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Imunologia e Infecção

Monostrati Colonoid umana per studiare le interazioni tra gli agenti patogeni, Commensals ed epitelio intestinale Host

Published: April 09, 2019
doi:
10.3791/59357
, , ,
1Department of Internal Medicine,University of New Mexico Health Science Center, 2Department of Medicine, Division of Gastroenterology & Hepatology,Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Qui, presentiamo un protocollo alla cultura umana enteroid o colonoid monostrati che hanno funzione di barriera intatta per studiare le interazioni epiteliali-microbiota ospite a livello cellulare e biochimico.

Abstract

3-dimensionale (3D) enteroid o colonoid culture umane derivate da cellule staminali base cripta sono attualmente il modello più avanzato ex vivo dell’epitelio intestinale. Grazie alle strutture chiuse e significativa supporto matrice extracellulare, culture 3D non sono l’ideale per gli studi di ospite-patogeno. Enteroids o colonoids può essere coltivata come monostrati epiteliali sulle membrane di coltura del tessuto permeabile per consentire la manipolazione di entrambi luminal e superfici di basolaterale delle cellule e fluidi d’accompagnamento. Questa mobilità ridotta superficie luminal facilita la modellazione interazioni epiteliali batterico-ospite ad esempio la possibilità di muco-degradanti di enteroemorragica e. coli (enteroemorragico EHEC) su epitelio colico. Un metodo per frammentazione di cultura 3D, monostrato semina e transepiteliale misurazioni di resistenza elettrica (TER) per monitorare i progressi verso la confluenza e differenziazione sono descritti. Differenziazione di monostrato Colonoid produce muco secernuto che possa essere studiata mediante tecniche di immunofluorescenza o immunoblotting. Più in generale, enteroid o colonoid gli strati monomolecolari attivare una piattaforma fisiologicamente rilevanti valutare le popolazioni di cellule specifiche che possono essere mirate da patogeno o commensale microbiota.

Introduction

Colonoids, enteroids e organoids intestinale hanno portato a molti progressi nella comprensione comportamento delle cellule staminali, sviluppo intestinale, funzione di barriera/trasporto e differenziazione cellulare. 1 tuttavia, 3D cultura limita lo studio dell’interazione epiteliale-patogeno ospite perché il lume non è direttamente accessibile ai batteri o fattori di virulenza a meno che le strutture chiuse sono sottoposti a microiniezione. 2 , 3 inoltre, secreto materiali come piccole molecole, proteine, o muco non può essere facilmente provato dalla cultura 3D per l’analisi a valle. L’impatto di agenti patogeni su barriera epiteliale funzione ionica e4 trasporto5 è stata valutata in 3D cultura usando coloranti fluorescenti e microscopia time-lapse, ma gli strati monomolecolari coltivati su supporti di coltura del tessuto permeabile sono suscettibili di tecniche aggiuntive quali TER misurazione e registrazione Morsetto tensione/camera di Ussing. 6 , 7

Numerose pubblicazioni hanno descritto i protocolli per la cultura 2D o monostrato di enteroids/colonoids. Materiali trovati per promuovere l’adesione delle cellule epiteliali includono idrogeli di collagene, gelatina di 0,1%9 8,,10 strato sottile della membrana dello scantinato derivata sarcoma murino matrix (BMM),11,12, 13 e collagene umano IV. 6 , 7 , 14 , 15 , 16 , 17 Seeding approcci includono la frammentazione meccanica pipettando6,14,15 e/o dissociazione dei fattori di adesione delle cellule con tripsina,10,11 Dispase,13 o EDTA. 9 alcuni protocolli utilizzano plasticware di coltura del tessuto poroso per semina, ma questo limita l’accesso basolaterale, così la maggior parte delle applicazioni dipendono da inserti di coltura del tessuto permeabile. Documentazione di formazione stabile monostrato confluente e manutenzione varia ampiamente fra le pubblicazioni. Inoltre, crescita e differenziazione composizioni multimediali per culture umane differiscono fra i vari gruppi e continuano a evolversi come i ricercatori più adottano e regolare la metodologia per soddisfare la loro applicazione e le risorse disponibili.

