Lipidomics e Transcriptomics em Doenças Neurológicas

Avanços recentes na função dos lipídios e seu papel no surgimento e progressão de doenças neurológicas abrem novos locais de pesquisa e desenvolvimento de novos alvos terapêuticos e elucidação de mecanismos de ^doença1. Diferenças documentadas na composição lipídica em diferentes regiões cerebrais, enfatizadas por técnicas modernas de imagem molecular, como imagem de espectrometria de massa e perfil avançado de espectrometria de massa, muda o paradigma da investigação lipídica de todo o cérebro para regiões cerebrais funcionalmente distintas e discretas. O fato de que a composição lipídica varia em diferentes regiões cerebrais leva a nova conceituação tanto da sensibilidade lipídica da membrana quanto da sinalização lipídica a jusante em resposta a um insulto cerebral ou estímulos através das regiões cerebrais funcionalmente distintas. Assim, os protocolos lipídes exigem novos desenvolvimentos para enfrentar o desafio de baixas quantidades teciduais para maior detecção e quantificação de resolução espacial, e, simultaneamente, análise de múltiplos componentes lipídides de membranas celulares e vias de sinalização. Além disso, a determinação de enzimas, ligantes lipídicos e receptores envolvidos na regulação de seus níveis e funções é primordial para elucidar as vias de sinalização afetadas em uma doença neurológica e orientar novas investigações mecanicistas em um contexto fisioterológico.

Além do aumento da resolução espacial cerebral, há duas grandes dificuldades que desafiam o desenvolvimento de novas abordagens neurolipdómicas. Primeiro, as moléculas de sinalização lipídica são tipicamente de baixa abundância em comparação com lipídios constitutivos de membrana. Em segundo lugar, o lipidome apresenta uma alta heterogeneidade estrutural, difícil de dissecar usando uma única abordagem analítica. Assim, os métodos de extração e analítica são adaptados a diferentes categorias lipídicas e comumente realizados em amostras de tecidos distintos². Métodos lipídmicos de espingarda³ são excelentes ferramentas para revelar rapidamente um amplo perfil de lipídios de membrana, enquanto o aumento da sensibilidade e seletividade proporcionados pela descoberta e quantificação de massa spectrométricas são capitalizados para a investigação de lipídios de sinalização de baixa oferta, incluindo: i) lipídios inflamatórios e ii) lipídios envolvidos na modulação da atividade neuronal, como endocanabinóides (eCBs), lipídios ligados a amino- etc.^4,5. Para abranger alterações lipídicas tanto na membrana celular quanto no nível de sinalização ocorrendo em regiões cerebrais de modelos de doenças neurológicas, tipicamente a extração e análise lipídica são realizadas em amostras de tecidos distintos, obtidas de diferentes lotes animais ou de diferentes hemisférios, ou dissecando uma região de tecido maior em múltiplos pedaços. Quando os níveis de mRNA de receptores enzimáticos também são de interesse, sua investigação normalmente requer a aquisição de uma amostra de tecido distinta. Por exemplo, a investigação de lipídios de membrana, canabinoides endógenos e mRNA exigiria três amostras diferentes de tecido, (por exemplo, duas amostras para os dois métodos de extração lipídica-lipídios-lipídios e lipídios de sinalização – e subsequentes dois métodos de análise lipídica – e uma amostra para análise mRNA). A investigação de lipídios inflamatórios e canabinoides endógenos requerem duas amostras de tecido distintas, métodos de extração e métodos de análise, respectivamente. Outro exemplo é a investigação de mRNA e de qualquer categoria lipídica em uma amostra de perfuração cerebral ou microdissecção a laser que, consequentemente, requer dois animais distintos para obter duas amostras por cérebro (sub)região. Uma extensão substancial de variabilidade e/ou baixa reprodutibilidade dos resultados ocorre frequentemente nesses casos, originária de variabilidade biológica e/ou heterogeneidade tecidual. Guiado por essas limitações práticas da análise multimolecular, ocorrendo particularmente em alta resolução espacial no cérebro, foi projetado um protocolo de neurolipidomia de três módulos englobando: 1) coextração e co-análise por LC/MRM de lipídios inflamatórios (por exemplo, eicosanoides (EI)) e lipídios envolvidos na modulação da atividade neuronal, como eCBs²; 2) co-extração de fosfolipídios (PLs) e eCBs com análise subsequente de LC/MRM multiscan e análise de varredura de perdas precursoras/neutras²; e 3) extração dupla de membrana (fosfo)lipídios e eCBs, bem como mRNA, com análise subsequente de sequenciamento de LC/MRM e qPCR ou RNA⁶. Dependendo da questão biológica a ser abordada em uma doença neurológica e na região de interesse cerebral, uma combinação do primeiro e do segundo protocolo, ou o primeiro e o terceiro protocolo, podem ser aplicados na mesma amostra de tecido para tecidos que pesam cerca de 4 mg. O primeiro e o terceiro protocolos podem ser aplicados independentemente para tecidos em torno de 2 mgs. O segundo protocolo pode ser aplicado para tecidos pesando apenas 0,5 mgs. Independentemente do módulo de protocolo neurolipdidomático selecionado, a amostragem de tecidos e processamento pré-analítico, o isolamento cerebral e a dissecção da região, bem como o procedimento para o sacrifício do modelo animal são padronizados e idênticos para os três módulos do protocolo. Em nossa investigação de doenças neurológicas, órgãos periféricos relevantes para as consequências patológicas da doença também são sempre coletados e analisados por meio desses protocolos modulares. Além disso, o sangue é regularmente amostrado para lipidomia plasmática para servir como uma ferramenta de leitura de doenças neurológicas com uma visão sobre aplicações translacionais prospectivas. O protocolo de lipidomia modular aqui apresentado é muito versátil: escalável a maiores quantidades de tecido e facilmente aplicável para praticamente qualquer tipo de tecido e doença. Para a aplicação do protocolo modular (Figura 1), em doenças neurológicas, qualquer modelo padronizado de início e progressão de distúrbios neurológicos, como lesão cerebral traumática, doença de Parkinson, doença de Alzheimer ou epilepsia são amenáveis.

Esses protocolos têm sido extensivamente aplicados para estudar alterações no lipidome tecidual e/ou transcriptome na fase aguda da epilepsia no modelo de camundongo induzido por ácido kainico (KA) de ^epilepsia2,7, um modelo amplamente utilizado em estudos pré-clínicos devido à semelhança com a epilepsia do lobo temporal humano (TLE)^8,9,10,11. Utilizando esses protocolos, o potencial terapêutico de drogas como Palmitoylethanolamide (PEA)^12,13 foi avaliado no mesmo modelo de camundongos de epilepsia. O estudo identificou alterações lipídicas e mRNA em alta e baixa resolução espacial no cérebro e na periferia, no ponto de tempo de intensidades máximas agudas de convulsão aguda (em 60 min de indução pós-doutorado), e sobre o tratamento subcrônico e agudo com PEA em quatro pontos de tempo diferentes (20, 60, 120 e 180 min) pós-indução de convulsão ka, uma janela de tempo cobrindo a fase aguda de epilepsia. Foram coletados em cada momento os camundongos injetados por KA, camundongos tratados com PEA, agudos e subchamados, bem como camundongos de controle de veículos e veículos pea, coletados em cada ^ponto12,13, e investigados com essa análise molecular. Os dados moleculares foram correlacionados com fenótipos comportamentais obtidos pela pontuação de convulsões, bem como com dados derivados da imunohistoquímica em processos neurodegenerative, a fim de desvendar a progressão da fase aguda de epilepsia e o potencial do PEA para aliviá-lo.