ברזולוציה גבוהה 3D הדמיה של זיהום וירוס כלבת ברקמת המוח נקי ממס
Summary
רומן, חיסוני התאמה לניקוי רקמות הרקמה כמו הדמיה 3D האולטימטיבי של איברים הממס נקי לאפשר הדמיה 3D של זיהום המוח וירוס כלבת הסביבה הסלולרית המורכבת שלה. עבה, נוגדן מתויג פרוסות רקמת המוח נעשים שקופים להגדיל את עומק ההדמיה כדי לאפשר ניתוח תלת-ממד על ידי המיקרוסקופיה סריקת לייזר מיקרוסקופ.
Abstract
ההדמיה של תהליכי זיהום ברקמות ובאיברים על ידי immunolabeling היא שיטה מרכזית בביולוגיה זיהום מודרני. היכולת להתבונן וללמוד את ההפצה, tropism, שפע של פתוגנים בתוך רקמות האיברים מספק נתונים מרכזי על פיתוח המחלה והתקדמות. באמצעות שיטות מיקרוסקופ קונבנציונאלי, אימונויניום מוגבל בעיקר לחלקים דקים המתקבלים פרפין-מוטבע או מדגמים קפואים. עם זאת, מישור התמונה 2D מוגבל של סעיפים דקים אלה עשוי להוביל לאובדן מידע חיוני על המבנה המורכב של איבר נגוע ההקשר הסלולר של הזיהום. המודרנית multicolor, חיסוני מכתים לניקוי רקמות הרקמה כעת לספק דרך מהירה יחסית וזולה ללמוד בנפח גדול 3D התמונה ערימות של רקמת איבר נגוע וירוס. על-ידי חשיפת הרקמה לממיסים אורגניים, היא הופכת לשקופה בצורה אופטית. זה תואם את מדדי השבירה של המדגם ובסופו של דבר מוביל לירידה משמעותית של פיזור אור. כך, בשילוב עם מטרות ארוכות בטווח העבודה הפנוי, מקטעי רקמות גדולים עד גודל של 1 מ”מ ניתן לתמונה על ידי מיקרוסקופ מיקרוסקופית לייזר קונפוקלית וקד מקובל (clsm) ברזולוציה גבוהה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול להחיל הדמיה עמוקה רקמות לאחר ניקוי רקמות כדי להמחיש התפלגות וירוס כלבת במוח נגוע על מנת ללמוד נושאים כמו פתוגנזה וירוס, התפשטות, tropism, והפלישה neuroinvasion
Introduction
טכניקות היסטולוגיה קונבנציונאלי להסתמך בעיקר על חלקים דקים של רקמות איברים, אשר יכול באופן מטבעו לספק רק התובנות 2D לתוך סביבת 3D מורכבת. למרות שניתן לעשות זאת בעיקרון, שחזור תלת-ממדי ממקטעים דקים סדרתיים מחייב קווים טכניים מסוימים לפריסה ולאחר מכן ביישור סיליקו של התמונות הנרכשים1. יתר על כן, שחזור חלק של כרכים z לאחר חיתוך מיקרוטום הוא קריטי כמו גם ממצאים מכניים וחישוביים יכולים להישאר בגלל רישום התמונה האופטימלי הנגרמת על ידי מטוסי התמונה לא חופפים, וריאציות מכתים, ופיזית , הרס רקמות על ידי. למשל, להב המיקרו-טומה לעומת זאת, חיתוך אופטי טהור של דגימות רקמה עבה שלמים מאפשר רכישה של מטוסי תמונה חופפים (דגימה מראש), ובכך, מקלה על שחזור תלת-ממד. זה, בתורו, מועיל מאוד לניתוח של תהליכים זיהום באוכלוסיות תאים מורכבות (למשל, רשתות נוירואליות בהקשר של התאים גליה המקיפים והחיסונית). עם זאת, מכשולים הטבועה של מקטעי רקמה עבים כוללים פיזור אור חדירה נוגדן מוגבלת לתוך הרקמה. בשנים האחרונות, מגוון של טכניקות פותחה ממוטבת להתגבר על בעיות אלה2,3,4,5,6,7,8 , מיכל בן 10 , מיכל עשור , מיכל בן 11 , מיכל בן 12 , 13. ביסודו של דבר, רקמות היעד הפכו שקופים באופן שקוף על ידי טיפול עם מימית2,3,4,5,6,7 ,8,9 או אורגני מבוסס הממס10,11,12,13 פתרונות. המבוא של 3disco (3disco הדמיה של איברים הממס נקי)11,12 ו udisco העוקבת שלה (3disco האולטימטיבי הדמיה של האיברים הממס נוקה)13 סיפק מהיר יחסית, פשוט, ו זול הכלי עם יכולות סליקה מצוינות. המרכיבים העיקריים של פרוטוקול סליקה הם ממיסים אורגניים טרט-butanol (יפורסם), בנזיל אלכוהול (BA), בנזיל בנזואט (BB), ו diphenyl אתר (dpe). הפיתוח והתוספת של iDISCO (immunolabeling מאופשר 3D הדמיה של איברים הממס נוקה)14, פרוטוקול חיסוני תואם, היוו יתרון נוסף על שיטות קיימות ואיפשר את התיוג העמוק ברקמה של אנטיגנים של עניין, כמו גם אחסון לטווח ארוך של דגימות מוכתם חיסוני. כך, השילוב של iDISCO14 ו udisco13 מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של חלבונים המסומנים נוגדנים בסעיפים רקמות גדולות (עד 1 מ”מ) באמצעות clsm קונבנציונאלי.
