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Imunologia e Infecção

Nouveau protocole pour la génération de cellules dendritiques immunogéniques physiologiques

Published: May 17, 2019
doi:
10.3791/59370
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1Department of Dermatology,Yale University School of Medicine, 2Dermatology Department,University of Rome Tor Vergata, 3Department of Pathology,Yale University School of Medicine

Summary

Le dispositif de transimmunization (TI) ou la plaque et les protocoles connexes ont été élaborés pour reproduire les principales caractéristiques de la photochimiothérapie extracorporeuse (ECP), dans un contexte expérimental, permettant la production de cellules dendritiques activables physiologiquement activées et réglables cellules (DCs) pour l’immunothérapie du cancer.

Abstract

La photochimiothérapie extracorpovraie (ECP) est une immunothérapie du cancer largement utilisée pour le lymphome T cutané (CTCL), opérant dans plus de 350 centres universitaires dans le monde entier. Alors que l’efficacité clinique et le profil de sécurité exemplaire de l’ECP ont entraîné son utilisation généralisée, l’élucidation des mécanismes sous-jacents est resté un défi, en partie en raison de l’absence d’un modèle de laboratoire ECP. Pour surmonter cet obstacle et créer une plate-forme simple et conviviale pour la recherche ECP, nous avons développé une version réduite du dispositif de traitement des leucocytes de l’ECP clinique, adapté pour le travail avec les deux modèles de souris, et les petits échantillons de sang humain. Ce dispositif est appelé la chambre de Transimmunization (TI), ou la plaque. Dans une série d’expériences marquantes, le dispositif miniaturisé a été utilisé pour produire un vaccin cellulaire qui a régulièrement initié l’immunité thérapeutique anticancéreuse dans plusieurs modèles de tumeurs syngéniques de souris. En supprimant les facteurs individuels du système expérimental et en vérifiant leur contribution à la réponse anti-tumorale in vivo , nous avons ensuite élucidé les principaux moteurs mécanistes du potentiel immunisant des ECP. Collectivement, nos résultats ont révélé que les effets anti-tumoraux de l’ECP sont initiés par les cellules dendritiques (DC), générées physiologiquement par l’interaction des monocytes sanguins avec les plaquettes dans la plaque TI, et chargées avec des antigènes de cellules tumorales dont la cellule apoptotique la mort est finement titrés par exposition à l’agent de réticulation de l’ADN photoactivable 8-méthoxypsoralen et la lumière UVA (8-MOPA). Lorsqu’il est retourné à la souris, ce vaccin cellulaire conduit à une immunité spécifique et transférable de cellules T anti-tumorales. Nous avons vérifié que la chambre TI est également appropriée pour le traitement du sang humain, produisant des DCs humains entièrement comparables dans l’état d’activation et le profil à ceux dérivés de la chambre clinique ECP. Les protocoles présentés ici sont destinés à des études d’ECP chez la souris et l’homme, la génération contrôlée de cellules tumorales apoptotiques avec 8-MOPA, et la production rapide de DCS humains et de souris dérivées de monocyte pour une variété d’applications.

Introduction

La photochimiothérapie extracorpovraie (ECP) est une immunothérapie établie qui est largement opérante dans les centres universitaires dans le monde entier. Son utilisation a été tirée par la sélectivité unique, la sécurité, et l’efficacité bidirectionnelle de la thérapie ECP, traits que ECP partage avec le système immunitaire physiologique lui-même avec lequel il semble partenaire. ECP est immunisé sélectivement contre les cellules malignes dans le lymphome T cutané (CTCL)1,2, et tolérant sélectivement pour les antigènes ciblés dans la transplantation, l’autoimmunité, et les paramètres de la maladie du greffon contre l’hôte (GVHD) 3 les trois , 4. l’immunogénicité de l’ECP est soulignée par sa dépendance à l’encontre d’un compartiment intact de cellules T de la CTCL5, tandis que la spécificité est reflétée par le profil de réaction indésirable très favorable de l’ECP, sans suppression immunitaire hors cible dans la transplantation ou Les paramètres de GvHD, et aucune susceptibilité d’infection opportuniste accrue dans CTCL, où les clones de cellules T non-pathogènes pourraient être perdus avec les cellules T malignes.

Compte tenu de l’importance clinique de l’ECP, l’espoir qu’une meilleure compréhension de ses mécanismes pourrait élargir la portée thérapeutique de l’ECP à un éventail plus large de cancers et de troubles immunologiques a stimulé l’intérêt international. Deux ateliers sanctionnés à l’échelle nationale, un symposium sur l’état de la science6 de l’Institut national de la santé (NIH) et une conférence de consensus de la société américaine pour l’aphérèse7ont été menés et signalés, dans le but d’accélérer le l’identification des principaux contributeurs cellulaires aux effets anti-cancer et tolérogènes de l’ECP.

À ce jour, malgré de nombreux rapports publiés tentant de s’attaquer au mécanisme de l’ECP, deux obstacles majeurs ont entravé les progrès scientifiques. Premièrement, l’étude des mécanismes de l’ECP dans le cadre du laboratoire expérimental a été limitée par l’absence de dispositif ECP miniature qui reflétait pleinement les effets cellulaires et in vivo de l’ECP et s’appliquait aux modèles animaux. Deuxièmement, l’analyse en laboratoire approfondie des échantillons d’ECP dans le milieu clinique a été restreinte par la disponibilité limitée des cellules immunitaires traitées par ECP, qui nécessitent l’accès aux centres de traitement, et sont en outre soumises au calendrier de la les infusions du patient, et le besoin éthique d’ensembles sans compromis de leucocytes réinjectée par le patient.

Pour résoudre les obstacles entravant les progrès de la recherche sur les ECP, nous avons mis au point un appareil miniature ECP qui imiterait le plus fidèlement les éléments clés de la thérapie. Le traitement standard de l’ECP implique le passage des leucocytes enrichis par la leukaphérèse d’un patient par une plaque de plastique transparente de 1 mm d’épaisseur, une lumière ultraviolette (UVA),6,8. Dans la plaque, les leucocytes sont exposés au 8-méthoxypsoralen (8-MOP), un agent photoactivable qui, à l’exposition aux UVA, est converti de façon transitoire en une forme réactive (8-MOPa), capable de relier l’ADN via sa liaison bivalente à des bases de pyrimidine sur soeur ADN brins9,10. Les leucocytes traités à8 MOP ont été collectés et retournés par voie intraveineuse au patient.

Puisque l’ECP lui-même est une thérapie bidirectionnelle, immunisant dans le cancer et tolérant dans les paramètres de transplantation, d’auto-immunité et de GvHD, pour des éclaircissements nous avons nommé le mode de vaccination du modèle ECP «transimmunization», et le mode tolérogénique «transtolerization». Nous nous sommes d’abord concentrés sur la modalité de transimmunization. Notre dispositif d’ECP de souris à homme évolutif miniaturisé récemment rapporté, la chambre ou la plaque de transimmunization (TI), et le protocole correspondant, reproduisent à la fois les effets cellulaires et in vivo du dispositif ECP humain dans un milieu cancéreux11.

