Lipidomique et transcriptomique dans les maladies neurologiques

Les progrès récents dans la fonction des lipides et leur rôle dans l’apparition et la progression des maladies neurologiques ouvrent de nouveaux lieux de recherche et de développement de nouvelles cibles thérapeutiques et d’élucidation des mécanismes de la ^maladie1. Les différences documentées dans la composition lipidique dans différentes régions du cerveau, soulignées par les techniques modernes d’imagerie moléculaire telles que l’imagerie par spectrométrie de masse et le profilage avancé par spectrométrie de masse, déplacent le paradigme de l’investigation des lipides de l’ensemble du cerveau vers des régions cérébrales fonctionnellement distinctes et discrètes. Le fait que la composition lipidique varie dans différentes régions du cerveau incite à une nouvelle conceptualisation de la sensibilité aux lipides membranaires et de la signalisation lipidique en aval en réponse à une insulte cérébrale ou à des stimuli dans les régions cérébrales fonctionnellement distinctes. Par conséquent, les protocoles lipidiques nécessitent de nouveaux développements pour relever le défi des faibles quantités de tissus pour la détection et la quantification à plus haute résolution spatiale, et simultanément, l’analyse de multiples composants lipidiques des membranes cellulaires et des voies de signalisation. En outre, la détermination des enzymes, des ligands lipidiques et des récepteurs impliqués dans la régulation de leurs niveaux et de leur fonction est primordiale pour élucider les voies de signalisation affectées dans une maladie neurologique et guider de nouvelles investigations mécanistes dans un contexte physiopathologique.

En plus de l’augmentation de la résolution spatiale du cerveau, deux difficultés majeures remettent en question le développement de nouvelles approches neurolipidomiques. Tout d’abord, les molécules de signalisation lipidique sont généralement de très faible abondance par rapport aux lipides constitutifs de la membrane. Deuxièmement, le lipidome présente une grande hétérogénéité structurelle, difficile à disséquer à l’aide d’une seule approche analytique. Par conséquent, les méthodes d’extraction et d’analyse sont adaptées à différentes catégories de lipides et couramment effectuées dans des échantillons de tissus distincts.². Méthodes lipidomiques Shotgun³ sont d’excellents outils pour révéler rapidement un large profil des lipides membranaires, tandis que la sensibilité et la sélectivité accrues offertes par les méthodes de spectrométrie de masse de découverte et de quantification ciblées sont capitalisées pour étudier les lipides de signalisation à faible abondance, y compris: i) les lipides inflammatoires et ii) les lipides impliqués dans la modulation de l’activité neuronale, tels que les endocannabinoïdes (eCB), les lipides liés aux acides aminés, etc.^4,5. Pour englober les changements lipidiques à la fois au niveau de la membrane cellulaire et de la signalisation se produisant dans les régions du cerveau des modèles de maladies neurologiques, l’extraction et l’analyse des lipides sont généralement effectuées dans des échantillons de tissus distincts, obtenus à partir de lots animaux distincts ou de différents hémisphères, ou en disséquant une plus grande région tissulaire en plusieurs morceaux. Lorsque les niveaux d’ARNm des récepteurs enzymatiques sont également intéressants, leur étude nécessite généralement l’obtention d’un échantillon de tissu distinct. Par exemple, l’étude des lipides membranaires, des cannabinoïdes endogènes et de l’ARNm nécessiterait trois échantillons de tissus différents (par exemple, deux échantillons pour les deux méthodes d’extraction des lipides – lipides membranaires et lipides de signalisation – et deux méthodes d’analyse des lipides subséquentes – et un échantillon pour l’analyse de l’ARNm). L’étude des lipides inflammatoires et des cannabinoïdes endogènes nécessite respectivement deux échantillons de tissus, des méthodes d’extraction et des méthodes d’analyse distincts. Un autre exemple est l’étude de l’ARNm et de toute catégorie de lipides dans un échantillon de microdissection cérébrale ou laser qui nécessite par conséquent deux animaux distincts pour obtenir deux échantillons par (sous-)région cérébrale. Une variabilité importante et/ou une mauvaise reproductibilité des résultats se produisent fréquemment dans de tels cas, provenant de la variabilité biologique et/ou de l’hétérogénéité tissulaire. Guidé par ces limites pratiques de l’analyse multimoléculaire, se produisant en particulier à haute résolution spatiale dans le cerveau, un protocole neurolipidomique à trois modules a été conçu englobant: 1) la coextraction et la co-analyse par LC / MRM des lipides inflammatoires (par exemple, les eicosanoïdes (eiC)) et des lipides impliqués dans la modulation de l’activité neuronale, tels que les eCB²; 2) co-extraction des phospholipides (PL) et des eCB avec analyse LC/MRM multiscan et analyse de perte précurseur/neutre ultérieure²; et 3) double extraction des lipides membranaires (phospho)et des eCB ainsi que de l’ARNm, avec analyse ultérieure LC/MRM et qPCR ou séquençage de l’ARN⁶. Selon la question biologique à traiter dans une maladie neurologique et la région du cerveau d’intérêt, une combinaison du premier et du deuxième protocole, ou du premier et du troisième protocole, peut être appliquée sur le même échantillon de tissu pour des tissus pesant environ 4 mg. Les premier et troisième protocoles peuvent être appliqués indépendamment pour les tissus autour de 2 mg. Le deuxième protocole peut être appliqué pour les tissus pesant aussi peu que 0,5 mg. Quel que soit le module de protocole neurolipidomique sélectionné, le prélèvement tissulaire et le traitement pré-analytique, l’isolement cérébral et la dissection de la région, ainsi que la procédure de sacrifice du modèle animal sont standardisés et identiques pour les trois modules du protocole. Dans notre enquête sur les maladies neurologiques, les organes périphériques pertinents pour les conséquences pathologiques de la maladie sont toujours collectés et analysés à l’aide de ces protocoles modulaires. De plus, le sang est régulièrement prélevé pour la lipidomique plasmatique afin de servir d’outil de lecture des maladies neurologiques en vue d’applications translationnelles potentielles. Le protocole lipidomique modulaire présenté ici est très polyvalent : évolutif à de plus grandes quantités de tissus et facilement applicable à pratiquement tous les types de tissus et de maladies. Pour l’application du protocole modulaire (Graphique 1) dans les maladies neurologiques, tout modèle normalisé d’apparition et de progression de troubles neurologiques, tels que les lésions cérébrales traumatiques, la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer ou l’épilepsie, est acceptable.

