dq) أنه عند تفعيلها من قبل CNO ligand يؤدي إلى إطلاق النار مثل انفجار الخلايا العصبية6. وقد تبين سابقا أن قطرة عين واحدة تحتوي على CNO يمكن أن تثير بشكل فعال تفعيل قوي من الخلايا العصبية التي تعبر عن DREADD12. هنا نقوم بوصف طريقة معدلة للتسليم المتكرر لقطرات العين. لتحقيق السيطرة المزمنة والمستدامة على مستقبلات المصمم، ونحن نوصف المقبل استراتيجية غير الغازية لتسليم CNO للفئران من خلال مياه الشرب. وأخيراً، نقوم بوصف نموذج بديل لتقديم CNO في مياه الشرب خلال فترة زمنية محدودة. الفئران النشاط الحركي، فضلا عن سلوك الشرب واستهلاك حلول السعرات الحرارية الحلوة، وتقتصر في الغالب على الجزء المظلم من دورة الضوء / الظلام13،14. لذلك، اعتمدنا بروتوكول على أساس تفضيل الماوس للسكروز. من خلال قياس تحريض الجينات الفورية في وقت مبكر ج-فوس في الخلايا المصابة AAV, كقراءة لتنشيط الخلايا العصبية12,15, وجدنا أن هذه الاستراتيجيات تسليم CNO تنشيط بقوة الخلايا العصبية التي تسيطر عليها DREADD على مدى تمديد المدد.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد ظهرت DREADDs كنهج شعبية وفعالة للتعامل عن بعد النشاط العصبي17. ومن ثم، فإن تصميم استراتيجيات بديلة لتقديم عمل كل من CNO سيزيد بشكل عام من نطاق الخيارات المتاحة لبيئات تجريبية محددة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الاستراتيجيات غير الغازية لتسليم CNO تقلل من أي سوء تفسير محتمل للنتائج عن …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل برنامج البحوث داخل الجدارية في المعهد الوطني للصحة العقلية (ZIA MH002964-02). نود أن نشكر دعم نيمه IRP القوارض الأساسية السلوكية (ZIC MH002952).
Materials
| BSA | Sigma life science | #A2153-100G | Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis) |
| C57BL/6J mice | The Jackson laboratory | #000664 | male mice, 3 months old |
| Capillaries | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | Outer diameter: 1.14 in. |
| Clozapine-N-oxide | Sigma | #C0832 | 5mg |
| Forane | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isoflurane, USP |
| Microinjector III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III – Programmable Nanoliter Injector |
| Mounting media | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | #15710 | 16% aqueous solution (methanol free), 10 ml |
| Primary c-Fos Antibody | Cell signaling technology | #2250S | c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µl) |
| rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| rAAV5/hSyn-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| Secondary Antibody | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
Referências
- Park, H. G., Carmel, J. B. Selective Manipulation of Neural Circuits. Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).
- Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of depression. Neuropsychopharmacology. 1, (2018).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. . Review Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints. , (2017).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic Tools with Therapeutic Utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55 (1), 399-417 (2015).
- Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Donato, F., Jacobsen, R. I., Moser, M. -. B., Moser, E. I. Stellate cells drive maturation of the entorhinal-hippocampal circuit. Science. 355 (6330), (2017).
- Mahler, S. V., et al. Designer receptors show role for ventral pallidum input to ventral tegmental area in cocaine seeking. Nature Neuroscience. 17 (4), 577-585 (2014).
- Lichtenberg, N. T., et al. Basolateral Amygdala to Orbitofrontal Cortex Projections Enable Cue-Triggered Reward Expectations. The Journal of Neuroscience. 37 (35), 8374-8384 (2017).
- Schotman, P., Reith, M. E. A., Gispen, W. H. Effects of stressful procedures as ether anesthesia and intracranial injections on amino acid incorporation into brain protein. Brain Research Bulletin. , (1977).
- Frumberg, D. B., Fernando, M. S., Lee, D. E., Biegon, A., Schiffer, W. K. Metabolic and behavioral deficits following a routine surgical procedure in rats. Brain Research. , (2007).
- Keenan, W. T., Fernandez, D. C., Shumway, L. J., Zhao, H., Hattar, S. Eye-Drops for Activation of DREADDs. Frontiers in Neural Circuits. 11, 93 (2017).
- LeGates, T. A., Altimus, C. M. Measuring circadian and acute light responses in mice using wheel running activity. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Bainier, C., Mateo, M., Felder-Schmittbuhl, M. -. P., Mendoza, J. Circadian rhythms of hedonic drinking behavior in mice. Neurociência. 349, 229-238 (2017).
- Fernandez, D. C., et al. Light Affects Mood and Learning through Distinct Retina-Brain Pathways. Cell. 175 (1), 71-84 (2018).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . Paxinos and Franklin’s The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2019).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).
- Urban, D. J., et al. Elucidation of The Behavioral Program and Neuronal Network Encoded by Dorsal Raphe Serotonergic Neurons. Neuropsychopharmacology official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 41 (5), 1404-1415 (2016).
- Jain, S., Ruiz De Azua, I., Lu, H., White, M. F., Guettier, J. -. M., Wess, J. Chronic activation of a designer G q-coupled receptor improves β cell function. The Journal of Clinical Investigation. 123, (2013).
- MacLaren, D. A. A., et al. Clozapine N-Oxide Administration Produces Behavioral Effects in Long-Evans Rats: Implications for Designing DREADD Experiments. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
