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Imunologia e Infecção

Nuovo protocollo per la generazione di cellule dendritiche fisiologiche immunogene

Published: May 17, 2019
doi:
10.3791/59370
, , , , , , , , , , ,
1Department of Dermatology,Yale University School of Medicine, 2Dermatology Department,University of Rome Tor Vergata, 3Department of Pathology,Yale University School of Medicine

Summary

Il dispositivo di transimmunizzazione (TI) o la piastra e i relativi protocolli sono stati sviluppati per replicare le caratteristiche chiave della fotochemioterapia extracorporea (ECP), in un ambiente sperimentale, permettendo la produzione di fisiologicamente attivato, Tunable dendritico cellule (DCs) per l’immunoterapia oncologica.

Abstract

La fotochemioterapia extracorporea (ECP) è un’immunoterapia del cancro ampiamente utilizzata per il linfoma cutaneo a cellule T (CTCL), operante in oltre 350 centri universitari in tutto il mondo. Mentre l’efficacia clinica e il profilo di sicurezza esemplare di ECP hanno spinto il suo uso diffuso, la spiegazione dei meccanismi sottostanti è rimasta una sfida, in parte a causa della mancanza di un modello ECP di laboratorio. Per superare questo ostacolo e creare una piattaforma semplice e facile da usare per la ricerca ECP, abbiamo sviluppato una versione ridotta del dispositivo clinico di trattamento dei leucociti ECP, adatto per il lavoro con entrambi i modelli di topo e piccoli campioni di sangue umano. Questo dispositivo è definito la camera di Transimmunizzazione (TI), o piastra. In una serie di esperimenti di riferimento, il dispositivo miniaturizzato è stato utilizzato per produrre un vaccino cellulare che ha regolarmente iniziato l’immunità terapeutica anti-cancro in diversi modelli di tumore del topo singenici. Rimuovendo i singoli fattori dal sistema sperimentale e verificando il loro contributo alla risposta anti-tumorale in vivo , abbiamo quindi chiarito i principali driver meccanicistici del potenziale di immunizzazione dell’ECP. Collettivamente, i nostri risultati hanno rivelato che gli effetti anti-tumorali di ECP sono iniziati da cellule dendritiche (DC), fisiologicamente generate attraverso l’interazione monocitaria del sangue con le piastrine nella piastra TI, e caricate con antigeni da cellule tumorali la cui cellula apoptotica la morte è finemente titolata dall’esposizione all’agente di cross-linking del DNA fotoattivabile 8-methoxypsoralen e luce UVA (8-MOPA). Quando è tornato al topo, questo vaccino cellulare porta a una specifica e trasferibile immunità alle cellule T anti-tumorale. Abbiamo verificato che la camera TI è adatta anche per la lavorazione del sangue umano, producendo DC umani completamente comparabili nello stato di attivazione e profilo a quelli derivati dalla camera clinica ECP. I protocolli qui presentati sono intesi per gli studi ECP nel topo e nell’uomo, la generazione controllata di cellule tumorali apoptotiche con 8-MOPa, e la produzione rapida di DCS fisiologici umani e topi monociti derivati da una varietà di applicazioni.

Introduction

La fotochemioterapia extracorporea (ECP) è un’immunoterapia consolidata che è ampiamente operativa nei centri universitari di tutto il mondo. Il suo uso è stato guidato da selettività unica, sicurezza, e l’efficacia bidirezionale della terapia ECP, tratti che ECP condivide con il sistema immunitario fisiologico stesso con cui sembra partner. L’ECP sta immunizzando selettivamente contro le cellule maligne nel linfoma cutaneo a cellule T (CTCL)1,2e tollerando selettivamente gli antigeni mirati nelle impostazioni di trapianto, autoimmunità e malattia del trapianto contro l’ospite (GVHD) 3 il , 4. l’immunogenicità dell’ECP è evidenziata dalla sua dipendenza da un compartimento di cellule T CD8 intatto in CTCL5, mentre la specificità è riflessa dal profilo di reazione avversa molto favorevole dell’ECP, senza soppressione immunitaria fuori bersaglio nel trapianto o Impostazioni GvHD e nessuna aumentata suscettibilità alle infezioni opportunistiche in CTCL, dove i cloni di cellule T non patogeni potrebbero essere persi insieme alle cellule T maligne.

Data l’importanza clinica della ECP, la speranza che una migliore comprensione dei suoi meccanismi possa ampliare la portata terapeutica dell’ECP a un più ampio spettro di tumori e disturbi immunologici ha stimolato l’interesse internazionale. Sono stati condotti e segnalati due workshop nazionali sanzionati, un Simposio nazionale di istituti di salute (NIH) stato-of-the-Science6 e una società americana per la conferenza di consenso di apheresis7, con l’obiettivo di accelerare la l’identificazione dei principali contributori cellulari agli effetti anti-cancro e tollerogenici della ECP.

Ad oggi, nonostante le numerose relazioni pubblicate che tentano di affrontare il meccanismo dell’ECP, due ostacoli primari hanno ostacolato i progressi scientifici. In primo luogo, l’indagine sui meccanismi di ECP nell’ambiente sperimentale del laboratorio è stata limitata dalla mancanza di un dispositivo ECP miniaturizzato che rifletterà pienamente gli effetti cellulari e in vivo dell’ECP ed essere applicabile ai modelli animali. In secondo luogo, l’analisi approfondita di laboratorio dei campioni di ECP in ambito clinico è stata limitata dalla limitata disponibilità di cellule immunitarie del paziente trattate con ECP, che richiedono l’accesso ai centri di trattamento, e sono inoltre soggette alla tempistica del infusioni del paziente, e la necessità etica di insiemi non compromessi di leucociti pazienti-reinfusi.

Per risolvere gli ostacoli che impediscono il progresso della ricerca in materia di ECP, ci siamo posti per sviluppare un apparato ECP miniaturizzato che imitano più da vicino gli elementi chiave della terapia. Il trattamento standard di ECP prevede il passaggio di leucociti arricchiti da leucoaferesi di un paziente attraverso una piastra di plastica da 1 mm di spessore, ultravioletta a luce (uva)-trasparente,6,8. Nel piatto, i leucociti sono esposti a 8-methoxypsoralen (8-MOP), un agente fotoattivabile che all’esposizione UVA è transitoriamente convertito in una forma reattiva (8-MOPa), in grado di cross-linking del DNA attraverso il suo legame bivalente a basi pirimidine su sorella DNA trefoli9,10. I leucociti trattatia8 MOP vengono raccolti e restituiti per via endovenosa al paziente.

Poiché ECP stessa è una terapia bidirezionale, immunizzante nel cancro e tollerante nelle impostazioni di trapianto, autoimmunità e GvHD, per chiarimenti abbiamo chiamato la modalità di immunizzazione del modello ECP “transimmunizzazione”, e la modalità tollerogenica “transtolerization”. Per la prima volta ci siamo concentrati sulla modalità di transimmunizzazione. Il nostro dispositivo ECP mouse-to-Man scalabile miniaturizzato recentemente riportato, la camera o la piastra di transimmunizzazione (TI) e il relativo protocollo, riproducono sia gli effetti cellulari che in vivo del dispositivo ECP umano in un ambiente di cancro11.