Per risolvere le limitazioni della cultura epiteliale intestinale 3D in studi di interazione ospite-patogeno, presentiamo un protocollo modificato per la conversione 3D umano enteroids o colonoids in un monostrato. Dopo aver raggiunto la confluenza in uno stato immaturo simile alla cripta, ritiro di fattori di crescita WNT3A, RSPO1 e gli inibitori A-83-01 e SB 202190 conduce alla differenziazione rappresentativa del piccolo del villo intestinale o superficie epitelio colico. Descriviamo la matrice ideale, collagene umano di tipo IV, per ricoprire gli inserti e ottenere frammenti uniforme di enteroid o colonoid per la placcatura. Dimostriamo che questo protocollo produce un monostrato confluente con un alto Colonoid TER. monostrati secernono uno strato di muco denso apicale, che consente per gli studi ex vivo dell’interazione patogeno-muco mediante immunoblotting o immunostaining. Inoltre è descritta una procedura di fissazione modificate per preservare lo strato di muco colica per immunostaining. Questo metodo si propone di fornire un modello trattabile per studiare le interazioni ospite-patogeno intestinale più presto dopo l’infezione.

Protocol

Questo protocollo è basato su studi precedentemente pubblicati dagli autori. 6 , 7 , 14 , 15 , 16 la seguente procedura dovrebbe essere effettuata in un armadio di sicurezza biologica sterile utilizzando tecniche asettiche appropriate. Tutti i metodi che coinvolgono campioni umani sono stati approvati dall’istituzionale recensione Board di Johns Hopkins University School of Medicine (IRB NA_00038329). 1. cappotto cella cultura inserti con matrice extracellulare Preparare 5 mL di soluzione stock collagene IV (1 mg/mL) in acido acetico di 100 mM. Lasciate riposare a 4 ° C per circa 4 h a completamente idrato/dissolvenza. Aliquotare il collagene IV soluzione e conservare a 4 ° C (≤ 1 mese) o a-20 ° C (> 1 mese). Immediatamente prima del rivestimento, diluire la soluzione madre di collagene IV in acqua di grado sterili per coltura ad una concentrazione finale di 34 μg/mL. Per piastra a 24 pozzetti inserti in coltura cellulare, cappotto ciascuno inserire con 100 μL di soluzione, che corrisponde a 10 μg/cm2. Incubare la piastra in un incubatore standard CO di coltura del tessuto2 a 37 ° C per ≥ 2 h, o per comodità, sigillare i bordi della piastra con la pellicola di paraffina e incubare a 4 ° C durante la notte o fino a 1 settimana. 2. isolare enteroids/colonoids da cultura 3D Nota: Enteroids o colonoids sono stabiliti dalle biopsie di donatore e mantenute in coltura 3D secondo protocolli standard descritto in precedenza. 14 , 18 brevemente, cripte vengono raccolte da biopsie intestinali o resezioni tramite chelazione e agitazione meccanica. Le cripte sono lavate, raccolte e placcate in BMM. Media di espansione (descritto al punto 4.2) è aggiunto alla cultura e sostituito ogni 2 giorni. Formazione di cultura 3D è visibile nelle ore dopo il placcaggio. Aspirare il terreno di coltura dalla piastra a 24 pozzetti e sostituire con 1 mL di soluzione raccolta ghiacciata (Vedi Tabella materiali) per pozzetto. Utilizzare un raschietto mini cella per sloggiare e break-up il pellet di matrice della membrana dello scantinato, prestando particolare attenzione a qualsiasi materiale vicino ai bordi ben. Agitare la piastra su agitatore orbitale a circa 200 rpm, 4 ° C per 30-45 min. 3. dissociare 3D enteroids/colonoids Utilizzare una pipetta monocanale P200 o una pipetta multicanale dotato di puntali sterili con filtro per triturare la sospensione cellulare. Piscina il suspension(s) delle cellule in un flaconcino di conico da 15 mL. Utilizzare