אוביקווינציה היא שינוי פוסט-טרנסלייתי המשחק תפקידים חשובים בתהליכים סלולריים והוא מתואם באופן הדוק על ידי דאובינציה. פגמים בשתי התופעות מתחת לפתווגיות אנושיות. אנו מספקים פרוטוקולים לביצוע התגובה אוביקווינציה ותגובת דאוביטיות באמצעות רכיבים מטוהרים.
אוביקווינציה היא שינוי פוסט-טרנסלייתי, שמנגן תפקידים חשובים במסלולי איתות שונים, והוא מעורב בעיקר בתיאום תפקוד כרומטין ותהליכים הקשורים ל-DNA. שינוי זה כולל פעולה רציפה של אנזימים מספר כולל E1 אוביקוויב-הפעלה, E2 אוביקוויב-מעלה-מעלה ו-E3 אוביקוויב-ligase והוא הפוך על ידי דאוביטיות (DUBs). אוביקווינציה גורמת השפלה של חלבונים או שינוי של פונקציית החלבון כולל אפנון של פעילות אנזימטית, חלבון-חלבון אינטראקציה ולוקליזציה subcellular. צעד קריטי להפגין אוביקוויטיות חלבון או דאובינציה היא לבצע תגובות מחוץ לחומרים עם רכיבים מטוהרים. התגובות אוביקוויטיות יעיל והתגובה הדו יכול להיות מושפע מאוד על ידי רכיבים שונים המשמשים, האנזים שיתוף גורמים, מאגר תנאים, ואת האופי של המצע. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים צעד אחר צעד לניהול אוביקווינציה ותגובות דאוטיות. אנו ממחישים את התגובות הללו באמצעות רכיבים מינימליים של מתחם העכבר polycomb סרק מורכב 1 (PRC1), BMI1, ו RING1B, E3 אוביקוויב ליגאז לפני שהוא H2A על ליזין 119. דאוביטיות של נוקלאוטיז H2A מבוצע באמצעות מורכבות מינימלית של הפולימסרק (PR-דאב) המורכב על ידי האדם deubiquitinase BAP1 והמתאם הדו (דאובאד) התחום של הגורם המשותף שלה ASXL2. ניתן לנהל את הרקומביננטי האלה בהקשר של מישהו משני הצדדים בחלבונים מטוהרים בחיידקים או בנוקלאוזומים מקומיים מטוהרים מתאי מיונקים. אנו מדגישים את המורכבויות שיכולה להשפיע באופן משמעותי על תגובות אלה ואנו מציעים כי העקרונות הכלליים של הפרוטוקולים הללו יכולים להתאים במהירות ל-E3 אחרים ולליקוויטיות.
אוביקווינציה היא אחת השינויים השכיחים ביותר שלאחר ההעברה והיא קריטית עבור מגוון רחב של אורגניזמים כולל שמרים, צמחים ובעלי חוליות. אוביקווינציה מורכבת ההחזקה הקוולנטי של אוביקוויב, 76 שמרו באופן מאוד polypeptide חומצות אמינו, כדי למקד את החלבונים ומתרחשת בשלושה צעדים רציפים מעורבים שלושה אנזימים, כלומר, E1-הפעלה, E2-מעלה מעלה ו E3 ליגאז1, 2,3. השינוי הפוסט-טרנסלייתי הזה ממלא תפקידים מרכזיים בספקטרום רחב של תהליכים ביולוגיים. אכן, E3 ליגסים, אשר לספק את הספציפיות של התגובה, מהווים משפחה גדולה של אנזימים הם האנזימים הנפוצים ביותר של מערכת אוביקוויב4,5,6. השפעות הזרם המורד של אוביקוויטיות בחלבון תלויות באופי השינוי: מונאובינציה, רב-מונאובינציה, ולינארית או מסוpolyubiquitination. לעתים נדירות משויכת השפלה פרוטאספאל, אבל במקום זה שינוי מעורב במדיגדירוג אירועים שונים איתות. Polyubiquitination מערבת את N-מסוף או שאריות ליזין ב-אוביקוויב מולקולה עצמה, ואת גורלו של חלבון polyubiquitinated תלוי שבו שאריות מעורב בשלוחה אוביקוויב שרשרת. זה כבר זמן רב ידוע כי polyubiquitination תיווך על ידי ליזין 48 של אוביקוויב מעורר השפלה פרוטאספאואל. להיפך, polyubiquitination דרך ליזין 63 של אוביקוויבאין קשורה לעתים קרובות עם הפעלת חלבון7,8,9. בדומה שינויים חשובים אחרים לאחר שלאחר ההעברה, אוביקווינציה היא הפיכה ו אוביקוויב הסרת חלבונים מובטחת על ידי פרוטסים ספציפיים כינה דאוביטיות (DUBs), אשר התפתחה כרגולטורים חשובים של תהליכים סלולריים מיכל השני , 10. חשוב, dubs רבים מאוד מתמחה, ו לווסת, באמצעות דאוביציה, מצעים ספציפיים, המציין כי איזון עדין בין אוביקווינציה ו דאוביציה הוא קריטי לתפקוד החלבון. E3s ו DUBs, יחד עם מכונות השפלה פרוטאסדום וגורמי עזר, טופס אוביקוויב פרוטאסאט מערכת (UPS, עם > 1200 גנים) אשר מווסת מסלולים איתות העיקריים, כמה מהם משויכים צמיחת התאים והתפשטות, קביעת גורל התא, בידול, תא הגירה, ומוות תאים. חשוב מכך, רגולציה של מספר אותות מפלים מעורבים אוביקווינציה מקדמת טומגנזה ומחלות נוירוניוון5,11,12,13, . ארבע עשרה