Afin de rendre le modèle de transimmunization in vivo aussi cliniquement pertinent que possible, nous avons initié l’immunothérapie après que les tumeurs syngéniques de souris synthétisées par voie sous-cutanée se sont devenues palpables, testant ainsi l’efficacité du protocole dans le cancer établi. De même que dans la CTCL, le protocole de transimmunization de la preuve de principe dans le modèle YUMM 1.7 du mélanome utilise des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) provenant d’animaux porteurs de tumeurs. Les cellules sont transmises par la plaque de TI sous le flux. Alors que le 8-MOPun traitement des cellules dans la chambre miniature est possible, il est préférable de le conduire séparément, pour s’assurer que seul le type de cellule désiré est exposé à 8-MOPa. Des études antérieures indiquent que l’effet tolérogène de l’ECP est médié par des cellules de 8-MOPa-présentant des antigènes blessés12, alors que l’effet immunisant nécessiteune lésion de 8-MOP de cellules tumorales cibles11. Dans le protocole de transimmunization, soit les cellules tumorales, soit les cellules immunitaires, peuvent être exposées sélectivement à 8-MOPA au besoin. Étant donné que la maximisation du temps de contact entre les cellules tumorales de 8-MOPa-blessées et les cellules dendritiques induites par l’ECP (DC) a été montrée pour améliorer significativement la capacité immunothérapeutique du PCE13clinique, nous avons incorporé une nuit étape de co-incubation dans notre protocole. Après une incubation de nuit, les cellules traitées sont retournées à l’animal porteur de tumeurs.

Ce système a réduit de façon fiable la croissance tumorale et a initié une immunité anti-tumorale spécifique chez les souris avec des tumeurs syngéniques établies11, et nous a permis de disséquer le mécanisme de l’efficacité clinique anti-tumorale de l’ECP. Dans plusieurs études, nous avons démontré que l’immunité aux ECP est initiée par l’activation plaquettaire ex vivo dans la plaque de TI14,15. Les plaquettes activées signalent ensuite la maturation des cellules monocytes-dendritiques14, conduisant à la production de DCS physiologiques. Les nouveaux DCs dérivés des monocytes sont capables de croiser les antigènes internalisés des cellules tumorales endommagées par le 8-MOP pour activer les réponses des lymphocytes T spécifiques àl’antigène16. Comme on l’a suggéré précédemment12,17, cependant, 8-MOPA-induit des dommages de la DCS naissante eux-mêmes peuvent contre-agir ou même inverser l’effet anti-tumoral11, fournissant un lien mécaniste à la tolérance de l’ECP.

La plaque TI a également été utilisée pour produire des DCs activés physiologiquement à partir de PBMC humain. De même que pour les études sur la souris, les DCs dérivées de TI humaines dépendent du passage de plaques en présence de plaquettes pour leur génération, apparaissent phénotypiquement identiques à celles produites dans la plaque clinique ECP, et sont capables de traiter efficacement et antigènes tumoraux humains croisés pour l’activation des lymphocytes T humains11,16.

En découvrant le mécanisme de l’immunothérapie ECP, nous avons donc découvert une méthode pour générer rapidement la souris physiologique et les cellules dendritiques humaines de la spécificité de l’antigène désiré, qui peuvent être modulées de façon fonctionnelle. Le dispositif et le protocole TI innovants ont une importance potentielle substantielle dans les domaines de la recherche et de la thérapie et de l’immunothérapie du cancer de l’ECP plus largement, et dans tout autre domaine présentant un intérêt pour les cellules dendritiques physiologiques et fonctionnelles, soit dans la vaccination, soit dans la modalité tolérante. Nous espérons que cette publication fournira les outils nécessaires à ceux qui s’intéressent à ces domaines de recherche.