Al fine di rendere il modello di transimmunizzazione in vivo il più clinicamente rilevante possibile, abbiamo iniziato l’immunoterapia dopo che i tumori dei topi syngeneici iniettati per via sottocutanea sono diventati palpabili, testando così l’efficacia del protocollo nel cancro stabilito. Analogamente all’ECP nel CTCL, il protocollo di transimmunizzazione Proof-of-principio nel modello YUMM 1.7 del melanoma utilizza cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) da animali tumorali. Le cellule vengono passate attraverso la piastra TI sotto il flusso. Mentre 8-MOPun trattamento delle cellule nella camera in miniatura è possibile, è preferibile eseguire separatamente, per garantire che solo il tipo di cella desiderata è esposto a 8-MOPa. Studi precedenti indicano che l’effetto tollerogenico dell’ECP è mediato da 8-MOPa-infortunati cellule che presentano l’antigene12, mentre l’effetto immunizzante richiede 8-MOPuna lesione delle cellule tumorali bersaglio11. Nel protocollo di transimmunizzazione sia le cellule tumorali, o le cellule immunitarie, possono essere esposte selettivamente a 8-MOPa come necessario. Poiché massimizzando il tempo di contatto tra le cellule tumorali a-feritea8 MOP e le cellule dendritiche indotte da ECP (DC) ha dimostrato di migliorare significativamente la capacità immunoterapeutica dell’ECP clinico13, abbiamo incorporato una notte fase di co-incubazione nel nostro protocollo. Dopo l’incubazione notturna, le cellule trattate vengono restituite all’animale che porta il tumore.

Questo sistema ha ridotto in modo affidabile la crescita tumorale e ha avviato specifiche immunità anti-tumorale nei topi con tumori singenici consolidati11, e ci ha permesso di sezionare il meccanismo dell’efficacia clinica anti-tumorale di ECP. In diversi studi abbiamo dimostrato che l’immunità ECP è iniziata attraverso l’attivazione piastrinica ex vivo nella piastra ti14,15. Le piastrine attivate segnalano successivamente la maturazione delle cellule MONOCYTE-dendritiche14, portando alla produzione di DCS fisiologiche. I nuovi DC derivati da monociti sono in grado di incrociare gli antigeni internalizzati dalle cellule tumoralia8-MOP a-danneggiate per attivare le risposte delle cellule T specifiche dell’antigene16. Come suggerito in precedenza12,17, tuttavia, 8-MOPa-indotto danni del nascente DCS stessi possono contrastare-agire o addirittura invertire l’effetto anti-tumorale11, fornendo un collegamento meccanicistico alla tolleranza ECP.

La piastra TI è stata utilizzata anche per produrre DCs fisiologicamente attivati da PBMC umana. Analogamente agli studi del topo, i DCs umani derivati da TI sono dipendenti dal passaggio della placca in presenza di piastrine per la loro generazione, appaiono fenotipicamente identici a questi prodotti nella placca ECP clinica e sono in grado di elaborare e antigeni tumorali umani che presentano incroci per l’attivazione di cellule T umane11,16.

Nel svelare il meccanismo di immunoterapia ECP, abbiamo quindi scoperto un metodo per generare rapidamente fisiologici topi e cellule dendritiche umane della specificità dell’antigene desiderata, che può essere modulata funzionalmente. L’innovativo dispositivo e il protocollo TI hanno una notevole importanza potenziale nei campi della ricerca e della terapia con ECP e dell’immunoterapia oncologica più ampia, e in qualsiasi altro campo con interesse nelle cellule dendritiche fisiologiche e funzionali nell’immunizzazione o la modalità di tollerabilità. Speriamo che questa pubblicazione fornisca gli strumenti necessari a coloro che hanno interesse in tali aree di ricerca.