fiale multiple se il volume di sospensione totale è > 6 mL. Aggiungere un volume equivalente di Advanced DMEM/F12 mezzo contenente 10 mM HEPES, dipeptide L-alanil-L-Glutammina (1x) e penicillina-streptomicina (1x) (lavaggio medio). Capovolgere la provetta 3 – 4 volte per mescolare. Centrifugare a 300 x g, 10 min, 4 ° C. Facoltativamente, aspirare il mezzo di lavaggio e sostituire con 0,5 mL/pozzetto tripsina (Vedi Tabella materiali). Risospendere colonoids con una pipetta P200, richiudere la provetta e posto in un bagno di acqua di 37 ° C per circa 2 min. immediatamente rimuovere il tubo, aggiungere lavaggio medio ad un volume finale di 10 mL, quindi ripetere la centrifugazione come passo 3.3.Nota: Questo passaggio potrebbe essere preferibile se triturazione non si traduce in frammenti di dimensioni. 4. la sospensione di enteroid/colonoid di placcatura Se inserti rivestiti sono stati conservati a 4 ° C, equilibrare in incubatore a 37 °C/5% CO2 coltura tissutale per almeno 30 min prima della placcatura di cella. Per ogni inserimento a essere placcato, prepara 1 mL di terreno di espansione caldo (tra 25-37 ° C) (EM) e aggiunta 10 μM Y-27632 e 10 μM CHIR 99021.Nota: EM è composto di Advanced DMEM/F12 contenente B27 (1x), 50% WNT3A condizionata medio, medio RSPO1 condizionata 15%, 10% Noggin condizionata medio, EGF umano di 50 ng/mL, 500 nM A-83-01, 10 μM SB 202190, antibiotico/antimicotico cocktail (1x), 10 mM HEPES, L-alanil-L-Glutammina dipeptide (1x) e penicillina-streptomicina (1x) (Vedi Tabella materiali). Aspirare il mezzo di lavaggio dal tubo contenente il pellet cellulare e risospendere in un volume di EM sufficienti per produrre almeno 100 μL/inserto. Aspirare la soluzione di collagene IV da ogni inserto e lavare due volte con 150 µ l del mezzo lavaggio per inserto. Dispensare 600 μL di EM nello spazio sotto ogni inserto. Pipettare 100 µ l di sospensione cellulare in ogni inserto. Riporre la piastra nell’incubatore di coltura del tessuto e lasciare riposare per almeno 12 ore.Nota: Evitare di scuotere o acutamente inclinando la piastra per evitare la distribuzione irregolare di frammenti di colonoid sulla membrana inserto. Monitorare l’adesione cellulare e diffusione per formare un monostrato confluente inserendo la piastra su un microscopio ottico a contrasto di fase sotto un 2.5 x-10 x lente dell’obiettivo. Dopo 1-2 giorni, la maggior parte frammenti dovrebbero rispettare la matrice del collagene. Aggiornare il terreno di coltura e interrompere il trattamento con Y-27632 e CHIR 99021. Continuare ad aggiornare il mezzo ogni 2-3 giorni fino a confluenti. Confluency viene generalmente raggiunta in 7-10 giorni. 5. misurare la resistenza elettrica transepiteliale Collegare i cavi degli elettrodi e accendere il voltohmmeter epiteliale (EVOM). Verificare che la funzione di misurazione è impostata su ohm. Immergere le punte dell’elettrodo brevemente in etanolo al 70% e asciugare con un tessuto di laboratorio. Equilibrare l’elettrodo in 5 mL di mezzo di lavaggio per circa 5 min. Immergere la punta dell’elettrodo più corta nel mezzo di inserto e orientare la punta dell’elettrodo più lungo nella piastra ben inferiore. Mantenere l’elettrodo in posizione completamente verticale fino a quando la lettura di EVOM è relativamente stabile, o per non più di 60 s.Nota: Se l’elettrodo è inclinato lontano dalla verticale, o impropriamente all’altezza di punta, la punta più corta può entrare in contatto con e perturbare il monostrato cellulare. Confronta le misure EVOM al valore ottenuto da un inserto senza cellula sommerso nel terreno di coltura per valutare i progressi verso la confluenza o differenziazione. 