שימור מבנה מורכב של איבר בכל שלושת הממדים חשוב במיוחד לרקמת המוח. נוירונים מהווים תת הטרוגנית התאית מאוד עם מורפולוגיות 3D מגוונים מאוד מבוסס על התחזיות הneurite שלהם (נבדק על ידי Masland15). יתרה מזאת, המוח מורכב ממספר תאים ותאי משנה, כל אחד מהם מורכב מאוכלוסיות שונות של תת-משנה ומיחס אליו, כולל תאים גליאל ונוירונים (שנבדקו על ידי פון ברטלד ואח ‘16). כווירוס נוירוטרופי, וירוס הכלבת (rabv, נבדק על ידי fooks ואח ‘17) מדביק בעיקר נוירונים, באמצעות מכונות ההובלה שלהם לנסוע בכיוון נסיגה לאורך אקסונים מהאתר העיקרי של זיהום למערכת העצבים המרכזית (cn). הפרוטוקול המתואר כאן (איור 1א) מאפשר זיהוי חיסוני בסיוע ויזואליזציה של התאים הנגועים RABV ו-rabv ב גדול, בערימות תמונה קוהרנטית שהתקבלו מרקמת המוח נגוע. הדבר מאפשר הערכה ברזולוציה גבוהה משוחדת, תלת-ממדית של סביבת הזיהום. זה חל על רקמת המוח ממגוון של מינים, ניתן לבצע מיד לאחר קיבעון או אחרי אחסון לטווח ארוך של דגימות של פאראפורמלדהיד (בתחתית), ומאפשר אחסון והדמיה מחדש של דגימות מוכתם ומנוקה במשך חודשים.
Protocol
Representative Results
Discussion
התחייה ופיתוח נוסף של טכניקות ניקוי רקמות בשנים האחרונות2,3,4,5,6,7,8 , מיכל בן 10 , מיכל עשור , מיכל בן 11 ,</sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לתומס סי מטנלייטר ולוורנה טה קמפ על שקראו באורח קשה את כתב היד. עבודה זו היתה נתמכת על ידי יוזמת מצוינות פדרלית של קלנבורג מערב פומרניה והקרן החברתית האירופית (esf) מענק ko kt (esf/14-BM-A55-0002/16) ו מענק מחקר משותף בקיר על lyssaviruses ב פרידריך-לופלר-מכון (Ri-0372).
Materials
| Reagents | |||
| Benzyl alcohol | Alfa Aesar | 41218 | Clearing reagent |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | BB6630-500ML | Clearing reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | 4720.2 | Various buffers |
| Diphenyl ether | Sigma-Aldrich | 240834-100G | Clearing reagent |
| DL-α-Tocopherol | Alfa Aesar | A17039 | Antioxidant |
| Donkey serum | Bio-Rad | C06SBZ | Blocking reagent |
| Glycine | Carl Roth | 3908.2 | Background reduction |
| Goat serum | Merck | S26-100ML | Blocking reagent |
| Heparin sodium salt | Carl Roth | 7692.1 | Background reduction |
| Hydrogen peroxide solution (30 %) | Carl Roth | 8070.2 | Sample bleaching |
| Methanol | Carl Roth | 4627.4 | Sample pretreatment |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | Crystalline powder to make fixative solution |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | Prevention of microbial growth in stock solutions |
| tert-Butanol | Alfa Aesar | 33278 | Sample dehydration for tissue clearing |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher | T3605 | Nucleic acid stain |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.2 | Detergent |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | Detergent |
| Miscellaneous | |||
| 5 mL reaction tubes | Eppendorf | 0030119401 | Sample tubes |
| Coverslip, circular (diameter: 22 mm) | Marienfeld | 0111620 | Part of imaging chamber |
| Coverslip, circular (diameter: 30 mm) | Marienfeld | 0111700 | Part of imaging chamber |
| Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm]) | B. Braun | 4657705 | Filling of the imaging chamber with clearing solution |
| RTV-1 silicone rubber | Wacker | Elastosil E43 | Adhesive for the assembly of the imaging chamber |
| Ultimaker CPE 2.85 mm transparent | Ultimaker | 8718836374869 | Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber |
| Technical equipment and software | |||
| 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 2+ | Printing of imaging chamber |
| Automated water immersion system | Leica | 15640019 | Software-controlled water pump |
| Benchtop orbital shaker | Elmi | DOS-20M | Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm) |
| Benchtop orbital shaker, heated | New Brunswick Scientific | G24 Environmental Shaker | Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm) |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | DMI 6000 TCS SP5 | Inverted confocal microscope for sample imaging |
| Fiji | NIH (ImageJ) | open source software (v1.52h) | Image processing package based on ImageJ |
| Long working distance water immersion objective | Leica | 15506360 | HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2 |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Sample slicing |
| Workstation | Dell | Precision 7920 | CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB |
| Primary antibodies | |||
| Goat anti-RABV N | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400 |
|
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100 |
| Rabbit anti-MAP2 | Abcam | ab32454 | Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250 |
| Rabbit anti-RABV P 160-5 | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000 |
|
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
Referências
- Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction. Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-171 (2011).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Masland, R. H. Neuronal cell types. Current Biology. 14 (13), 497-500 (2004).
- von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
- Fooks, A. R., et al. Rabies. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17091 (2017).
- WHO. WHO Expert Consultation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. , (2018).
- CDC. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th Edition. US Department of Health and Human Services. , (2009).
- Arnold, M. M., et al. Effects of fixation and tissue processing on immunohistochemical demonstration of specific antigens. Biotechnic & Histochemistry. 71 (5), 224-230 (1996).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. The American Journal of Surgical Pathology. 24 (7), 1016-1019 (2000).
- Orbanz, J., Finke, S. Generation of recombinant European bat lyssavirus type 1 and inter-genotypic compatibility of lyssavirus genotype 1 and 5 antigenome promoters. Archives of Virology. 155 (10), 1631-1641 (2010).