Protocol

Tutti i metodi del mouse qui descritti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali (IACUC) dell’Università di Yale, in accordo con gli istituti nazionali di sanità animale linee guida. Tutti gli studi umani sono stati condotti con il sangue donato da volontari sani, con consenso informato scritto. Gli studi del sangue umano sono stati condotti in conformità con le linee guida etiche riconosciute (ad esempio, dichiarazione di Helsinki, CIOMS, Belmont report, U.S. comune Rule), e sono stati approvati dal comitato di revisione investigativo umano Yale sotto il protocollo numero 0301023636. Nota: Il seguente è il protocollo che descrive la transimmunizzazione per la terapia anti-tumorale dei tumori singenici del topo. 1. syngeneic YUMM 1.7 impianto tumorale Seguire protocolli consolidati per impiantare tumori singenici nei fianchi dei topi in modo appropriato alla linea di cellule tumorali di interesse.Nota: Il protocollo seguente descrive il modello di tumore del melanoma del mouse YUMM 1.7 topi C57BL/6. Le cellule di melanoma YUMM 1.7 sono state gentilmente fornite dal Dr. Bosenberg, Yale18. Scongelare un’aliquota congelata delle cellule e usare le cellule dopo un passaggio di cellule. Cultura YUMM 1.7 celle appena scongelati nella miscela nutritiva dell’Aquila modificata di Dulbecco F-12 Medium (DMEM/F12), integrata con il 10% di siero bovino fetale inattivato al calore (FBS), 1% penicillina/streptomicina e 1% di aminoacidi non essenziali, sotto standard condizioni di coltura tissutale (37 ° c, 5% CO2). Raccogli le cellule YUMM 1.7 a 60 \ u201270% di confluenza aggiungendo abbastanza tripsin-EDTA per coprire la parte inferiore della piastra di coltura cellulare o pallone (ad esempio, 4 mL per un pallone T75). Riposare i vasi di coltura cellulare a temperatura ambiente per 3 \ u20124 min, toccando delicatamente sul fondo o sui lati della nave occasionalmente per aiutare a staccare le cellule. Aggiungere 1 mL di siero bovino fetale (FBS) per 4 mL di acido tripsina-etilenediaminetetraacetico (EDTA) per fermare la reazione una volta che la maggior parte delle cellule sono staccate. Raccogli le cellule pipettando in un tubo conico da 15 mL. Sciacquare il pallone con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e aggiungere il risciacquo allo stesso tubo di raccolta. Riempire il tubo a 15 mL con PBS. Estrarre una piccola aliquota e contare le cellule. Girare verso il basso per 10 minuti a 250 x g in una centrifuga di coltura tissutale standard per raccogliere le cellule tumorali. Risospendere le celle YUMM 1.7 in PBS a densità di 1 x 106 cellule/ml. Iniettare 1 x 105 cellule tumorali Yumm 1.7 per via sottocutanea in 100 ΜL di PBS nei fianchi giusti dei topi da 4 a 6 settimane di tipo selvatico maschi topi C57BL/6J, anestetizzati secondo le linee guida istituzionali (ad es. 3 \ u20125% di gas inalante isoflurano, anestesia confermata dalla mancanza di riflesso della zampa posteriore). Monitorare il volume del tumore tramite misurazioni bi-settimanali di diametri tumorali perpendicolari e altezza utilizzando una pinza. Calcolare YUMM 1.7 (volume del tumore come lunghezza del tumore x larghezza x altezza)/2. Avviare la terapia di transimmunizzazione quando i tumori diventano solo palpabili; per i tumori YUMM 1.7, questo è di solito giorno 7 \ u201210 post impianto tumorale. 2. raccolta di cellule mononucleari del sangue periferico per la Transimmunizzazione Raccogli 100 \ u2012150 μL di sangue da ogni topo che porta il tumore attraverso il sanguinamento delle guance. Come il sangue viene raccolto, pool di sangue da ogni gruppo di trattamento del topo (ogni 5 topi sperimentali + 5 topi di controllo) in un singolo 15 mL tubo contenente 5.000 U/mL eparina. Usare 10 μL di eparina al 10% per 100 μL di sangue raccolto.Nota: Mescolare frequentemente il tubo durante la raccolta per evitare la coagulazione del sangue. Mentre il controllo dei topi che portano il tumore può essere sanguinato contemporaneamente ai topi sperimentali, per garantire condizioni uguali con il gruppo di trattamento, il sangue “controllo” può essere scartato o combinato con il sangue del gruppo di trattamento per fornire ulteriori di PBMC sperimentale per il gruppo di trattamento, a discrezione degli investigatori. Impostare 1 15 mL di tubo con 4 mL di mezzo di isolamento dei linfociti (vedere la tabella dei materiali) per 5 \ u201210 topi dissanguati. Lentamente strato di sangue (raccolti da topi tumore-cuscinetto) sulla parte superiore del mezzo. Girare le cellule per 20 min a 1000 \ u20121, 500 x g per separare la PBMC dai globuli rossi. Alla fine della centrifugazione, raccogliere lo strato di plasma superiore, lasciando ~ 0,5 mL rimanente sopra il Buffy Coat, e conservare a 4 °C per uso successivo (passo 7,1). Raccogli lo strato di Buffy Coat in un tubo pulito da 15 mL, Riempi con PBS a 15 mL e gira per 10 minuti a 250 x g in una centrifuga di coltura tissutale standard per raccogliere le PBMC. Con cautela, togliere il surnatante e risospendere il pellet facendo scorrere il tubo. Non decant, poiché il pellet è morbido e può essere perso. Aggiungere 2 mL di tampone di lisi del globulo rosso ACK (vedere la tabella dei materiali) al tubo per rimuovere eventuali globuli rossi rimanenti dalla PBMC. Incubare su ghiaccio per 10 min. Riempire il tubo con PBS a 15 mL, e girare verso il basso per 10 minuti a 250 x g in una centrifuga di coltura tissutale standard per raccogliere la PBMC. Accuratamente Pipet fuori il surnatante, e risospendere il pellet da sfogliando. Non decant, poiché il pellet è morbido e può essere perso.Nota: A questo punto, la PBMC purificata può essere modificata come meglio si adatta all’esperimento. I vari componenti di PBMC (piastrine, monociti, altri tipi di cellule immunitarie) possono essere esauriti o isolati dalla PBMC secondo necessità. Inoltre, gli stessi PBMC possono essere esposti a 8-MOPa, prima o dopo la sezione 4 (prima o dopo il passaggio della lastra — dopo la sezione 2 o prima della sezione 5), seguendo le istruzioni di protocollo 3.3 \ u 20123.8 e sostituendo PBMC per le celle Yumm 1.7. Questo tronerà la capacità immunogenica del trattamento, e invece promuoverà la tolleranza immunitaria. Per ogni gruppo di trattamento (ogni 5 topi sperimentali + 5 topi di controllo), risospendere il pellet PBMC in 300 μL di FBS. 3.8-MOP/UVA trattamento delle cellule tumorali Cultura e raccogliere le cellule tumorali YUMM 1.7 come descritto nei passaggi 1.2 – 1.3 per preparare un 8-MOPa-esposto fonte di antigene di cellula tumorale. Preparare 2,5 x 106 Yumm 1.7 cellule tumorali per gruppo di trattamento di 5 topi. Per ogni gruppo di trattamento, risospendere il pellet di cellule tumorali in FBS a 2,5 x 106 cellule/300 μl (~ 8,33 x 106 cellule/ml). Con il cappuccio della coltura dei tessuti spento, aggiungere 8-MOP (vedere la tabella dei materiali) per la sospensione di cellule tumorali Yumm 1.7 per una concentrazione finale 8-mop di 100 ng/ml.Attenzione: 8-MOP è un agente fotoattivabile che danneggia il DNA e cancerogeno. Prestare attenzione durante la manipolazione e l’erogazione, evitare il contatto con la pelle esposta e scartare in modo appropriato. Mescolare bene le cellule, avvolgere il contenitore di cellule in lamina di stagno e incubare per 20 minuti a 37 °C. Pre-rivestire una piastra di coltura di tessuto 12-well riempiendo un pozzo per ogni gruppo di trattamento di 5 topi (2,5 x 106 Yumm 1.7 cellule tumorali) con 1 ml di FBS, e refrigerare riempito piastra per 20 min a 4 °C. Accendere la sorgente di luce UVA per preriscaldare.Attenzione: La luce UVA è cancerogena. Quando si lavora con sorgenti di luce UVA, lavorare in modo rapido e accurato, proteggere la pelle dall’esposizione e utilizzare scudi facciali o occhiali per proteggere il viso e gli occhi. Dopo 20 minuti, spostare la piastra refrigerata 12 pozzetti (passo 3,5) al cappuccio della coltura tissutale, rimuovere FBS dai pozzi e aggiungere 300 μL (2,5 x 106 cellule/pozzo) cellule tumorali esposte al mop (dal punto 3,4) per pozzetto. Esporre la piastra contenente cellule alla sorgente luminosa UVA pre-riscaldata per l’irraggiamento totale di 4 J/cm2.Nota: La concentrazione di 8 MOP e la dose di UVA qui descritta sono calibrate per la linea di cellule tumorali YUMM 1.7. Una titolazione di 8-MOP/UVA dose, sufficiente a causare 100% di morte delle cellule tumorali entro 1 settimana di esposizione, deve essere eseguita per ogni linea di cellule tumorali sperimentali, al fine di determinare efficace dose di uccisione. Questo è di fondamentale importanza per il mouse in vivo esperimenti TI, perché le cellule sono reiniettate retrò-orbitalmente (passo 6,1) e quindi eventuali cellule tumorali non danneggiate possono altrimenti formare tumori oculari nell’animale trattato. Come linea guida, 4 \ u20128 J/cm2 di uva, 100 \ u2012200 ng/ml 8-MOP, è la tipica gamma efficace per la maggior parte delle linee cellulari tumorali. Raccogli 8-MOPa-trattati cellule tumorali da ogni pozzo, vorticare la piastra e pipettare con attenzione per garantire il recupero completo delle cellule. 