6. differenziazione dei monostrati confluenti di enteroid/colonoid EM di Exchange per mezzo di differenziazione (DM) e continuare ad aggiornare media ogni due giorni fino al giorno 5. DM è EM che manca WNT3A, RSPO1, A-83-01 e SB 202190. Continuare a monitorare TER per verificare che la differenziazione sta procedendo come previsto. TER continuerà ad aumentare nei giorni 1-5 di differenziazione. Monostrati possono continuare ad aumentare TER e mantenere la redditività oltre 5-6 ° giorno ma esibiscono la massimale e più riproducibili risultati quando utilizzato al giorno 5-6. 7. batterica infezione con commensali o patogeni di Escherichia coli Un giorno prima di compiere l’infezione, lavare e nutrire gli strati monomolecolari con antibiotico-free EM o DM. Utilizzare un ciclo di microbiologia sterile per raschiare la superficie di uno stock di glicerolo batterica congelati e inoculare 2 mL di brodo LB delicatamente. Il tubo di trasferimento ad un livello di agitazione incubatore a 37 ° C per 12-16 h. Diluire 50 μL della cultura starter in 5 mL di brodo fresco di LB (1: 100) e continuare l’incubazione con agitazione per 90 min. Questo produrrà una cultura di fase di log con una densità di 105-106 unità formanti colonie (cfu) / mL. Facoltativamente, confermare la concentrazione batterica tramite la misura di densità ottica a 600 nanometro (OD600) di uno spettrofotometro. Rotazione verso il basso la coltura batterica a 12.000 x g per 10 min, rimuovere il supernatante e risospendere batteri antibiotico-libero EM o DM a una concentrazione finale di 107 cfu/mL. Aggiungere 10 μL di sospensione batterica all’inserto (concentrazione finale 106 cfu/mL). Pipettare lentamente a mescolare e non disturbare lo strato di muco extracellulare. Restituire la piastra per un incubatore di coltura del tessuto per il periodo di infezione desiderata. 8. fissazione per preservare e immunostain muco Ascensore la coltura delle cellule consente di inserire la piastra a 24 pozzetti, invertendo attentamente su una carta velina laboratorio per rimuovere il mezzo apicale e pulire via liquido esterno aggrappato all’inserto. In una nuova piastra a 24 pozzetti, immergere l’inserto in una soluzione di 1:3 di acido acetico glaciale in etanolo assoluto (soluzione di Clarke) per 10 min a temperatura ambiente. Invertire l’inserto per rimuovere il fissativo e reidratare le cellule in 1X PBS per 10 minuti procedere con protocolli standard che immunostaining. Usare una lama di rasoio per tagliare intorno al perimetro della membrana inserto. Trasferire la membrana di un vetrino per microscopio usando il forcipe e apporre un coprioggetto con mezzo di montaggio. 9. preparazione dei lisati cellulari per immunoblotting Nota: Eseguire la procedura seguente sul ghiaccio o in una stanza fredda. Medio di aspirare e lavare inserire una volta con PBS. Aggiungere 150 μL lysis buffer contenente inibitori della proteasi (Vedi tabella materiali) sull’inserto e lasciare riposare 5-10 min buffer di lisi contiene 50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 0,5% sodio desossicolato, 0.1% SDS, inibitore della proteasi di 1: 100 cocktail. Usate un raschietto mini cella per rimuovere le cellule dall’inserto, quindi utilizzare una pipetta P200 per triturare brevemente la sospensione e il trasferimento ad un tubo del microcentrifuge. Sottoporre ad ultrasuoni la sospensione con 5 x 1 s Pulse ampiezza 20% con un microtip sonda (Vedi Tabella materiali). Aggiungere tampone di caricamento SDS-PAGE, se si esegue immediatamente l’elettroforesi, o aliquota e memorizzare lisati a-20 ° C.