Ces protocoles ont été largement appliqués pour étudier les changements dans le lipidome tissulaire et / ou le transcriptome à la phase aiguë de l’épilepsie dans le modèle murin d’épilepsie induit par l’acide kainique (KA)^2,7, un modèle largement utilisé dans les études précliniques en raison de la ressemblance avec l’épilepsie du lobe temporal humain (TLE)^8,9,10,11. À l’aide de ces protocoles, le potentiel thérapeutique de médicaments tels que le palmitoyléthanolamide (PEA)^12,13 a été évalué dans le même modèle murin d’épilepsie. L’étude a identifié des changements de lipides et d’ARNm à haute et basse résolution spatiale dans le cerveau et la périphérie, au point temporel des intensités de crise aiguës maximales (à 60 min après l’induction de l’incendie), et lors d’un traitement subchronique et aigu avec PEA à quatre moments différents (20, 60, 120 et 180 min) après l’induction de la crise KA, une fenêtre temporelle couvrant la phase aiguë de l’épilepsie. Le plasma, le cerveau et les organes périphériques de souris injectées de KA non traitées, de souris traitées au PEA aigu et subchroniquement, ainsi que de souris témoins de véhicules et de véhicules PEA, ont été collectés à chaque point ^{de temps12,13} et étudiés avec cette analyse moléculaire. Les données moléculaires ont été corrélées avec les phénotypes comportementaux obtenus par scoring de crise, ainsi qu’avec les données dérivées de l’immunohistochimie sur les processus neurodégénératifs, afin de démêler la progression de la phase d’épilepsie aiguë et le potentiel du PEA pour l’atténuer.