4. piatto TI passaggio delle cellule Per ogni gruppo di trattamento di 5 topi, combinare in un 1,5 mL di tubo conico 300 μL del PBMC appropriato (dal passaggio 2,11) e 300 μL di 8-MOP cellule tumorali trattatea(dal passo 3,9). Mescolare le cellule. Usare una siringa da 10 mL per riempire i set “ingresso” e “uscita” del tubo TI (vedereTabella dei materiali) con FBS. Aprire i morsetti del tubo per riempire i tubi e chiudere i morsetti una volta che i tubi vengono riempiti prima di scollegare la siringa, per mantenere la FBS all’interno del tubo. Utilizzare una pipetta P1000 per aggiungere le PBMC e il mix di cellule tumorali (dal passaggio 4,1) alla piastra TI (vedere la tabella dei materiali). Tenere la piastra a un angolo di 45° , posizionare la punta della pipetta saldamente nell’aspirazione della piastra ti e riempire lentamente la piastra, evitando le bolle. Rimuovere la punta della pipetta dall’aspirazione prima di rilasciare lo stantuffo della pipetta. La piastra contiene 450 μL; riportare le restanti celle al tubo conico 1,5 mL. Incubare il tubo riempito di FBS, la piastra TI riempita di cellule, e il 1,5 mL di tubetto conico contenente le restanti cellule nell’incubatore di coltura tissutale a 37 °C per 1 h. Dopo l’incubazione, svuotare il tubo TI per gravità, rilasciando i morsetti. Utilizzare una pipetta P1000 per rimuovere le celle dalla piastra TI inserendo la punta della pipetta con lo stantuffo depresso nella porta della piastra. Tenere la piastra a un angolo di 45° e riempire la punta della pipetta P1000. Riposiziona le celle nel loro tubo conico originale 1,5 mL. Per eseguire la piastra TI, collegare il tubo di uscita alla piastra e fissare la piastra TI nel sistema di corsa della piastra. Utilizzando una siringa da 1 mL, aspirare il 600 μL di PBMC e il mix di cellule tumorali dal tubo conico 1,5 mL, sbarazzarsi di eventuali bolle nella siringa, attaccare la siringa al tubo d’ingresso con la pinza aperta e riempire lentamente fino a quando il fluido raggiunge la fine del tubo. Fissare l’estremità libera del tubo d’ingresso alla piastra TI e continuare a caricare delicatamente il volume rimanente. Chiudere il morsetto di ingresso. Staccare la siringa da 1 mL e collegare il tubo di ingresso alla pompa della siringa. Fissare il tubo di uscita ad un pulito 1,5 mL tubi conici per la raccolta delle cellule. Regolare la portata della pompa della siringa a 0,09 mL/min, ma non avviare ancora la pompa. Inclinare la piastra TI ~ 30° verso il lato della pompa della siringa, utilizzando una piattaforma di corsa a piastre ti o qualsiasi altro mezzo (ad esempio, un piccolo oggetto piatto sotto un’estremità della piastra). Rilasciare con cautela il morsetto sul tubo di ingresso. Avviare la pompa della siringa, osservando attentamente come la piastra TI riempie, e Flick tubo o piastra come necessario se eventuali bolle d’aria impediscono il flusso. Una volta che la piastra TI è completamente riempita, inclinarla ~ 30° nella direzione opposta mentre si svuota. Quando tutte le cellule e il liquido sono nel tubo di raccolta conico 1,5 mL, arrestare la pompa. Per lavare la piastra TI, scollegare il tubo di ingresso dalla pompa della siringa, collegare a una siringa da 1 mL riempita con 600 μL di FBS e seguire la procedura per i passaggi 4.8 \ u 20124.9. Regolare la portata della pompa della siringa a 0,49 mL/min, rilasciare il morsetto di ingresso ed eseguire la piastra TI come descritto nei passaggi 4.12 \ u 20124.13, raccogliendo il lavaggio nello stesso tubo conico 1,5 mL. Flick o toccare la piastra ti delicatamente per tutto il tempo, per aiutare a distaccare e eluizione eventuali cellule aderenti. Girare la collezione 1,5 ml tubo conico nel microcentrifuga da banco a 250 x g per 8 min. gettare il surnatante. 5. preparazione del siero di topo autologo per la notte coltura media Raccogliere il sangue da 10 \ u201212 settimana vecchi topi topi C57BL/6J da qualsiasi metodo istituzionalmente approvato (ad esempio, sanguinamento degli occhi, sangue della vena di coda, sanguinamento delle guance, o spurgo del terminale da puntura cardiaca), senza anticoagulanti. Stimare la raccolta di 1 mL di sangue per ogni 300 μL di siero necessario.Nota: Si avrebbe bisogno di 300 μL di siero per ogni gruppo di trattamento di 5 topi nell’esperimento. Lasciar coagulare il sangue durante la notte a 4 ° c. Girare verso il basso il sangue coagulato a 3.000 x g per 15 min. accuratamente raccogliere il livello superiore contenente sieroNota: Il siero può essere utilizzato immediatamente per rendere il mezzo di incubazione delle cellule notturne (passo 6,1), o conservato per esperimenti futuri. Per preservare il siero, congelare le aliquote a-20 ° c. 6. co-incubazione notturna di PBMC con antigene Risospendere la PBMC e il pellet di cellule tumorali (fase 4,5) in 2 mL di RPMI trasparenti con il 15% di siero autologo (preparato al punto 5). Piastra in un piatto sterile trattato con coltura non tissutale di 35 mm e incubare durante la notte in condizioni di coltura tissutale standard (37 ° c, 5% CO2).Nota: Se PBMC viene utilizzato con un antigene non cellulare (peptide, nanoparticelle, proteine, ecc.), omettere la sezione 3 del protocollo e procedere dalla sezione 2 direttamente al paragrafo 4, aggiungendo l’antigene desiderato alla piastra TI-superato PBMC per la co-incubazione notturna qui in passo 6,1. Il giorno seguente, staccare con cautela le cellule aderenti dal fondo del piatto con un raschiatore di coltura tissutale, ruotando il piatto mentre raschiando per garantire anche la raccolta delle cellule. Raccogli le cellule in un tubo da 15 mL. Aggiungere 2 mL di PBS al piatto e ripetere la fase di raschiatura, raccogliendo le cellule nello stesso tubo. Sciacquare il piatto 35 mm con 1 mL di PBS e aggiungere il risciacquo allo stesso tubo. Spin per 10 min a 250 x g in una centrifuga di coltura tissutale standard per raccogliere le cellule. Estrarre accuratamente il supernatante e risospendere il pellet facendo scorrere il tubo. Non decant, poiché il pellet è morbido e può essere perso. 7. reiniezione di cellule trattate con TI in topi che portano il tumore Spin down plasma autologo (preparato al passo 2,4) a 750 x g per 15 min per sedimenti qualsiasi particolati. Risospendere il pellet cellulare (dal passaggio 6,4) in 600 μL di plasma autologo o PBS. Iniettare le cellule a 100 μL per mouse nel plesso retro-orbitale di anestetizzato opportunamente (ad es. 3 \ u20125% di gas inalante isoflurano, anestesia confermata dalla mancanza di riflesso della zampa posteriore) topi sperimentali che portano il tumore. Se lo si desidera, ri-iniettare topi di controllo del tumore cuscinetto con 100 μL di plasma autologo da solo, o PBS. Per i topi con tumore YUMM 1.7, ripetere il trattamento (punti 2 – 7.2) due volte alla settimana per 3 settimane, per un totale di 6 trattamenti. Raccogliere ed elaborare la PBMC da topi tumore-cuscinetto settimanale (sezioni protocollo 2 \ u20124) il lunedì e il giovedì, e ri-infuse dopo incubazione durante la notte (sezioni protocollo 5 \ u20127) il martedì e il venerdì.Nota: Questo regime di trattamento è stato sviluppato per la cinetica di crescita specifica dei tumori YUMM 1.7 nei topi. Potrebbe essere necessario essere titolati per altri sistemi tumorali con tassi di crescita tumorale più lenti o più veloci — rispettivamente aumentando o riducendo il numero di trattamenti. Monitorare il volume del tumore tramite misurazione bi-settimanale — preferibilmente al momento della somministrazione della terapia (martedì e venerdì) — di diametri e altezze del tumore perpendicolari utilizzando una pinza. Termina l’esperimento quando i volumi tumorali di controllo raggiungono la dimensione massima consentita dalle linee guida e dai protocolli istituzionali. 8. adattamento del protocollo per il trattamento di piccoli volumi di sangue umano Adattare il protocollo per l’uso con le cellule umane prima di isolare PBMC dal sangue umano. Usare l’eparina come anti-coagulante, con qualsiasi protocollo di isolamento PBMC preferito. Assicurarsi che la frazione PBMC isolata contenga un numero fisiologico di piastrine, per i migliori risultati di protocollo. Monitorare la conta piastrinica pre-e isolamento post-PBMC utilizzando qualsiasi contatore ematologico standard. Se si utilizza una fonte di antigene cellulare umano, trattare le cellule antigeniche umane seguendo i passaggi descritti nella sezione 3 per le cellule YUMM 1.7. Titrate 8-MOP e UVA dosi di conseguenza. Eseguire le fasi di passaggio del piatto descritte nel paragrafo 4, utilizzando fino a 3 x 107 PBMC per piastra ti. Coltura PBMC durante la notte con cellulare/altro antigene di scelta, come descritto nel paragrafo 6, ma sostituire 15% siero AB umano per il plasma di topo autologo per il mezzo di coltura overnight nel passaggio 6,1. Utilizzare le celle risultanti in qualsiasi saggio desiderato. Ad esempio, la co-coltura con cellule T reattive antigene per osservare le risposte delle cellule T specifiche dell’antigene avviate dalle cellule trattate con TI.