Protocol

Toutes les méthodes de la souris décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Yale, en accord avec les instituts nationaux des directives sur la santé animale. Toutes les études humaines ont été effectuées avec du sang donné par des volontaires sains, avec un consentement éclairé écrit. Des études sur le sang humain ont été menées conformément aux directives éthiques reconnues (p. ex. Déclaration d’Helsinki, CIOMS, rapport Belmont, règle commune des États-Unis) et ont été approuvées par la Yale Human Investigational Review Board sous le numéro de protocole 0301023636. Remarque: Ce qui suit est le protocole décrivant la transimmunization pour la thérapie anti-tumorale des tumeurs syngéniques de souris. 1. implantation tumorale syngeneique YUMM 1.7 Suivez les protocoles établis pour implanter des tumeurs syngéniques dans les flancs des souris, selon les cas, selon la ligne d’intérêt de la cellule tumorale.Remarque: Le protocole ci-dessous décrit le modèle de tumeur de mélanome de souris de YUMM 1.7 C57BL/6. Les cellules de mélanome de YUMM 1.7 ont été aimablement fournies par le Dr. Bosenberg, Yale18. Décongeler une aliquote gelée de cellules et utiliser des cellules après un passage de cellule. Culture fraîchement décongelé des cellules YUMM 1.7 dans le mélange nutritif d’Eagle de Dulbecco, le milieu F-12 (DMEM/F12), complété par 10% de sérum bovin fœtal inactivé à la chaleur (FBS), 1% de pénicilline/streptomycine et 1% d’acides aminés non essentiels, selon la norme les conditions de culture tissulaire (37 ° c, 5% CO2). Collectez des cellules de YUMM 1.7 à 60 \ u201270% de confluence en ajoutant assez de trypsine-EDTA pour recouvrir le fond de la plaque ou du flacon de culture cellulaire (par exemple, 4 mL pour une fiole T75). Reposez les vaisseaux de culture cellulaire à température ambiante pendant 3 \ u20124 min, en tapotant doucement sur le fond ou les côtés du récipient occasionnellement pour aider à détacher les cellules. Ajouter 1 mL de sérum bovin fœtal (FBS) par 4 mL d’acide trypsine-éthylenediaminetétraacétique (EDTA) pour arrêter la réaction une fois que la plupart des cellules sont détachées. Recueillir les cellules en pipetant dans un tube conique de 15 mL. Rincez le flacon avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et ajoutez le rinçage au même tube de prélèvement. Remplissez le tube à 15 mL avec PBS. Sortez une petite aliquote et comptez les cellules. Tourner vers le bas pendant 10 min à 250 x g dans une centrifugeuse de culture de tissus standard pour collecter les cellules tumorales. Resuspendre les cellules YUMM 1.7 en PBS à une densité de 1 x 106 cellules/ml. Injecter 1 x 105 Yumm 1.7 cellules tumorales par voie sous-cutanée dans 100 ΜL de PBS dans les flancs droits du receveur 4 à 6 semaines de type sauvage mâle C57BL/6J souris, anesthésiés selon les directives institutionnelles (par exemple, 3 \ u20125% de gaz inhalant isoflurane, anesthésie confirmée par l’absence de réflexe de pincement de patte postérieure). Surveillez le volume des tumeurs par des mesures bimensuelles de diamètres et de hauteurs de tumeurs perpendiculaires à l’aide d’un étrier. Calculer YUMM 1.7 (volume de tumeur comme longueur de tumeur x largeur x hauteur)/2. Initier le traitement de la transimmunization lorsque les tumeurs deviennent simplement palpable; pour les tumeurs YUMM 1.7, c’est généralement jour 7 \ u201210 post implantation tumorale. 2. collecte de cellules Mononucléelles de sang périphérique pour la Transimmunization Recueillir 100 \ u2012150 μL de sang de chaque tumeur-portant la souris par le saignement de la joue. Au fur et à mesure que le sang est collecté, le sang de la piscine de chaque groupe de traitement de souris (chacune 5 souris expérimentales + 5 souris témoins) dans un seul tube de 15 mL contenant 5 000 U/mL d’héparine. Utiliser 10 μL de 10% d’héparine par 100 μL de sang prélevé.Remarque: Mélanger le tube fréquemment pendant la collecte pour éviter la coagulation sanguine. Alors que les souris porteuses de tumeurs peuvent être saignées en même temps que les souris expérimentales, pour assurer l’égalité des conditions avec le groupe de traitement, le sang de «contrôle» peut être soit rejeté, soit combiné avec le sang du groupe de traitement pour fournir des expérimental PBMC pour le groupe de traitement, à la discrétion des enquêteurs. Mettre en place 1 15 mL tube avec 4 mL de milieu d’isolement lymphocytes (voir le tableau des matériaux) par 5 \ u201210 souris saignée. Lentement le sang de couche (recueilli des souris porteuses de tumeur) sur le dessus du milieu. Faites tourner les cellules pendant 20 min à 1000 \ u20121, 500 x g pour séparer le PBMC des globules rouges. À la fin de la centrifugation, recueillir la couche supérieure de plasma, en laissant ~ 0,5 mL restants au-dessus du manteau de Buffy, et stocker à 4 °C pour une utilisation ultérieure (étape 7,1). Recueillir la couche de manteau de Buffy dans un tube propre de 15 mL, remplir de PBS à 15 mL, et tourner pendant 10 min à 250 x g dans une centrifugeuse de culture de tissus standard pour recueillir le PBMC. Pipetter soigneusement le surnageant, et Resuspendre le culot en effréant le tube. Ne pas décanter, car le culot est mou et peut être perdu. Ajouter 2 mL de tampon de lyse des globules rouges ACK (voir le tableau des matériaux) dans le tube pour éliminer les globules rouges restants du PBMC. Incuber sur la glace pendant 10 min. Remplissez le tube avec du PBS à 15 mL, et tournez vers le bas pendant 10 min à 250 x g dans une centrifugeuse de culture de tissu standard pour collecter le PBMC. Pipetter délicatement le surnageant, et Resuspendre le pellet en le faisant scintillant. Ne pas décanter, car le culot est mou et peut être perdu.Remarque: À cette étape, le PBMC purifié peut être modifié comme le mieux adapté à l’expérience. Les divers composants du PBMC (plaquettes, monocytes, autres types de cellules immunitaires) peuvent être épuisés ou isolés du PBMC au besoin. En outre, les PBMC eux-mêmes peuvent être exposés à la 8-MOPA, soit avant ou après l’article 4 (avant ou après le passage de la plaque — après l’article 2 ou avant l’article 5), en suivant les étapes du protocole 3.3 \ u 20123.8 et en remplaçant le PBMC pour les cellules Yumm 1.7. Cela va tronquer la capacité immunogénique du traitement, et plutôt promouvoir la tolérance immunitaire. Pour chaque groupe de traitement (5 souris expérimentales + 5 souris témoins), resuspendre le culot PBMC en 300 μL de FBS. 3. traitement 8-MOP/UVA des cellules tumorales Culture et collecter des cellules tumorales YUMM 1.7 comme décrit dans les étapes 1.2 – 1.3 pour préparer une source d’antigène de cellules tumorales à 8-MOPA-Exposed. Préparez 2,5 x 106 cellules tumorales Yumm 1.7 par groupe de traitement de 5 souris. Pour chaque groupe de traitement, resuspendre le culot de cellules tumorales dans FBS à 2,5 x 106 cellules/300 μl (~ 8,33 x 106 cellules/ml). Avec le capot de culture tissulaire éteint, ajouter 8-MOP (voir le tableau des matériaux) à la Yumm 1.7 cellule tumorale suspension pour une finale 8-MOP concentration de 100 ng/ml.Attention: 8-MOP est un agent photoactivable d’ADN-endommageant et cancérigène. Soyez prudent lors de la manipulation et de la distribution, évitez tout contact avec la peau exposée et jetez-le convenablement. Mélanger les cellules bien, envelopper le récipient de la cellule dans une feuille d’étain, et incuber pendant 20 min à 37 °C. Préenduire une plaque de culture tissulaire de 12 puits en remplissant un puits pour chaque groupe de traitement de 5 souris (2,5 x 106 cellules tumorales Yumm 1.7) avec 1 ml de FBS, et réfritraiter la plaque remplie pendant 20 min à 4 °C. Allumez la source de lumière UVA pour la pré-chauffer.Attention: La lumière UVA est cancérogène. Lorsque vous travaillez avec des sources de lumière UVA travailler rapidement et soigneusement, protéger la peau contre l’exposition, et utiliser des boucliers faciaux ou des lunettes pour protéger le visage et les yeux. Après 20 min, déplacez la plaque réfrigérée de 12 puits (étape 3,5) vers le capot de culture tissulaire, enlevez le FBS des puits et ajoutez 300 μL (2,5 x 106 cellules/puits) cellules tumorales exposées à la MOP (à partir de l’étape 3,4) par puits. Exposer la plaque contenant des cellules à la source de lumière UVA préchauffée pour une irradiation totale de 4 J/cm2.Remarque: La concentration de 8 MOP et la dose d’UVA décrites ici sont calibrées pour la lignée de cellules tumorales YUMM 1.7. Un titrage de la dose de 8-MOP/UVA, suffisant pour causer 100% de décès de cellules tumorales dans une semaine d’exposition, devrait être effectué pour chaque lignée de cellules tumorales expérimentales, afin de déterminer la dose efficace de tuer. Ceci est d’une importance cruciale pour les expériences TI in vivo de souris, parce que les cellules sont réinjectées rétroorbitalement (étape 6,1) et donc toutes les cellules tumorales non endommagées peuvent autrement former des tumeurs oculaires dans l’animal traité. Comme ligne directrice, 4 \ u20128 J/cm2 d’UVA, 100 \ u2012200 ng/ml 8-MOP, est la gamme efficace typique pour la plupart des lignées cellulaires tumorales. Recueillir 8-MOPA-traités des cellules tumorales de chaque puits, tourbillonnant la plaque et le pipetage soigneusement pour assurer la récupération complète des cellules. 