אוביקווינציה ממלאת תפקידים בביולוגיה כרומטין ותהליכים תלויי-DNA15,16,17. למשל, מונביוביטיות של היסטון H2A על ליזין 119 (להלן H2A K119ub) הוא שינוי קריטי שלאחר ההמרה מעורב הדיכוי הטרנססקריפט ותיקון DNA18,19,20, 21,22. H2A K119ub הוא מזרז על ידי מתחם מורכב של פוליקומב דכ1 (PRC1), אשר ממלאת תפקיד מרכזי בתחזוקת מידע אפיגנטי והוא שימור מאוד מ דרוזוהילה לאדם. PRC1 קאנוני הוא היווה בעיקר על ידי RING1B ו BMI1, אשר הם הליבה E3 אוביקוויב ליגאז מורכבים אחראי על האירוע הנ ל אוביקווינציה22,23. ב דרוזוהילה, H2A מונבינציה (H2A K118ub המקבילה H2A K119ub ב מחאלינים) הפוכה על ידי ה-דאב קליפסו, אשר מקיים אינטראקציה עם מסרק סקס נוסף (asx) היוצרים את קומפלקס הפוליקומב הדכאני (PR-דאב)24. משתיק היונקים של קליפסו, BAP1, הוא מדכא הגידול נמחק או מופעל ב ממאירות שונים של בני אדם25,26,27,28, בן 29 , בן 30 , מיכל בן 31 , 32 , 33. BAP1 מסדיר את התהליכים התלויים ב-DNA בגרעין ובסידן-איתות-בתיווך ואפופטוזיס ב-הרשת האנדופלזמית33,34,35,36, 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. BAP1 מרכיב מערכות מרובות חלבון משנה המכילה ומווסתים שעתוק בעיקר ASXL1, ASXL2 ו ASXL3 (asxls), שלושה orthologues של asxls38,43. Asxls להשתמש במתאם דוסי ביקווינואז (דאובאד) דומיין, גם נקרא תחום asxls, כדי לעורר BAP1 דאב פעילות35,36,44. מכאן, ASXLs לשחק תפקידים חשובים בתיאום פעילות BAP1 דאב ב כרומטין ובאופן כללי יותר פונקציית מדכא הגידול שלה.
מספר שיטות קיימות כדי ללמוד אוביקווינציה ותהליכי דאובינציה. בעיקר, ביוכימיים אומר שימוש בחלבונים מטוהרים מחיידקים להישאר חזק מאוד להפגין אוביקווינציה ישירה של, או הסרת אוביקוויב מ, מצעים ספציפיים. ניתן לערוך ניסויים אלה כדי לחקור מגוון של פרמטרים כגון קביעת הדרישה של מתחמים מינימליים, קביעת מכלול התגובות הקינטיקה, הגדרת יחסי מבנה/תפקוד, והבנת ההשפעה של פתולוגי . מוטציות גנים כאן, אנו מספקים פרוטוקולים כדי לבצע אוביקווינציה ותגובות דאוטיות על מצעים כרומטין עם רכיבים מטוהרים. כמערכת מודל, בתוך מבחנה אוביקווינציה ו דאוביטיות של החלבון H2A של נוקלאוטיזומיום מוצג. חיידקים מטוהרים חלבונים התאספו במערכות מינימליות של RING1B/BMI1 ו BAP1/דאובאד משמשים עבור אוביקווינציה או דאוביטינציה של נוקלאוטיל H2A, בהתאמה.
ישנם מספר יתרונות של יצירת עמידות בפני מבחנה אוביקוויטיות ומוסר דאוביסטי לחלבונים של עניין. מאמר זה יכול לשמש ל: (i) לבסס תנאים אופטימליים ולהגדיר דרישה מינימלית לתגובות אלה, (ii) לקבוע הקבועים אנזימטית וביוכימיים (iii) להגדיר את התפקידים של קופנים או מעכבי שיכולים להשפיע על תגובות אלה, (iv) זיה?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לדיאנה אדז’נו לקבלת סיוע טכני. עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים ממדעי הטבע ומועצת המחקר ההנדסה של קנדה (2015-2020), הגנום קוויבק (2016-2019) ו הגנום קנדה (2016-2019) כדי E.B.A. E.B.A. הוא מלומד בכיר של כפות דה לה Recherche du קוויבק-סנטרה (FRQ-S). ל-L. M ו-N.S.K. יש מלגת דוקטורט מ-FRQ-S. ה. ב. הייתה מלגת דוקטורט מהמשרד להשכלה גבוהה וממחקר מדעי של תוניסיה וקרן קול.
Amylose agarose beads | New England Biolabs | #E8021 | |
Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10K | Sigma-Aldrich | #UFC501096 | |
Anti-H2AK119ub (H2Aub) | Cell Signaling Technology | #8240 | |
Anti-Flag-agarose beads | Sigma-Aldrich | #A4596 | |
Anti-protease cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | |
BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria | Agilent technologies | #230240 | |
DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
Empty chromatography column | Biorad | #731-1550 | |
Flag peptide | Sigma-Aldrich | #F3290 | |
GSH-agarose beads | Sigma-Aldrich | #G4510 | |
HEK293T | ATCC | #CRL-3216 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | #I5513 | |
Micrococcal nuclease (MNase) | Sigma-Aldrich | #N3755 | |
Ni-NTA agarose beads | ThermoFisher Scientific | #88221 | |
N-methylmaleimide (NEM) | Bioshop | #ETM222 | |
Pore syringe filter 0.45 μm | Sarstedt | #83.1826 | |
Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc | #23966-1 | |
pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) | Addgene | #63139 | |
Ub Activating Enzyme (UBE1) | Boston Biochem | #E-305 | |
UBCH5C (UBE2D3) | Boston Biochem | #E2-627 |