Representative Results

Recentemente abbiamo sviluppato un dispositivo ECP miniaturizzato da mouse a uomo, la piastra TI (Figura 1a), e progettato protocolli di trattamento corrispondenti. Il dispositivo e il protocollo riproducono le principali caratteristiche Cellulari e in vivo della ECP immunizzante, definita “transimmunizzazione”. Il protocollo di transimmunizzazione di murine Proof-of-principio11 (Figura 1B) consiste nel passaggio della placca extracorporea delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da topi affetti da tumore insieme ad apoptotico 8-MOPA– esposto cellule tumorali. In particolare, la camera TI è trasparente e dimensionata in modo da corrispondere al formato standard delle diapositive di microscopia, consentendo una facile visualizzazione delle interazioni delle cellule all’interno della piastra TI in qualsiasi punto del protocollo (video 1). Le cellule immunitarie attivate a piastre TI sono incubate durante la notte con le cellule del tumore apoptotico a-espostoa8 MOP, facilitando l’assorbimento delle cellule tumorali, la trasformazione e il trasferimento degli antigeni tumorali ai DCS. Il giorno seguente, la miscela di cellule co-incubate viene restituita nel flusso sanguigno dell’animale che porta il tumore. Gli animali di controllo subiscono identiche procedure di raccolta del sangue, per normalizzare per tutti gli effetti di linfodeplezione sulla crescita tumorale, ma invece ricevono ri-infusioni di PBS. La crescita tumorale in tutti gli animali è monitorata durante l’esperimento. Negli studi che hanno utilizzato il modello18di melanoma syngeneico di Yumm 1.7, il protocollo di transimmunizzazione è stato ripetuto due volte alla settimana per tre settimane, per un totale di sei trattamenti in ciascun animale (Figura 1B). La terapia è apparsa ben tollerata in tutti gli animali trattati (> 100), e ha costantemente mostrato la riduzione della crescita tumorale di YUMM 1.7 in animali trattati contro il controllo, come osservato in 9 esperimenti indipendenti condotti su 2 anni (Figura 2a, B). I risultati mostrano i dati cumulativi di crescita tumorale negli animali trattati con transimmunizzazione e controllo su tutti gli esperimenti eseguiti (Figura 2a), così come le curve di crescita tumorale rappresentativi per i singoli animali all’interno di un esperimento, per fornire un senso variabilità del sistema (Figura 2B). Abbiamo riscontrato che il successo del protocollo dipende in modo critico dalla presenza di monociti nella PBMC trattata, dalla presenza di piastrine nella frazione PBMC e dalla fase di passaggio della placca TI. Quando il passaggio della piastra viene omesso, o quando le piastrine o i monociti sono esaurite dalla frazione PBMC, l’effetto terapeutico non è più osservato (Figura 3A). Il trattamento richiede anche la presenza di cellule tumorali apoptotiche. È inefficace in assenza delle cellule immunitarie o di una fonte di antigene, o in presenza di antigene non corrispondente, ad esempio quando i topi che portano i tumori YUMM 1.7 sono trattati utilizzando cellule di carcinoma del colon MC38 (Figura 3B). Per un risultato immunizzante è anche fondamentale evitare l’esposizione di PBMC a 8-MOPa. 8-MOPa-exposed PBMC non solo abrogate, o possibilmente anche invertire, immunità anti-tumorale (Figura 3C), ma anche inibire il potenziale immunizzante delle cellule non esposte, come nell’esperimento in cui un numero uguale di 8-MOPa-esposto e 8-MOP A-protected PBMC sono stati utilizzati senza effetto osservabile anti-tumorale (Figura 3C). Con la PBMC umana, la camera TI e il protocollo di transimmunizzazione portano all’attivazione di monociti di successo in DC, indistinguibili dalla superficie cellulare e dai marcatori di attivazione intracellulare da quello ottenuto dalla piastra clinica ECP (tabella 1). Come negli studi del topo, l’attivazione del DC (Figura 4a) e la capacità dei DCS generati dalla transimmunizzazione di elaborare e presentare l’antigene (Figura 4B,C) criticamente dipendono dalla presenza di piastrine nella PBMC e dal passaggio della placca ti. Il DCs umano attivato dalla Transimmunizzazione può efficacemente elaborare e cross-presentare sia gli antigeni peptidici (Figura 4B), sia gli antigeni da intere cellule tumorali umane a-espostea8 MOP, per attivare le linee cellulari T specifiche dell’antigene umano in vitro saggi (Figura 4c), in modo ti e dipendente dalla piastrina (Figura 4B, C). Figura 1: camera di Transimmunizzazione (ti) e schemi di protocollo. A) diagramma e specifiche della camera di trattamento della transimmunizzazione (piastra ti). B) descrizione schematica del flusso di lavoro sperimentale del trattamento di transimmunizzazione. Brevemente, gli animali vengono inoculati per via sottocutanea (s.c.) con cellule tumorali singeniche; gli animali con tumori palpabili sono trattati due volte alla settimana mediante prelievo di sangue, isolamento di PBMC dal sangue, passaggio del flusso PBMC attraverso la placca autologa rivestita con piastrine in presenza di cellule tumorali trattate con 8 MOP/UVA, PBMC e co-incubazione di cellule tumorali durante la notte, e reiniezione delle cellule per via endovenosa negli stessi animali tumorali. Il volume del tumore è misurato in tutto l’esperimento. Questa cifra è stata modificata da11. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra. Figura 2: transimmunizzazione controlla la crescita di Yumm 1.7 melanoma tumori singenici. (A) Yumm 1.7 volume del tumore nel tempo tracciato per topi C57BL/6 topi inoculati con 1 x 105 Yumm 1.7 cellule tumorali, e ricevendo sia sei trattamenti di transimmunizzazione (linea nera), o sei trattamenti di controllo (linea grigia). I dati sono cumulativi su nove esperimenti indipendenti condotti su due anni. (B) dati provenienti da un singolo esperimento di transimmunizaton rappresentante Yumm 1.7, con ogni linea che mostra la crescita tumorale per un singolo topo. (A e B) I topi “controllo PBS” in tutti gli esperimenti sono stati dissanguati nello stesso programma degli animali sperimentali, ma hanno ricevuto sei ri-infusioni sterili di PBS. Le barre di errore rappresentano SEM, i valori p calcolati per ogni punto temporale utilizzando il test di confronto multiplo di sidak; * *, p = 0,0013; , p < 0,0001. Questa cifra è stata modificata da11. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra. Figura 3: la Transimmunizzazione richiede monociti e piastrine in piastra TI-superato frazione PBMC, così come 8-MOPun trattamento di cellule tumorali corrispondenti antigene e 8-MOPun risparmiante di PBMC. (A) Yumm 1.7 volume del tumore nel tempo tracciato per topi C57BL/6 topi inoculati con 1 * 105 Yumm 1.7 cellule tumorali, e ricevendo sia sei trattamenti di transimmunizzazione (linee nere solide), sei trattamenti di controllo (linee grigie solide), o sei trattamenti ti in cui i monociti o le piastrine erano esaurite da PBMC prima della fase di passaggio della piastra (utilizzando rispettivamente i kit di deplezione a-CD11b e a-CD41), o il passaggio della piastra è stato omesso (linee tratteggiate). (B) volume del tumore nel tempo tracciato per topi C57BL/6 topi inoculati con 1 x 105 Yumm 1.7 cellule tumorali, e ricevendo sia sei trattamenti di transimmunizzazione (linee nere solide), sei trattamenti di controllo (linee grigie solide), PBMC da solo (linea tratteggiata), 8- MOPa-trattata Yumm 1.7 cellule da solo, o ti utilizzando 8-MOPa-trattati MC38 cellule tumorali (linee tratteggiate). (C) volume del tumore nel tempo tracciato per topi C57BL/6 topi inoculati con 1 x 105 Yumm 1.7 cellule tumorali, e ricevendo sia sei trattamenti di transimmunizzazione (linee nere solide), sei trattamenti di controllo (linee grigie solide), sei trattamenti ti dove PBMC sono stati esposti uniformemente a 8-MOPa immediatamente prima del passaggio della piastra, sei trattamenti ti dove PBMC sono stati uniformemente esposti a 8-MOP a immediatamente dopoil passaggio della piastra, o sei trattamenti in cui le cellule ti dopo passaggio piastra sono state miste 1:1 con un numero uguale di PBMC che sono stati uniformemente esposti a 8-MOPa irradiazione (linee tratteggiate). (A, B e C) I topi “controllo PBS” in tutti gli esperimenti sono stati dissanguati nello stesso programma degli animali sperimentali, ma hanno ricevuto sei ri-infusioni sterili di PBS. I dati sono forniti per esperimenti rappresentativi. Le barre rappresentano SEM, i valori P calcolati per ogni punto temporale utilizzando il test di confronto multiplo di sidak; *, p < 0,05; * *, p < 0,01; , p < 0,001; , p < 0,0001; NS = differenze non significative. Questa cifra è stata modificata da11. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra. Figura 4: il protocollo TI con la camera TI induce rapidamente la maturazione DC, il profilo di attivazione unico e la capacità di attivazione delle cellule T nella PBMC umana, a seconda del passaggio della placca e delle piastrine.A. FACS analisi dei marcatori indicati in CD11c+ cellule tra PBMC umana appena isolata (“controllo”), PBMC trattati con il protocollo ti (“ti”), o PBMC trattate con ti dove è stato omesso il passaggio della piastra, le piastrine sono state esaurite utilizzando il a-CD41 Kit di perline prima del passaggio della piastra, o entrambi i suddetti sono stati eseguiti. I dati riassumono sei esperimenti indipendenti con tre donatori di sangue. Le barre rappresentano valori medi, mentre le barre di errore rappresentano SEM. P-Values per ogni confronto calcolato utilizzando il t-test accoppiato; *, p < 0,05; * *, p < 0,01. I pannelli sono stati modificati da11. B. le PBMC umane trattate con piastrine o con impoverito di piastrine sono state co-incubate durante la notte con un peptide irrilevante (SIINFEKL) o con peptide lungo per la proteina HPV E7 associata al carcinoma a cellule squamose a testa e collo. Le PBMC sono state quindi utilizzate per stimolare una linea di cellule T CD8 umana specificamente reattiva al peptide E7. La stimolazione delle cellule T è stata misurata dalla produzione di IFNg dopo 5 giorni di coltura. (C) le PBMC umane trattate con piastrine o con impoverito di piastrine sono state co-incubate durante la notte con la linea di cellule squamose a testa e collo A 8-MOP A, con carcinomaAcellule petti, SCC61, esprimendo (SCC61 HPV E6/7) o non esprimendo (SCC61 no HPV ) le proteine antigeniche HPV E6 e E719. Le PBMC sono state quindi utilizzate per stimolare una linea di cellule T CD8 umana specificamente reattiva al peptide E7. La stimolazione delle cellule T è stata misurata dalla produzione di IFNg dopo 5 giorni di coltura. (B e C) I dati mostrano esperimenti rappresentativi con tre repliche in ognuna. Le barre rappresentano valori medi, mentre le barre di errore rappresentano SEM. P-valori per ogni confronto calcolati utilizzando il test di paragoni multipli di sidak; , p < 0,001; , p < 0,0001. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra. pennarello parametro non trattati Piastra ECP con protocollo TI Piastra TI con protocollo TI valore di p ECP vs TI HLA-DR Δ MFI 100,1 ± 42,4 439,8 ± 152,5 417,7 ± 152,2 Ns CD80 Δ 3,9 ± 1,1 22,3 ± 7,2 24,5 ± 7,2 Ns CD83 Δ MFI 0,3 ± 0,2 53,3 ± 9,7 51,4 ± 17,4 Ns CD86 Δ MFI 10,8 ± 1,7 103,9 ± 23,4 87,1 ± 17,6 Ns PLAUR Δ MFI 54,5 ± 12 721,4 ± 183,6 528,7 ± 135,5 Ns ICAM1 Δ MFI 12,2 ± 1,6 179,6 ± 28,5 192,5 ± 25,4 Ns ITGB5 Δ MFI 53,6 ± 25,7 97,1 ± 31,6 103,8 ± 32,8 Ns CCL2 (MCP-1) Δ 0,6 ± 0,5 70,1 ± 6,7 55,2 ± 8,9 Ns CXCL5 Δ 0,7 ± 0,4 39,1 ± 7,2 41,5 ± 4,7 Ns CXCL16 Δ 0,3 ± 0,2 28,0 ± 8,8 35,3 ± 11,7 Ns CD105 (endoglina) Δ MFI 3,6 ± 0,3 124,3 ± 25,4 141,8 ± 33,2 Ns CD112 (nettina 2) Δ MFI 10,9 ± 1,8 47,3 ± 5,2 50,9 ± 9,2 Ns CD120a (TNFR-1) Δ MFI 10,1 ± 2,6 2,2 ± 1,4 1,8 ± 1,1 Ns CD137L (4-1BBL) Δ MFI 2,9 ± 1,5 1,0 ± 0,4 1,2 ± 0,6 Ns Tabella 1: il protocollo ti con la camera ti induce rapidamente la maturazione del DC equivalente a quella indotta dal protocollo ti con la camera ECP clinica. Analisi FACS del cambiamento dei marcatori indicati dai corrispondenti controlli IgG in cellule CD11c + umane vive tra le PBMC appena isolate (“non trattate”), PBMC passate attraverso la placca ECP clinica seguendo il protocollo TI (“piastra ECP con protocollo TI”) e analizzati dopo incubazione notturna, o PBMC trattati con il protocollo TI (“piastra TI con protocollo”) e analizzati dopo l’incubazione notturna. Per i marcatori, come HLA-DR, dove l’intera popolazione cellulare è stata alterata, i dati sono espressi come variazione dell’intensità media della fluorescenza (MFI). Per i marcatori in cui solo un sottoinsieme di celle esprime il marcatore, ad esempio CCL2, viene invece rappresentata la differenza in percentuale delle celle positive di marker di CD11c Live + PBMC. I dati riassumono sei esperimenti indipendenti con tre donatori di sangue. I dati relativi a ciascun marcatore sono espressi in base a un errore standard della media (SEM). P-valori per ogni confronto calcolati utilizzando il test accoppiato t; NS = differenze non significative. La tabella è stata modificata a partire da11. Video 1: imaging cellulare in tempo reale delle interazioni piastrinica e delle cellule immunitarie all’interno della piastra TI.Le PBMC sono state preparate come descritto nella sezione 2 precedente del protocollo ed esposte alla piastra di transimmunizzazione come descritto nel paragrafo 4, ad eccezione del periodo di incubazione statico nel punto 4.2.3, ridotto da 1 h a 30 min. Durante il protocollo TI, la piastra TI, identica per dimensioni ad un vetrino per microscopio standard, è stata montata nella fase di mantenimento delle diapositive di un sistema di imaging a fluorescenza e le celle al suo interno sono state iminvecchiate a un ingrandimento di 40 volte e a 37 ° c durante il riempimento della piastra (4.2.2 ), incubazione a piastre (4.2.3) e portate a piastre (4.3.5). Sono state acquisite immagini continue e filmati prodotti utilizzando il software “Automated Scanning routine”. Le didascalie sotto il video indicano la fase del protocollo in cui le celle vengono girate. Le frecce e i cerchi nel video, con le didascalie associate, indicano le celle e le aree di interesse. La barra della scala da 10 μM è presente nell’angolo in basso a destra in tutto il video. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricarlo).