4. plaque TI passage des cellules Pour chaque groupe de traitement de 5 souris, combiner dans un tube conique de 1,5 mL 300 μL du PBMC approprié (à partir de l’étape 2,11) et 300 μLde cellules tumorales traitées à 8 MOP (à partir de l’étape 3,9). Mélanger les cellules. Utiliser une seringue de 10 mL pour remplir les ensembles “entrée” et “sortie” du tube TI (voirTable des matières) avec FBS. Ouvrir les pinces de tuyauterie pour remplir les tubes et fermer les pinces une fois que les tubes sont remplis avant de débrancher la seringue, pour retenir le FBS à l’intérieur du tube. Utilisez une pipette P1000 pour ajouter le PBMC et le mélange de cellules tumorales (de l’étape 4,1) à la plaque TI (voir le tableau des matériaux). Tenez la plaque à un angle de 45° , placez l’embout de la pipette solidement dans la prise de la plaque TI et remplissez doucement la plaque en évitant les bulles. Retirez l’embout de la pipette de la prise avant de relâcher le piston de la pipette. La plaque contient 450 μL; Retournez les cellules restantes au tube conique 1,5 mL. Incuber la tubulure remplie de FBS, la plaque de TI remplie de cellules et le tube conique de 1,5 mL contenant les cellules restantes dans l’incubateur de culture tissulaire à 37 °C pendant 1 h. Après incubation, videz le tube TI par gravité, en relâchant les pinces. Utilisez une pipette P1000 pour retirer les cellules de la plaque TI en insérant l’embout de la pipette avec le piston enfoncé dans le port de la plaque. Tenez la plaque à un angle de 45° et remplissez l’embout de la pipette P1000. Replacez les cellules dans leur tube conique original de 1,5 mL. Pour exécuter la plaque TI, raccordez le tube de sortie à la plaque et fixez la plaque TI dans le système de fonctionnement de la plaque. À l’aide d’une seringue de 1 mL, prélever les 600 μL de PBMC et de mélange de cellules tumorales du tube conique 1,5 mL, se débarrasser des bulles dans la seringue, attacher la seringue au tube d’entrée avec la pince ouverte et remplir lentement jusqu’à ce que le liquide atteigne l’extrémité du tube. Fixez l’extrémité libre du tube d’entrée à la plaque TI et continuez à charger doucement le volume restant. Fermez le collier d’entrée. Détachez la seringue de 1 mL et raccordez le tube d’entrée à la pompe de la seringue. Fixez la tubulure de sortie à un tube conique de 1,5 mL propre pour la collecte de cellules. Réglez le débit de la pompe de la seringue à 0,09 mL/min, mais ne démarrez pas encore la pompe. Inclinez la plaque TI ~ 30° vers le côté de la pompe de la seringue, à l’aide d’une plate-forme de course de plaque TI ou de tout autre moyen (par exemple, un petit objet plat sous une extrémité de la plaque). Relâchez délicatement la bride sur le tube d’entrée. Démarrez la pompe de la seringue, en observant attentivement la façon dont la plaque TI se remplit, et faites glisser le tube ou la plaque si nécessaire si des bulles d’air gênent l’écoulement. Une fois que la plaque de TI est complètement remplie, inclinez-la ~ 30° dans la direction opposée pendant qu’elle se vide. Lorsque toutes les cellules et le liquide sont dans le tube de collecte conique de 1,5 mL, arrêter la pompe. Pour laver la plaque TI, débrancher le tube d’entrée de la pompe de la seringue, raccorder à une seringue de 1 mL remplie de 600 μL de FBS, et suivre la procédure pour les étapes 4.8 \ u 20124.9. Réglez le débit de la pompe de la seringue à 0,49 mL/min, relâchez la bride d’entrée et exécutez la plaque TI comme décrit aux étapes 4.12 \ u 20124.13, en collectant le lavage dans le même tube conique 1,5 mL. Effleurez ou Tapotez doucement la plaque TI tout le temps, pour aider à détacher et à éluter les cellules adhérentes. Faire tourner la collection 1,5 mL tube conique dans le microfuge de paillant à 250 x g pendant 8 min. jeter le surnageant. 5. préparation du sérum de souris autologue pour la culture de nuit Medium Recueillir du sang de 10 \ u201212 semaine C57BL/6J souris par toute méthode institutionnellement approuvée (par exemple, saignement des yeux, saignement de la veine de queue, saignement de la joue, ou purge terminale par ponction cardiaque), sans anticoagulants. Estimer la collecte de 1 mL de sang pour chaque 300 μL de sérum nécessaire.Remarque: On aurait besoin de 300 μL de sérum pour chaque groupe de traitement de 5 souris dans l’expérience. Laisser le sang coaguler pendant la nuit à 4 ° c. Faire tourner le sang coagulé à 3 000 x g pendant 15 min. recueillir soigneusement la couche supérieure contenant du sérumRemarque: Le sérum peut être utilisé immédiatement pour faire le milieu d’incubation de cellules de nuit (étape 6,1), ou conservé pour des expériences futures. Pour préserver le sérum, congeler en aliquotes à-20 ° c. 6. co-incubation du PBMC pendant la nuit avec l’antigène Resuspendre le PBMC et le culot de cellules tumorales (étape 4,5) dans 2 mL de RPMI clair avec 15% de sérum de souris autologue (préparé à l’étape 5). Plaque dans un plat stérile traité à la culture non tissulaire de 35 mm et incuber pendant la nuit dans des conditions de culture tissulaire standard (37 ° c, 5% CO2).Remarque: Si le PBMC est utilisé avec un antigène non cellulaire (peptide, Nanoparticle, protéine, etc.), omettez la section 3 du protocole et passez directement de la section 2 à l’article 4, en ajoutant l’antigène désiré au PBMC de la plaque TI pour une co-incubation de nuit ici, dans l’étape 6,1. Le jour suivant, détachez soigneusement toutes les cellules adhérentes du fond du plat avec un grattoir de culture tissulaire, en tournant le plat tout en grattant pour assurer même la collecte de cellules. Recueillir les cellules dans un tube de 15 mL. Ajouter 2 mL de PBS dans le plat et répéter l’étape de graissement, en collectant les cellules dans le même tube. Rincer le plat de 35 mm avec 1 mL de PBS et ajouter le rinçage au même tube. Tourner pendant 10 min à 250 x g dans une centrifugeuse de culture de tissus standard pour collecter les cellules. Pipetter délicatement le surnageant et Resuspendre le culot en faisant clignoter le tube. Ne pas décanter, car le culot est mou et peut être perdu. 7. réinjection de cellules traitées au TI dans des souris porteuses de tumeurs Faire tourner le plasma autologue (préparé à l’étape 2,4) à 750 x g pendant 15 min pour sédimentation des particules. Resuspendre le culot cellulaire (à partir de l’étape 6,4) dans 600 μL de plasma autologue ou de PBS. Injecter des cellules à 100 μL par souris dans le plexus rétro-orbital de l’anesthésié de façon appropriée (p. ex., 3 \ u20125% de gaz inhalant isoflurane, anesthésie confirmée par l’absence de patte postérieure réflexe de pincement) souris expérimentales porteuses de tumeurs. Si désiré, réinjecter des souris porteuses de tumeur de contrôle avec 100 μL de plasma autologue seul, ou PBS. Pour les souris porteuses de tumeurs YUMM 1.7, répéter le traitement (étapes 2 – 7,2) deux fois par semaine pendant 3 semaines, pour un total de 6 traitements. Recueillir et traiter le PBMC à partir de souris porteuses de tumeurs hebdomadaires (sections du protocole 2 \ u20124) les lundis et jeudis, et réinfuser après une incubation de nuit (sections du protocole 5 \ u20127) les mardis et vendredis.Remarque: Ce schéma thérapeutique a été développé pour la cinétique de croissance spécifique des tumeurs YUMM 1.7 chez les souris. Il peut avoir besoin d’être titrés pour d’autres systèmes tumoraux avec des taux de croissance tumorale plus lents ou plus rapides, augmentant ou réduisant respectivement le nombre de traitements. Surveillez le volume des tumeurs par mesure bimensuelle — de préférence au moment de l’administration du traitement (mardi et vendredi) — des diamètres et des hauteurs de tumeurs perpendiculaires à l’aide d’un étrier. Terminez l’expérience lorsque les volumes tumoraux de contrôle atteignent la taille maximale permise par les directives et les protocoles institutionnels. 8. adaptation du protocole pour le traitement de petites quantités de sang humain Adaptez le protocole pour l’utilisation avec les cellules humaines en isolant d’abord le PBMC du sang humain. Utiliser l’héparine comme anti-coagulant, avec tout protocole d’isolement PBMC préféré. Assurez-vous que la fraction PBMC isolée contient un nombre physiologique de plaquettes, pour obtenir les meilleurs résultats de protocole. Surveiller l’isolement des plaquettes pré-et post-PBMC à l’aide d’un compteur d’hématologie standard. Si vous utilisez une source d’antigène cellulaire humain, traitez les cellules antigéniques humaines en suivant les étapes décrites dans la section 3 pour les cellules YUMM 1.7. Titrez les doses de 8-MOP et d’UVA en conséquence. Effectuer les étapes de passage de plaque décrites dans la section 4, en utilisant jusqu’à 3 x 107 PBMC par plaque TI. Culture PBMC pendant la nuit avec un antigène cellulaire/autre de choix, comme décrit dans la section 6, mais substituer 15% de sérum AB humain pour le plasma de souris autologue pour le milieu de culture de nuit à l’étape 6,1. Utilisez les cellules résultantes dans n’importe quel dosage désiré. Par exemple, la co-culture avec des lymphocytes T réactifs à l’antigène pour observer les réponses de lymphocytes T spécifiques à l’antigène initiées par les cellules traitées au TI.

