Анализ развития сердечной камеры во время эмбриогенеза мыши с помощью эпифлуоресцентного вся гора
Summary
Мы представляем протоколы для изучения развития сердца мыши, с помощью микроскопии всю гору epifluorescent эмбрионов мыши, расчлененный от желудочков конкретных док 2v-tdTomato репортер забивные мышей. Этот метод позволяет нам непосредственно визуализировать каждый этап формирования желудочка во время разработки сердца мыши без трудоемкого гистохимические методы.
Abstract
Цель настоящего Протокола заключается в описания метода для визуализации желудочков палат эмбриона мыши во время разработки сердца с помощью желудочков конкретных флуоресцентные репортер стук в мышах (док 2v-tdTomato мышей) и dissection зародышей мыши. Сердце развития включает в себя формирование трубки линейной сердце, сердце трубки циклов и четыре камеры septation. Эти сложные процессы сохраняются весьма всех позвоночных. Сердце эмбриона мыши широко используется для развития исследований сердца. Однако из-за их крайне небольшой размер, рассекает мыши эмбриональные сердца технически сложным. Кроме того визуализация сердечной камеры формирования часто нуждается в гибридизации situ, бета галактозидазы окрашивание с помощью LacZ репортер мышей, или иммуноокрашивания секционного эмбриональных сердец. Здесь мы опишем, как вскрыть мыши эмбриональные сердца и непосредственно визуализировать желудочков камеры формирования док 2v-tdTomato мышей, используя всю гору epifluorescent микроскопии. С помощью этого метода возможность непосредственно изучить сердце трубки формирования и циклов и четыре камеры формирования без дальнейших экспериментальных манипуляций зародышей мыши. Хотя линия стук в мыши репортер док 2v-tdTomato используется в этот протокол в качестве примера, этот протокол может применяться на другие линии сердца конкретных флуоресцентные репортер трансгенные мыши.
Introduction
Камеры формирования во время разработки сердца является сложным процессом перехода через несколько морфологически различные эмбриональных стадий1,2. Форме полумесяца сердечной прогениторных клеток населения образует трубу линейной сердца и затем подвергается удлинение и циклы в форму спирали развивающихся сердца. После его septation процесса развивающегося сердце превращается в четырех-сердце. Перерыва какого-либо из этих процессов в результате пороков развития сердца. Таким образом важно понять молекулярные механизмы, лежащие в основе формирования палаты во время разработки сердца. Несмотря на многочисленные предыдущие исследования по развитию сердца наше понимание этого сложного процесса, остается ограниченным.
Гибридизации in situ, иммуногистохимия и бета галактозидазы окрашивание с помощью LacZ репортер мышей широко использовался для изучения формирования палаты во время разработки сердца мыши, снабдив сердечной конкретных или камеры конкретных структурных генов или белки (например, НПЛН, переворот-TFII, Irx4, док 2a и док 2v)3,4,5,6,,78,9,10. Однако, эти эксперименты с использованием эмбрионов мыши требуется значительное время и опыт, потому что несколько различных экспериментальных шаги должны быть выполнены последовательно11. Здесь мы описываем метод простой всю гору epifluorescent микроскопии визуализировать развивающихся желудочков с использованием эмбрионов, расчлененный от док 2v-tdTomato репортер мышей стук в12. Преимущество этого метода по сравнению с ранее использовавшихся методов, чтобы избежать сложных экспериментальные шаги, которые часто может создать экспериментальные варианты. Основной целью настоящего Протокола является описать как вскрыть зародышей мыши и развивающихся сердца и изучить каждый этап развития сердечной камеры мыши без утомительного гистохимические экспериментов. Этот метод легко может применяться для оценки развития сердца, с использованием различных других трансгенные мыши линии маркировки ранней сердечной маркеров (например, Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: Роза mT /MG14, Nkx2-5Cre: Роза mT/мг14, Hcn4-eGFP15, Isl1Cre: Роза mT/мг14, Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15и TgMef2c-AHF-GFP16 мышей).
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод, описанный здесь является относительно простым для изучения развития желудочковой камеры, без выполнения трудоемких эксперименты на этикетке желудочка или сердечной конкретных структурных генов и белков. Таким образом этот метод минимизирует технические изменчивости, которые…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH R03 HL140264 (ю.-Дж. N) и Галааде наук исследования ученый программа (ю.-Дж. N).
Materials
| dissecting microscope | Leica | MZ125 | |
| DNA ladder (100 bp) | Promega | G2101 | |
| epifluorescence dissecting microscope | Leica | M165 FC | |
| GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
| PCR machine (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |
Referências
- Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. Myocardial lineage development. Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).
- Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M. Molecular regulation of cardiomyocyte differentiation. Circulation Research. 116 (2), 341-353 (2015).
- Lee, K. J., et al. Myosin light chain-2 luciferase transgenic mice reveal distinct regulatory programs for cardiac and skeletal muscle-specific expression of a single contractile protein gene. Journal of Biological Chemistry. 267 (22), 15875-15885 (1992).
- Chen, J., et al. Selective requirement of myosin light chain 2v in embryonic heart function. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 1252-1256 (1998).
- Ross, R. S., Navankasattusas, S., Harvey, R. P., Chien, K. R. An HF-1a/HF-1b/MEF-2 combinatorial element confers cardiac ventricular specificity and established an anterior-posterior gradient of expression. Development. 122 (6), 1799-1809 (1996).
- Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
- Wu, S. P., et al. Atrial identity is determined by a COUP-TFII regulatory network. Developmental Cell. 25 (4), 417-426 (2013).
- Nelson, D. O., Jin, D. X., Downs, K. M., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Developmental Dynamics. 243 (3), 381-392 (2014).
- Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283 (5405), 1161-1164 (1999).
- Kubalak, S. W., Miller-Hance, W. C., O’Brien, T. X., Dyson, E., Chien, K. R. Chamber specification of atrial myosin light chain-2 expression precedes septation during murine cardiogenesis. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16961-16970 (1994).
- Bardot, P., et al. The TAF10-containing TFIID and SAGA transcriptional complexes are dispensable for early somitogenesis in the mouse embryo. Development. 144 (20), 3808-3818 (2017).
- Zhang, Z., Nam, Y. J. Generation of MLC-2v-tdTomato knock-in reporter mouse line. Genesis. , (2018).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- O’Brien, T. X., Lee, K. J., Chien, K. R. Positional specification of ventricular myosin light chain 2 expression in the primitive murine heart tube. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5157-5161 (1993).