Discussion

Il dispositivo e il protocollo miniaturizzati sopra descritti per la prima volta consentono un’efficiente indagine di laboratorio sui meccanismi di ECP nei sistemi sperimentali del topo e nei piccoli campioni di sangue umano. Questo è un grande progresso; per esempio, ci ha permesso di dimostrare per la prima volta l’efficacia della transimmunizzazione contro i tumori solidi in un modello di topo 11, aprendo la futura possibilità di un’applicazione simile in oncologia umana.

Prima dello sviluppo del dispositivo di transimmunizzazione e del metodo descritto qui, era impossibile indagare appieno tutti gli aspetti della ECP. Nei modelli murini, anche se il 8-MOPun aspetto della terapia potrebbe essere replicato in qualche modo trattando le cellule in una capsula di Petri12,20, non c’era capacità di integrare nel metodo il passaggio della piastra, che è stato indicato per forniscono interazioni piastriniche dinamiche che sono di importanza critica per l’attivazione fisiologica del DC14di ECP. In studi umani, in alternativa, il componente di flusso era completamente presente, ma la capacità di esporre selettivamente componenti cellulari specifici a8-MOP a, o per proteggerli da esso, mancava21,22. Ciò ha impedito la piena comprensione del meccanismo ECP e la sua ottimizzazione per l’immunità o la tolleranza. Inoltre, la quantità di sangue necessaria per lavorare con l’apparato ECP clinico è grande, ostacolando l’inchiesta scientifica. Il dispositivo ECP miniaturizzato e il protocollo qui descritti per la prima volta consentono una modellazione ECP di laboratorio efficiente, completamente flessibile e sintonizzabile. Inoltre, la piastra TI consente la visualizzazione in tempo reale e il monitoraggio delle interazioni cellulari all’interno della piastra mediante microscopia.

Per il successo del protocollo utilizzando sia sistemi in vivo che ex vivo, è fondamentale che le PBMC trattate contengano monociti che possono essere attivati in DCs funzionali. Affinché questa attivazione proceda, è anche necessario garantire che la frazione PBMC contenga un numero fisiologico di piastrine sane e attivabili e che il protocollo di passaggio della piastra TI sia seguito da vicino. Per indirizzare i nuovi DC attivati verso una reattività specifica, devono essere dotati di antigene. Abbiamo scoperto che il metodo più efficace per la somministrazione di antigene per l’immunità anti-cancro è la co-incubazione notturna dei nuovi DCs con cellule tumoraliA esposizione A8 MOP a-exposed contenenti antigene. Questo ha il vantaggio aggiunto di essere in grado di creare una risposta immunogenica anti-cancro senza necessità di conoscenza preventiva degli antigeni tumorali, permettendo ai DCs di selezionarli. Tuttavia, nei casi in cui l’antigene è noto, abbiamo avuto un certo successo nei sistemi ex vivo quando si utilizzano peptidi liberi come antigeni in co-incubazione. Per le applicazioni immunogeniche, i controller di dominio devono essere protetti da 8-MOPA esposizione. Infine, negli esperimenti in vivo, è importante lavorare con un modello animale che è in grado di immunità anti-tumorale. La transimmunizzazione funziona creando DCs attivati, specifici dell’antigene, che lavorano nel corpo per avviare risposte immunitarie innate e adattive. L’attività alterata o la mancanza di cellule NK, CD4 o CD8 nel topo trattato influirà sull’efficacia del protocollo5,11.

