Projeto de ligadura cecal e punção e infecção intranasal modelo duplo de imunossupressão induzida por sepse
Summary
Este protocolo descreve as técnicas para medir os resultados infecciosos que subjacentes infecções hospital-adquiridas secundárias na condição imunossupressores, primeiramente estabelecendo camundongos cecal da ligadura/punctura então desafiando os com infecção intranasal a criar um modelo clinicamente relevante de sepse imunossupressor.
Abstract
A sepse, uma infecção grave e complicada e com risco de vida, caracteriza-se por um desequilíbrio entre respostas pró-inflamatórias e anti-inflamatórios em múltiplos órgãos. Com o desenvolvimento de terapias, a maioria dos pacientes sobrevive à fase hiperinflamatória, mas progride para uma fase imunossupressora, o que aumenta o surgimento de infecções secundárias. Conseqüentemente, a compreensão melhorada da patogénese que subjacente infecções hospital-adquiridas secundárias na fase imunossupressores durante o sepsis é da importância tremenda. Relatado aqui é um modelo para testar os resultados infecciosos, criando infecções de golpe duplo em camundongos. Um procedimento cirúrgico padrão é utilizado para induzir a peritonite polimicrobiana por ligadura cecal e punção (CLP) e seguida por infecção intranasal de Staphylococcus aureus para simular pneumonia ocorrendo na supressão imune que é freqüentemente observada em pacientes sépticos. Este modelo duplo pode refletir o estado imunossupressores que ocorre nos pacientes com sepsis prolongado e susceptibilidade à infecção secundária da pneumonia nosocomial. Assim, este modelo fornece uma abordagem experimental simples para investigar a fisiopatologia da pneumonia bacteriana secundária induzida por sepse, que pode ser utilizada para a descoberta de novos tratamentos para sepse e suas complicações.
Introduction
A sepse inicia uma complexa interação de processos pró-inflamatórios e anti-inflamatórios do hospedeiro e é caracterizada por uma resposta hiperinflamatória e subsequente disfunção imunológica1,2. A sepse representa uma prioridade de saúde global e provoca um elevado número de óbitos em unidades de terapia intensiva (UTI)3. Estima-se que a incidência de sepse exceda 30 milhões casos em todo o mundo por ano, com taxas de mortalidade tão elevadas quanto 30%, apesar dos avanços na gestão da UTI4,5. Em 2017, a Organização Mundial de saúde adotou uma resolução para melhorar a prevenção, o diagnóstico e a gestão desta doença mortal5. No entanto, estudos recentes têm ilustrado que a morte não resulta da infecção primária em pacientes sépticos graves, mas sim da infecção nosocomial secundária (particularmente pneumonia) causada pela imunossupressão6,7 . Portanto, compreender os mecanismos de por que os pacientes sépticos desenvolvem infecção secundária e descobrindo tratamentos mais eficazes são urgentemente necessários. Nisto, um modelo duplo, igualmente sabido como um modelo da dobro-batida, para estudar o fenômeno imunossupressores que ocorre nos pacientes com sepsis protracted é descrito.
Como modelo experimental padrão-ouro em pesquisa sobre sepse polimicrobiana, a ligadura e punção cecal (CLP) é uma cirurgia caracterizada por ligadura e perfuração de caqui, que contribui para a peritonite polimicrobiana e a sepse8,9 . O processo fisiopatológico e os perfis de citocinas, juntamente com a cinética e a magnitude, são semelhantes aos da sepse clínica. A posição da ligadura, o tamanho da agulha utilizada para a punção e o número de punções cecais são fatores importantes que impactam a mortalidade após o CLP.
A pneumonia nosocomial é a principal causa de mortalidade entre pacientes criticamente enfermos com sepse. O principal tipo de organismos causadores de sepse grave inclui Staphylococcus aureus (20,5%), espécies de Pseudomonas (19,9%), Enterobacteriacae (principalmente e. coli, 16,0%) e fungos (19%). Entretanto, estudos recentes sugerem uma incidência crescente de organismos gram-positivos, que agora são quase tão comuns quanto as infecções Gram-negativas3.
O método descrito neste protocolo envolve o CLP, realizado como o “primeiro hit” para induzir a peritonite polimicrobiana subletal, que manifesta uma condição de imunossupressão. O procedimento também envolve a subsequente instilação intranasal de S. aureus como o “segundo hit” para fornecer uma plataforma de pesquisa clinicamente relevante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como o modelo padrão-ouro para a pesquisa de sepse, o CLP tem uma combinação de três insultos, incluindo trauma tecidual causado pela laparotomia, necrose devido à ligadura do cálio, e infecção como resultado de vazamento microbiano que causa peritonite com translocação de bactérias no sangue8. Portanto, o CLP imita a complexidade da sepse humana melhor do que muitos outros modelos. No entanto, uma das principais limitações do modelo CLP atual é a incapacidade de refletir a fase mais…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelos institutos nacionais de subsídios à saúde R01 AI138203-01, AI109317-04, AI101973-01 e AI097532-01A1 para M. W. As instalações da Universidade de North Dakota Core foram apoiadas por subsídios NIH (INBRE P20GM103442 e COBRE P20GM113123). Este trabalho foi apoiado igualmente pelo programa chave da Fundação Nacional da ciência da natureza de China (81530063) a Jianxin Jiang. Os financiadores não tiveram papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Agradecemos a Marvin Leier (centro de saúde rural, Universidade de Dakota do Norte) por fazer o vídeo.
Materials
| 21 G 1 ½ Needle | BD | BD305167 | |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Anti-mouse CD11b antibody | Biolegend | 101201 | |
| Anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | Biolegend | 108401 | |
| C57BL/6 mice | Harlan (Indianapolis) | C57BL/6NHsd | |
| Desk light | General Supply | General Supply | |
| Disinfecting wipes | Clorox | B07NV5JMCS | |
| Electric razor | General Supply | General Supply | |
| ELISA kits (mouse IL-1β, IL-6 and TNFα) | Invitrogen | 88-7013, 88-7064, and 88-7324 | |
| Iodine | Dynarex | B003U463PY | PVP Iodine Wipes |
| Ketamine | FORT DODGE | NDC 0856-2013-01 | Amine hydrochloride injection |
| Laboratory scale | General Supply | General Supply | |
| LB Agar, Miller | Fisher Scientific | BP1425-500 | Molecular genetics, powder |
| Micropipette | ErgoOne | 7100-1100 | |
| Normal saline | General Supply | General Supply | |
| Polylined towel | CardinalHealth, Convertors | 3520 | Surgical drape, sterile, for single use only |
| Silk suture, 4-0 | DAVIS & GECK | 1123-31 | |
| Small animal needle holder | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgery scissors | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgical forceps | General Supply | General Supply | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 13301 | |
| Warm pad | General Supply | General Supply | |
| Xylazine | Alfa Aesar | 7361-61-7 |
Referências
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