Representative Results

Nous avons récemment développé un appareil ECP miniature évolutif de la souris à l’homme, la plaque TI (figure 1a) et conçu des protocoles de traitement correspondants. L’appareil et le protocole reproduisent les principales caractéristiques cellulaires et in vivo de la vaccination des ECP, appelées «transimmunization». Le protocole de transimmunization murin11 (figure 1b) de la preuve de principe consiste en un passage de la plaque extracorporelle TI de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) à partir de souris porteuses de tumeurs ainsi que d’apoptotiques 8-MOPA– exposés cellules tumorales. En particulier, la chambre TI est transparente et dimensionnée pour correspondre au format standard de la glissière de microscopie, ce qui permet une visualisation aisée des interactions cellulaires au sein de la plaque TI à n’importe quel point du protocole (vidéo 1). Les cellules immunitaires activées par la TI-plate sont incubées pendant la nuit avec les cellules tumorales apoptotiquesAexposées à 8 MOP, facilitant l’absorption des cellules tumorales, le traitement et le transfert d’antigènes tumoraux aux DCS. Le jour suivant, le mélange de cellules co-incubées est retourné dans le flux sanguin de l’animal porteur de tumeurs. Les animaux témoins subissent des procédures de prélèvement de sang identiques, pour normaliser les effets de la lymphodéplétion sur la croissance tumorale, mais reçoivent au lieu de cela des réinfusions de PBS. La croissance tumorale chez tous les animaux est surveillée tout au long de l’expérience. Dans des études utilisant le mélanome de murin syngénique de la Yumm 1.7, modèle18, le protocole de transimmunization a été répété deux fois par semaine sur trois semaines, pour un total de six traitements chez chaque animal (figure 1b). La thérapie est apparue bien tolérée chez tous les animaux traités (> 100), et a constamment montré une réduction de la croissance tumorale de YUMM 1.7 chez les animaux traités versus témoins, comme observé dans 9 expériences indépendantes menées sur 2 ans (figure 2a, B). Les résultats montrent des données cumulatives de croissance tumorale chez les animaux traités par la transimmunization et témoins sur toutes les expériences réalisées (figure 2a), ainsi que des courbes de croissance de tumeurs représentatives pour les animaux individuels au sein d’une expérience, pour donner un sens de la variabilité du système (figure 2b). Nous avons constaté que le succès du protocole dépend de façon critique de la présence de monocytes dans le PBMC traité, de la présence de plaquettes dans la fraction PBMC et de l’étape de passage de la plaque TI. Lorsque le passage de la plaque est omis, ou lorsque les plaquettes ou les monocytes sont épuisés de la fraction PBMC, l’effet thérapeutique n’est plus observé (figure 3A). Le traitement nécessite également la présence de cellules tumorales apoptotiques. Il est inefficace en l’absence des cellules immunitaires ou d’une source d’antigène, ou en présence d’antigène mal apparié, par exemple lorsque des souris porteuses de tumeurs YUMM 1.7 sont traitées à l’aide de cellules du carcinome du côlon MC38 (figure 3b). Pour un résultat immunisant, il est également essentiel d’éviter l’exposition au PBMC àla8-MOP A. 8-MOPa-exposé PBMC non seulement abrogate, ou peut-être même inverser, immunité anti-tumorale (figure 3C), mais aussi inhiber le potentiel immunisant des cellules non exposées, comme dans l’expérience où un nombre égal de 8-MOPA-exposés et 8-MOP Les PBMC protégés par un aont été utilisés sans effet antitumoral observable (figure 3C). Avec le PBMC humain, la chambre de TI et le protocole de transimmunization conduisent à une activation réussie des monocytes dans le courant continu, indiscernable par la surface cellulaire et les marqueurs d’activation intracellulaire de celui obtenu par la plaque clinique ECP (tableau 1). Comme dans les études de souris, l’activation DC (figure 4a) et la capacité des DCS générés par la transimmunization de traiter et de présenter l’antigène (figure 4b,C) dépendent de façon critique de la présence de plaquettes dans le PBMC, et sur le passage de la plaque TI. Le DCs humain activé par la Transimmunization peut traiter et croiser efficacement des antigènes peptidiques (figure 4b) ou des antigènes de cellules tumorales humaines entières de 8-MOPa, pour activer des lignées cellulaires T spécifiques à l’antigène humain dans in vitro (figure 4C), de façon TI et dépendante des plaquettes (figure 4b, C). Figure 1: schémas de chambre et de protocole de Transimmunization (TI). A) schéma et spécifications de la chambre de traitement de la transimmunization (plaque TI). B) Description schématique du processus expérimental de traitement de la transimmunization. Brièvement, les animaux sont inoculés par voie sous-cutanée (s.c.) avec des cellules tumorales syngéniques; les animaux avec des tumeurs palpables sont traités deux fois par semaine par prélèvement sanguin, l’isolement du PBMC par le sang, le passage du flux de PBMC à travers la plaque autologue de TI revêtue de plaquettes en présence de cellules tumorales traitées à 8 MOP/UVA, de PBMC et de co-incubation de cellules tumorales pendant la nuit, et réinjection des cellules par voie intraveineuse dans les mêmes animaux porteurs de tumeurs. Le volume de tumeur est mesuré tout au long de l’expérience. Ce chiffre a été modifié à partir de11. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 2: la Transimmunization contrôle la croissance des tumeurs syngéniques du mélanome de YUMM 1.7. (A) volume de tumeur Yumm 1.7 au fil du temps tracé pour les souris C57BL/6 inoculées avec 1 x 105 Yumm 1.7 cellules tumorales, et recevant soit six traitements de transimmunization (ligne noire), ou six traitements de contrôle (ligne grise). Les données sont cumulatives sur neuf expériences indépendantes menées sur deux ans. (B) les données d’un seul représentant Yumm 1.7 transimmunizaton expérience, avec chaque ligne montrant la croissance tumorale pour une souris individuelle. (A et B) Les souris «PBS Control» dans toutes les expériences ont été saignées sur le même calendrier que les animaux expérimentaux, mais ont reçu six réinfusions stériles de PBS. Les barres d’erreur représentent SEM, valeurs de p calculées pour chaque point de temps en utilisant le test de comparaisons multiples de Sidak; * *, p = 0,0013; , p < 0,0001. Ce chiffre a été modifié à partir de11. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3: la transimmunization nécessite des monocytes et des plaquettes dans la fraction PBMC de la plaque TI, ainsi quele traitement 8-MOP de cellules tumorales appariées par l’antigène et de 8-MOPa épargnant de PBMC. (A) volume tumoral Yumm 1.7 au fil du temps tracé pour les souris C57BL/6 inoculées avec 1 * 105 Yumm 1.7 cellules tumorales, et recevant soit six traitements de transimmunization (lignes noires solides), six traitements de contrôle (lignes grises solides), ou six traitements TI Lorsque des monocytes ou des plaquettes ont été épuisés du PBMC avant l’étape de passage de la plaque (en utilisant respectivement les kits de déplétion a-CD11b et a-CD41), ou le passage de la plaque a été omis (lignes pointillées). (B) volume tumoral au fil du temps tracé pour les souris C57BL/6 inoculées avec 1 x 105 Yumm 1.7 cellules tumorales, et recevant soit six traitements de transimmunization (lignes noires solides), six traitements de contrôle (lignes grises solides), PBMC seul (ligne pointillée), 8- MOPa-traitée Yumm 1.7 cellules seules, ou TI en utilisant 8-MOPa-traités MC38 cellules tumorales (lignes pointillées). (C) volume tumoral au fil du temps tracé pour les souris C57BL/6 inoculées avec 1 x 105 Yumm 1.7 cellules tumorales, et recevant soit six traitements de transimmunization (lignes noires solides), six traitements de contrôle (lignes grises solides), six traitements TI où Les PBMC ont été exposés uniformément à la 8-MOPa immédiatement avant le passage de la plaque, six traitements de TI où les PBMC ont été uniformément exposés à la 8-MOP a immédiatement après le passage de la plaque, ou six traitements où les cellules TI après le passage dela plaque ont été mélangées 1:1 avec un nombre égal de PBMC qui ont été uniformément exposés à 8-MOPA irradiation (lignes pointillées). (A, B et C) Les souris «PBS Control» dans toutes les expériences ont été saignées sur le même calendrier que les animaux expérimentaux, mais ont reçu six réinfusions stériles de PBS. Des données sont fournies pour des expériences représentatives. Les barres représentent SEM, valeurs P calculées pour chaque point de temps en utilisant le test de comparaisons multiples de Sidak; *, p < 0,05; * *, p < 0,01; , p < 0,001; , p < 0,0001; NS = différences non significatives. Ce chiffre a été modifié à partir de11. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 4: le protocole TI avec la chambre TI induit rapidement la maturation DC, le profil d’activation unique et la capacité d’activation des cellules T dans le PBMC humain, dépendant du passage de la plaque et des plaquettes.A. FACS analyse des marqueurs indiqués dans les cellules CD11c+ parmi les PBMC humains fraîchement isolés («témoins»), les PBMC traités avec le protocole TI («TI») ou le PBMC traité parti où le passage de la plaque a été omis, les plaquettes ont été épuisées en utilisant le Kit de billes a-CD41 avant le passage de la plaque, ou les deux ci-dessus ont été effectuées. Les données résument six expériences indépendantes avec trois donneurs de sang. Les barres représentent les valeurs moyennes, tandis que les barres d’erreur représentent SEM. valeurs de P pour chaque comparaison calculée à l’aide du test t apparié; *, p < 0,05; * *, p < 0,01. Les panneaux ont été modifiés à partir de11. B. les PBMC humains traités à l’aide de plaquettes ou à l’épuisement des plaquettes ont été co-incubés pendant la nuit avec un peptide non pertinent (SIINFEKL), ou avec un peptide long pour la protéine HPV E7 associée au carcinome spinocellulaire de la tête et du cou. Le PBMC a ensuite été utilisé pour stimuler une lignée de cellules T humaine de 5 à 5 spécifiquement réactive au peptide E7. La stimulation des cellules T a été mesurée par la production d’IFNg après 5 jours de culture. Cles PBMC humains traités aux plaquettes ou à l’épuisement des plaquettes ont été co-incubés pendant la nuit avec une lignée cellulaire de carcinome squameux à 8 MOP A traitée àlatête et au cou SCC61, exprimant (SCC61 HPV E6/7) ou n’exprimant pas (SCC61 pas de HPV ) les protéines anti-HPV E6 et E7 antigéniques19. Le PBMC a ensuite été utilisé pour stimuler une lignée de cellules T humaine de 5 à 5 spécifiquement réactive au peptide E7. La stimulation des cellules T a été mesurée par la production d’IFNg après 5 jours de culture. (B et C) Les données montrent des expériences représentatives avec trois répétitions dans chacune. Les barres représentent les valeurs moyennes, tandis que les barres d’erreur représentent SEM. valeurs P pour chaque comparaison calculée en utilisant le test de comparaisons multiples de Sidak; , p < 0,001; , p < 0,0001. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. marqueur paramètre non traité Plaque ECP avec protocole TI Plaque TI avec protocole TI valeur de p ECP vs TI HLA-DR Δ IFM 100,1 ± 42,4 439,8 ± 152,5 417,7 ± 152,2 Ns CD80 Δ 3,9 ± 1,1 22,3 ± 7,2 24,5 ± 7,2 Ns CD83 Δ IFM 0,3 ± 0,2 53,3 ± 9,7 51,4 ± 17,4 Ns CD86 Δ IFM 10,8 ± 1,7 103,9 ± 23,4 87,1 ± 17,6 Ns PLAUR Δ IFM 54,5 ± 12 721,4 ± 183,6 528,7 ± 135,5 Ns ICAM1 Δ IFM 12,2 ± 1,6 179,6 ± 28,5 192,5 ± 25,4 Ns ITGB5 Δ IFM 53,6 ± 25,7 97,1 ± 31,6 103,8 ± 32,8 Ns CCL2 (MCP-1) Δ 0,6 ± 0,5 70,1 ± 6,7 55,2 ± 8,9 Ns CXCL5 Δ 0,7 ± 0,4 39,1 ± 7,2 41,5 ± 4,7 Ns CXCL16 Δ 0,3 ± 0,2 28,0 ± 8,8 35,3 ± 11,7 Ns CD105 (endoglin) Δ IFM 3,6 ± 0,3 124,3 ± 25,4 141,8 ± 33,2 Ns CD112 (nectine 2) Δ IFM 10,9 ± 1,8 47,3 ± 5,2 50,9 ± 9,2 Ns CD120a (TNFR-1) Δ IFM 10,1 ± 2,6 2,2 ± 1,4 1,8 ± 1,1 Ns CD137L (4-1BBL) Δ IFM 2,9 ± 1,5 1,0 ± 0,4 1,2 ± 0,6 Ns Tableau 1: le protocole TI avec chambre TI induit rapidement une maturation DC équivalente à celle induite par le protocole TI avec la chambre clinique ECP. L’analyse FACS du changement des marqueurs indiqués des contrôles IgG correspondants dans les cellules humaines vivantes de CD11c + parmi les PBMC fraîchement isolés («non traités»), le PBMC passe par la plaque clinique de l’ECP à la suite du protocole TI («plaque ECP avec protocole TI») et analysés après une incubation de nuit ou un PBMC traité avec le protocole TI («plaque TI avec protocole») et analysé après une incubation de nuit. Pour les marqueurs, tels que HLA-DR, où l’ensemble de la population cellulaire a été modifié, les données sont exprimées en tant que variation de l’intensité moyenne de fluorescence (MFI). Pour les marqueurs où seul un sous-ensemble de cellules expriment le marqueur, tel que CCL2, la différence dans les cellules positives de marqueur de pourcentage de CD11c + PBMC en direct est à la place représentée. Les données résument six expériences indépendantes avec trois donneurs de sang. Les données pour chaque marqueur sont exprimées en tant qu’erreur normale de l’âge ± de la moyenne (SEM). Valeurs de P pour chaque comparaison calculée à l’aide d’un test t apparié; NS = différences non significatives. Le tableau a été modifié à partir de11. Vidéo 1: imagerie cellulaire en direct des interactions plaquettaires et des cellules immunitaires au sein de la plaque TI.Les PBMC ont été préparés comme décrit dans la section 2 du protocole ci-dessus et exposés à la plaque de transimmunization comme décrit dans la section 4, sauf que la période d’incubation statique à l’étape 4.2.3 a été réduite de 1 h à 30 min. Au cours du protocole TI, la plaque TI, qui est de taille identique à une glissière de microscope standard, a été installée dans la phase de maintien de la glissière d’un système d’imagerie par fluorescence et les cellules à l’intérieur ont été imagées à un grossissement de 40x et à 37 ° c pendant le remplissage de la plaque (4.2.2 ), l’incubation de plaques (4.2.3) et le débit des plaques (4.3.5). Des images continues ont été acquises et des films ont été produits à l’aide du logiciel «routine de numérisation automatisée». Les légendes sous la vidéo indiquent l’étape du protocole sur lequel les cellules sont filmées. Les flèches et les cercles dans la vidéo, avec les légendes associées, soulignent les cellules et les zones d’intérêt. La barre d’échelle de 10 μM est présente dans le coin inférieur droit tout au long de la vidéo. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Cliquez avec le bouton droit de la souris pour télécharger.)