Mentre il protocollo qui descritto è un proof-of-principio uno che è stato ottimizzato per un modello di tumore singenici solido del mouse, tuttavia rivela molte opportunità. I meccanismi di ECP in oncologia sono solo essere chiariti, e c’è ancora molto spazio per una migliore comprensione. Più in generale, la capacità di generare mouse e DCs umani fisiologicamente attivati e di indirizzarli selettivamente verso l’immunità specifica dell’antigene ha molte potenziali applicazioni al di là del cancro. La capacità di fare lo stesso, ma invece dirigere i DCs verso la tolleranza antigene-specifico, come è suggerito dall’efficacia tollerante di ECP stessa, ha anche implicazioni mediche di ampio respiro. Con questo metodo, speriamo di fornire gli strumenti e aprire un viale produttivo di ricerca per chiunque abbia un interesse per le terapie fisiologiche DC.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da NIH-NCI spore Grant 1 P50 CA121974 (R. Edelson, M. Girardi); NIH Cancer centro sostegno sovvenzione 3 P30 CA16359-28S1 (R. Edelson, M. Girardi); la borsa di addestramento dell’Istituto medico Howard Hughes (A. Vassall); e la NY Fondazione cardiaca (R. Edelson, A. Ventura, A. Vassall, H. Ezaldein). Il supporto parziale è stato fornito da R01 CA196660-01 a M. Bosenberg.

Gli autori sono grati al dottor Robert Tigelaar per il suo mentoring, la sua guida e la sua intuizione sperimentale. Ringraziamo i colleghi del Fraunhofer IBMT, in particolare il dottor Thorsten Knoll, per aver sviluppato e fornito la camera TI equivalente ECP. Nicholas THEODOSAKIS ha gentilmente aiutato con le fasi iniziali degli esperimenti YUMM. Ringraziamo i nostri donatori di sangue volontari, Inger Christensen e il suo personale professionale presso il centro di trattamento ECP di Yale per aiutare con l’approvvigionamento di sangue volontario. La dottoressa Wendell Yarbrough e la Dott. ssa Natalia Issaeva hanno gentilmente condiviso con noi le linee cellulari SCC61 e SCC61-E6/7. Per l’assistenza tecnica sul progetto, ringraziamo Dr. Julia Lewis per il Consiglio del protocollo FACS, e e. Menet, G. Tokmoulina, C. Cote presso Yale FACS core. Immagini di film di cellule all’interno della piastra TI sono stati acquisiti con l’assistenza di Felix Rivera-Molina, PhD, Dept di biologia cellulare e Yale CINEMA Imaging Center, Yale School of Medicine. La produzione cinematografica è stata supervisionata da Andrew Osborne, Senior video Producer, ufficio delle comunicazioni, Yale School of Medicine.

Materials

8-MOP (UVADEX 20ug/mL, 10 mL) Therakos, Inc Rx only, NDC No. 64067-0216-01 Protocol steps 3 and 8 – mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells
AB serum Lonza BioWhittaker 14-498E Protocol step 8.5 – overnight culture of human PBMC
ACK red cell lysis buffer Lonza BioWhittaker 10-548E Protocol step 2 – mouse PBMC preparation
Anesthesia Tabletop V1 system with active scavenging VetEquip 901820 Protocol steps 1 and 7 – mouse sc tumor introduction and TI administration
Autologous mouse plasma prepare in lab n/a Prepare per protocol step 2.4, use in  7.1 – mouse TI treatment administration
Autologous mouse serum prepare in lab n/a Prepare per protocol step 5, use in step 6.1 – overnight culture of mouse PBMC
C57Bl/6J mice Jackson labs 0000664 Protocol steps 1, 2, 5 and 7 – mouse tumor injection, blood/serum collection, and therapy return
Cheek bleed GoldenRod lancet, 5 um Medipoint 9891620 Protocol step 2 – mouse PBMC preparation
Clear RPMI Gibco by LifeTech 11835-030 Protocol steps 6 and 8 – overnight culture of mouse/human PBMC
DMEM/F12 Gibco by LifeTech 11330-032 Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture
EasyGrip Petri Dishes, 35mm Falcon 351008 Protocol steps 5 and 8 – overnight culture of mouse/human PBMC
Eppendorf 1.5mL conical tubes DOT scientific 1700-GMT Protocol steps 1-8
FBS (fetal bovine serum, heat-inactivated) SAFC Biosciences 12306C-500mL Protocol steps 1-4 – YUMM1.7 cell culture, 8-MOP/UVA treatment of cells, TI plate
Hemavet 950FS hematology counter Drew Scientific HV950FS Protocol step 8.2 – monitoring human platelet numbers
Heparin 5,000U/mL McKesson Packaging services 949512 Protocol steps 2 and 8 – mouse and human PBMC preparation
Isoflurane Abbott Laboratories 5260-04-05 Protocol steps 1 and 7 – mouse sc tumor introduction and TI administration
Lympholyte M lymphocyte isolation medium Cedarlane Labs CL5035 Protocol step 2 – mouse PBMC preparation
Non-essential amino acids Gibco by LifeTech 11140-050 Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture
PBS (1x DPBS, (-) Ca+2, (-) Mg+2) Gibco by LifeTech 14190-144 Protocol steps 1-7
Pen/strep Gibco by LifeTech 15140-122 Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture
Polypropylene 15mL conical tubes Falcon 352097 Protocol steps 1-8
Programmable 2-channel syringe pump New Era Pump Systems Inc model NE-4000 Protocol steps 4 and 8 – running the TI plate
Retro-orbital injection needles, 27G x 1/2 BD Biosciences 305109 Protocol step 7 – mouse TI treatment administration
Syringes, 10mL (LUER-LokTip) BD Biosciences 309604 Protocol steps 4, 8 – running the TI plate
Syringes, 1mL (Slip tip) BD Biosciences 309659 Protocol steps 1, 4, 7, 8
TI plate and tubing set Transimmune AG not commercially available  Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.
TI plate running platform Transimmune AG not commercially available  Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.
Tissue culture flasks, T75 (75 cm2) Falcon 353136 Protocol steps 1, 2, 6 and 8 – mouse and human cell culture
Tissue culture plates, 12-well Falcon 353043 Protocol steps 3 and 8 – mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells
Tissue culture scrapers Falcon 353085 Protocol steps 6 and 8 – overnight culture of mouse/human PBMC
Trypsin-EDTA 0.25% (1x) Gibco by LifeTech 25200-056 Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture
Tumor injection needles, 25G x 5/8 BD Biosciences 305122 Protocol step 1 – mouse subcutaneous tumor introduction
UVA irradiator Johnson and Johnson not commercially available  The apparatus was specifically developed by J&J for Prof. R. Edelson's laboratory. Several machines are available in the laboratory on a collaborative basis; please contact Prof. R. Edelson for use of one. Alternative UVA irradiators are commercially available but have not been tested by us.
Invitrogen EVOS FL Auto 2 Imaging System Invitrogen fluorescence imaging instrument
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Referências

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Ventura, A., Vassall, A., Yurter, A., Robinson, E., Filler, R., Hanlon, D., Meeth, K., Ezaldein, H., Girardi, M., Sobolev, O., Bosenberg, M. W., Edelson, R. L. Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (147), e59370, doi:10.3791/59370 (2019).
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