Analyse av Cardiac kammer utvikling under musen Embryogenesis bruke hele Mount Epifluorescence
Summary
Vi presenterer protokoller for å undersøke musen heart utvikling med hele mount epifluorescent mikroskopi på mouse embryoer dissekert fra ventrikkel bestemt MLC-2v-tdTomato reporter banke i mus. Denne metoden tillater oss å visualisere direkte hvert trinn av ventrikkel formasjonen under musen heart utvikling uten arbeidskrevende histochemical metoder.
Abstract
Målet med denne protokollen er å beskrive en metode for Disseksjon av mouse embryoer og visualisering av embryonale musen ventrikkel kamrene i hjertet utvikling med ventrikkel bestemt fluorescerende reporter banke i mus (MLC-2v-tdTomato mus). Hjerte utvikling innebærer en lineær hjertet tube formasjon, hjertet røret løkker og fire chamber septation. Disse komplekse prosesser er svært bevart i Alle virveldyr. Mus embryonale hjertet har vært mye brukt for hjertet utviklingsmessige studier. Men på grunn av svært liten størrelse er dissekere mus embryonale hjerter teknisk utfordrende. I tillegg må visualisering av cardiac kammer formasjon ofte i situ hybridisering, beta-galactosidase flekker LacZ reporter mus eller immunostai-delt embryonale hjerter. Her beskriver vi hvordan å dissekere mus embryonale hjerter og direkte visualisere ventrikkel kammer dannelsen av MLC-2v-tdTomato mus med hele mount epifluorescent mikroskopi. Med denne metoden er det mulig å direkte undersøke hjertet tube formasjon og løkker og fire kammer formasjon uten videre eksperimentelle manipulering av mouse embryoer. Selv om MLC-2v-tdTomato reporter banke i musen linjen brukes i denne protokollen som et eksempel, kan denne protokollen brukes til andre hjerte-spesifikke fluorescerende reporter transgene musen linjer.
Introduction
Kammeret formasjon under heart utvikling er en kompleks prosess overgang gjennom flere morphologically distinkte embryonale stadier1,2. Halvmåne form av cardiac stamfar befolkningen cellene danner en lineær sentrum rør og deretter gjennomgår forlengelse og løkker i spiral form av utvikle hjerte. Etter sin septation prosessen, er utvikle hjertet forvandlet til fire-chambered hjertet. Avbrudd av prosessene resulterer i utviklingsmessige hjertefeil. Dermed er det viktig å forstå molekylære mekanismer underliggende kammer formasjon under heart utvikling. Til tross for mange tidligere studier på heart utvikling fortsatt vår forståelse av denne komplekse prosessen begrenset.
In situ hybridisering, immunohistochemistry og beta-galactosidase flekker bruker LacZ reporter mus har vært mye brukt å studere kammer formasjon under musen heart utvikling ved merking cardiac bestemt eller kammer bestemt strukturelle gener eller proteiner (f.eks Nppa, kupp-TFII, Irx4, MLC-2a og MLC-2v)3,4,5,6,7,8,9,10. Men disse eksperimenter ved hjelp av musen embryo krever betydelig tid og kompetanse, fordi flere annerledes eksperimentell trinn må være utføres sekvensielt11. Her beskriver vi en enkel hele mount epifluorescent mikroskopi metode for å visualisere utvikle ventriklene bruker embryo dissekert MLC-2v-tdTomato reporter banke i mus12. Fordelen med denne metoden i forhold til tidligere brukte metodene er å unngå komplekse eksperimentelle skritt som kan ofte skape experimental variasjoner. Hovedformålet med denne protokollen er å beskrive hvordan å dissekere mouse embryoer og utvikle hjerter og undersøke hvert utviklingstrinn musen cardiac kammer uten kjedelig histochemical eksperimenter. Denne metoden kan lett brukes for å vurdere heart utvikling med ulike andre transgene musen linjer merking tidlig cardiac markører (f.eks Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: Rosa mT /mG14, Nkx2-5Cre: Rosa mT/mG14, Hcn4-eGFP15, Isl1Cre: Rosa mT/mG14, Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15, og TgMef2c-AHF-GFP16 mus).
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden beskrevet her er relativt enkel å undersøke ventrikkel kammer utvikling, uten å utføre arbeidskrevende eksperimenter for å merke ventrikkel eller hjerte-spesifikke strukturelle gener eller proteiner. Dermed reduserer denne metoden tekniske variabilities som ble ofte funnet i immunostained hjertet deler.
Det er to viktige skritt for å kunne utføre denne metoden inkludert nøyaktig anslag på embryonale alder av mus og Disseksjon av embryonale hjerter. Vi anslår praktisk embryona…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NIH R03 HL140264 (Y.-J. N) og Gilead Sciences Research forskningsprogram (Y.-J. N).
Materials
| dissecting microscope | Leica | MZ125 | |
| DNA ladder (100 bp) | Promega | G2101 | |
| epifluorescence dissecting microscope | Leica | M165 FC | |
| GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
| PCR machine (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |
Referências
- Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. Myocardial lineage development. Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).
- Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M. Molecular regulation of cardiomyocyte differentiation. Circulation Research. 116 (2), 341-353 (2015).
- Lee, K. J., et al. Myosin light chain-2 luciferase transgenic mice reveal distinct regulatory programs for cardiac and skeletal muscle-specific expression of a single contractile protein gene. Journal of Biological Chemistry. 267 (22), 15875-15885 (1992).
- Chen, J., et al. Selective requirement of myosin light chain 2v in embryonic heart function. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 1252-1256 (1998).
- Ross, R. S., Navankasattusas, S., Harvey, R. P., Chien, K. R. An HF-1a/HF-1b/MEF-2 combinatorial element confers cardiac ventricular specificity and established an anterior-posterior gradient of expression. Development. 122 (6), 1799-1809 (1996).
- Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
- Wu, S. P., et al. Atrial identity is determined by a COUP-TFII regulatory network. Developmental Cell. 25 (4), 417-426 (2013).
- Nelson, D. O., Jin, D. X., Downs, K. M., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Developmental Dynamics. 243 (3), 381-392 (2014).
- Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283 (5405), 1161-1164 (1999).
- Kubalak, S. W., Miller-Hance, W. C., O’Brien, T. X., Dyson, E., Chien, K. R. Chamber specification of atrial myosin light chain-2 expression precedes septation during murine cardiogenesis. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16961-16970 (1994).
- Bardot, P., et al. The TAF10-containing TFIID and SAGA transcriptional complexes are dispensable for early somitogenesis in the mouse embryo. Development. 144 (20), 3808-3818 (2017).
- Zhang, Z., Nam, Y. J. Generation of MLC-2v-tdTomato knock-in reporter mouse line. Genesis. , (2018).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- O’Brien, T. X., Lee, K. J., Chien, K. R. Positional specification of ventricular myosin light chain 2 expression in the primitive murine heart tube. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5157-5161 (1993).