Discussion

Le dispositif miniaturisé et le protocole décrits ci-dessus pour la première fois permettent une étude efficace des mécanismes de l’ECP dans les systèmes expérimentaux de souris et dans les petits échantillons de sang humain. C’est une grande avance; par exemple, il nous a permis de démontrer pour la première fois l’efficacité de la transimmunization contre les tumeurs solides dans une souris modèle 11, ouvrant la possibilité future d’une application similaire en oncologie humaine.

Avant le développement du dispositif et de la méthode de transimmunization décrits ici, il était impossible de mener une enquête complète sur tous les aspects de l’ECP. Dans les modèles de souris, bien que le 8-MOPun aspect de la thérapie pourrait être répliqué quelque peu en traitant les cellules dans une boîte de Petri12,20, il n’y avait pas de capacité à intégrer dans la méthode le passage de la plaque, qui a été montré à fournir des interactions plaquettaires dynamiques qui sont d’une importance cruciale pour l’activation physiologique de l’ECP14. Dans les études humaines, alternativement, le composant d’écoulement était entièrement présent, mais la capacité d’exposer sélectivement des composants cellulaires spécifiques à 8-MOPa, ou pour les protéger de lui, était manquant21,22. Cela a empêché la compréhension complète du mécanisme ECP, et son optimisation pour l’immunité ou la tolérance. De plus, la quantité de sang nécessaire pour travailler avec l’appareil clinique ECP est importante, ce qui entrave l’enquête scientifique. Le dispositif et le protocole ECP miniaturisés décrits ici pour la première fois permettent une modélisation de laboratoire ECP efficace, entièrement flexible et accordable. En outre, la plaque TI permet la visualisation en temps réel et la surveillance des interactions cellulaires dans la plaque par microscopie.

Pour le succès du protocole à l’aide de systèmes in vivo et ex vivo, il est essentiel que le PBMC traité contienne des monocytes qui peuvent être activés en DCs fonctionnels. Pour que cette activation se poursuive, il est également nécessaire de s’assurer que la fraction PBMC contient un nombre physiologique de plaquettes saines et activables, et que le protocole de passage de la plaque TI est suivi de près. Afin de diriger les DCs nouvellement activés vers une réactivité spécifique, ils doivent être fournis avec l’antigène. Nous avons constaté que la méthode la plus efficace de délivrance d’antigène pour l’immunité anticancéreuse est la co-incubation du jour au lendemain des DCs nouvellement activées avec des cellules tumorales à 8 MOPAexposées à l’antigène. Cela a l’avantage supplémentaire d’être capable de créer une réponse anti-cancéreuse immunogénique sans nécessiter de connaissances préalables sur les antigènes tumoraux, en permettant aux DCs de les sélectionner. Cependant, dans les cas où l’antigène est connu, nous avons eu un certain succès dans les systèmes ex vivo lors de l’utilisation de peptides libres comme antigènes dans la co-incubation. Pour les applications immunogéniques, les contrôleurs de la protection doivent eux-mêmes être protégés contre l’exposition 8-MOPA . Enfin, dans les expériences in vivo, il est important de travailler avec un modèle animal capable de l’immunité anti-tumorale. La transimmunization fonctionne en créant des DCs activés, spécifiques à l’antigène, qui travaillent dans le corps pour initier des réponses immunitaires innées et adaptatives. Une altération de l’activité ou l’absence de cellules NK, CD4 ou de T-T dans la souris traitée aura une incidence sur l’efficacité du protocole5,11.

Bien que le protocole décrit ici est une preuve de principe qui a été optimisé pour un modèle de tumeur syngénique solide de souris, il révèle néanmoins de nombreuses possibilités. Les mécanismes de l’ECP en oncologie sont seulement élucidés, et il y a encore beaucoup de place pour une meilleure compréhension. Plus largement, la capacité de générer des contrôleurs de la souris et de l’humain activés physiologiquement, et de les orienter sélectivement vers l’immunité spécifique à l’antigène a de nombreuses applications potentielles au-delà du cancer. La capacité de faire la même chose, mais plutôt de diriger les contrôleurs de domaine vers la tolérance spécifique à l’antigène, comme le suggère l’efficacité tolérante de l’ECP lui-même, a également de vastes implications médicales. Avec cette méthode, nous espérons fournir les outils et ouvrir une avenue productive de la recherche pour tous ceux qui ont un intérêt dans les thérapies de DC physiologiques.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été appuyé par NIH-NCI spore Grant 1 CA121974 (R. Edelson, M. Girardi); NIH Cancer Center support Grant 3 CA16359-28S1 (R. Edelson, M. Girardi); la bourse de formation de l’Institut médical Howard Hughes (A. Vassall); et la Fondation cardiaque de New York (R. Edelson, A. Ventura, A. Vassall, H. Ezaldein). Le soutien partiel a été fourni par R01 CA196660-01 à M. Bosenberg.

Les auteurs sont reconnaissants au Dr Robert Tigelaar pour son mentorat, ses conseils et ses connaissances expérimentales. Nous remercions nos collègues de la Fraunhofer IBMT, en particulier le Dr Thorsten Knoll, pour avoir développé et fourni la chambre TI équivalente à l’ECP. Nicholas THEODOSAKIS a gentiment aidé avec les étapes initiales des expériences YUMM. Nous remercions nos donneurs de sang bénévoles, Inger Christensen et son personnel professionnel au centre de traitement de Yale ECP pour obtenir de l’aide en matière d’approvisionnement en sang bénévole. Dr. Wendell Yarbrough et le Dr Natalia Issaeva aimablement partagé avec nous les lignées cellulaires SCC61 et SCC61-E6/7. Pour l’assistance technique sur le projet, nous remercions le Dr Julia Lewis pour les conseils du protocole FACS, et E. menet, G. Tokmoulina, C. cote à Yale FACS Core. Des images de film de cellules dans la plaque de TI ont été acquises avec l’aide de Felix Rivera-Molina, PhD, département de biologie cellulaire et Yale CINEMA Imaging Center, école de médecine de Yale. La production cinématographique a été supervisée par Andrew Osborne, producteur vidéo senior, Bureau des communications, Yale School of Medicine.

Materials

8-MOP (UVADEX 20ug/mL, 10 mL) Therakos, Inc Rx only, NDC No. 64067-0216-01 Protocol steps 3 and 8 – mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells
AB serum Lonza BioWhittaker 14-498E Protocol step 8.5 – overnight culture of human PBMC
ACK red cell lysis buffer Lonza BioWhittaker 10-548E Protocol step 2 – mouse PBMC preparation
Anesthesia Tabletop V1 system with active scavenging VetEquip 901820 Protocol steps 1 and 7 – mouse sc tumor introduction and TI administration
Autologous mouse plasma prepare in lab n/a Prepare per protocol step 2.4, use in  7.1 – mouse TI treatment administration
Autologous mouse serum prepare in lab n/a Prepare per protocol step 5, use in step 6.1 – overnight culture of mouse PBMC
C57Bl/6J mice Jackson labs 0000664 Protocol steps 1, 2, 5 and 7 – mouse tumor injection, blood/serum collection, and therapy return
Cheek bleed GoldenRod lancet, 5 um Medipoint 9891620 Protocol step 2 – mouse PBMC preparation
Clear RPMI Gibco by LifeTech 11835-030 Protocol steps 6 and 8 – overnight culture of mouse/human PBMC
DMEM/F12 Gibco by LifeTech 11330-032 Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture
EasyGrip Petri Dishes, 35mm Falcon 351008 Protocol steps 5 and 8 – overnight culture of mouse/human PBMC
Eppendorf 1.5mL conical tubes DOT scientific 1700-GMT Protocol steps 1-8
FBS (fetal bovine serum, heat-inactivated) SAFC Biosciences 12306C-500mL Protocol steps 1-4 – YUMM1.7 cell culture, 8-MOP/UVA treatment of cells, TI plate
Hemavet 950FS hematology counter Drew Scientific HV950FS Protocol step 8.2 – monitoring human platelet numbers
Heparin 5,000U/mL McKesson Packaging services 949512 Protocol steps 2 and 8 – mouse and human PBMC preparation
Isoflurane Abbott Laboratories 5260-04-05 Protocol steps 1 and 7 – mouse sc tumor introduction and TI administration
Lympholyte M lymphocyte isolation medium Cedarlane Labs CL5035 Protocol step 2 – mouse PBMC preparation
Non-essential amino acids Gibco by LifeTech 11140-050 Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture
PBS (1x DPBS, (-) Ca+2, (-) Mg+2) Gibco by LifeTech 14190-144 Protocol steps 1-7
Pen/strep Gibco by LifeTech 15140-122 Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture
Polypropylene 15mL conical tubes Falcon 352097 Protocol steps 1-8
Programmable 2-channel syringe pump New Era Pump Systems Inc model NE-4000 Protocol steps 4 and 8 – running the TI plate
Retro-orbital injection needles, 27G x 1/2 BD Biosciences 305109 Protocol step 7 – mouse TI treatment administration
Syringes, 10mL (LUER-LokTip) BD Biosciences 309604 Protocol steps 4, 8 – running the TI plate
Syringes, 1mL (Slip tip) BD Biosciences 309659 Protocol steps 1, 4, 7, 8
TI plate and tubing set Transimmune AG not commercially available  Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.
TI plate running platform Transimmune AG not commercially available  Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.
Tissue culture flasks, T75 (75 cm2) Falcon 353136 Protocol steps 1, 2, 6 and 8 – mouse and human cell culture
Tissue culture plates, 12-well Falcon 353043 Protocol steps 3 and 8 – mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells
Tissue culture scrapers Falcon 353085 Protocol steps 6 and 8 – overnight culture of mouse/human PBMC
Trypsin-EDTA 0.25% (1x) Gibco by LifeTech 25200-056 Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture
Tumor injection needles, 25G x 5/8 BD Biosciences 305122 Protocol step 1 – mouse subcutaneous tumor introduction
UVA irradiator Johnson and Johnson not commercially available  The apparatus was specifically developed by J&J for Prof. R. Edelson's laboratory. Several machines are available in the laboratory on a collaborative basis; please contact Prof. R. Edelson for use of one. Alternative UVA irradiators are commercially available but have not been tested by us.
Invitrogen EVOS FL Auto 2 Imaging System Invitrogen fluorescence imaging instrument
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Referências

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Ventura, A., Vassall, A., Yurter, A., Robinson, E., Filler, R., Hanlon, D., Meeth, K., Ezaldein, H., Girardi, M., Sobolev, O., Bosenberg, M. W., Edelson, R. L. Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (147), e59370, doi:10.3791/59370 (2019).
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