Representative Results

Culture umane di enteroid e colonoid sono cresciute come strutture 3D, poi dissociate e frammentate per placcatura su inserti di cultura cellulare rivestite con IV collagene umano. Lo stato di avanzamento della formazione dello strato monomolecolare facilmente monitorato su base giornaliera tramite microscopia del campo luminoso, immunofluorescenza che macchia (Figura 1) e da un costante aumento nella resistenza elettrica transepiteliale (TER) (Figura 2), che riflette la permeabilità delle giunzioni strette a ioni e correla con la confluenza dello strato monomolecolare. Il TER di un inserto di 24 pozzetti vuoto è di circa 50-100 Ω·cm2e dopo aver raggiunto la confluenza aumenta a circa 400-500 Ω·cm2. Tutte le cellule epiteliali in monostrati confluenti sono collegate da complessi giunzionali rilevati dall’anello F-actina nel perimetro della cella (Figura 1). Monostrati in piena crescita fattore media rappresentano l’epitelio cripta-come proliferativa composto principalmente da attivamente divisione delle cellule che incorporano i nucleosidi analogici EdU (Figura 2). Ritiro dei fattori di crescita WNT3A e RSPO1 promuove la differenziazione, che conduce alle culture del villo-come privi di cellule proliferanti. Monostrati differenziati contengono enterociti (enteroids) o colonocytes (colonoids) e sviluppano le cellule epiteliali intestinali specializzate come è stato dimostrato in 3D culture,18 compreso le cellule di calice ed enteroendocrine. 15 strati monomolecolari differenziato anche dimostrano un significativo aumento in TER (> 1000 Ω·cm2) (Figura 2), che indica mature giunzioni strette. In fisiologia umana normale, lo strato epiteliale intestinale separa le sostanze nutrienti e lo spazio di luminal microbo-arricchita dall’ambiente serosal sterile. L’epitelio regola strettamente il cross-talk tra questi due compartimenti. Enteroid e colonoid gli strati monomolecolari preservare questa proprietà di compartimentalizzazione importante come dimostra l’analisi di proteomica in tabella 1. Ci sono differenze sostanziali tra la composizione della proteina in apicale e basolaterale condizionata media raccolti da monostrati enteroid differenziato. Accesso a entrambi i lati apicali e basolaterale permette di collezione di entrambi i surnatanti in modo dipendente dal tempo per la misurazione della secrezione differenziale di altre molecole come le citochine e chemochine. 15 , 17 Gli strati monomolecolari sono conveniente e altamente riproducibili modelli per rilevare i cambiamenti nell’espressione della proteina mediante immunoblotting e immunostaining. Così, cambia in mucina 2 (MUC2) espressione di shRNA atterramento (KD) può essere rilevato utilizzando entrambe le tecniche (Figura 3). La trasduzione di shRNA è stata eseguita su 3D colonoids e mantenuta in media selezione antibiotica. Dopo aver verificato il KD, colonoids può essere continuamente mantenuto come culture 3D o placcato come strati monomolecolari per scopi sperimentali. Inoltre, MUC2 KD non pregiudica l’efficienza della formazione dello strato monomolecolare rispetto alla linea parentale colonoid wild-type. Collezione di monostrati per immunoblotting è semplice e simile ai protocolli descritti per le linee di cellule epiteliali umane dell’adenocarcinoma-derivato. In genere, circa 50 µ g o più di proteine totali può essere estratta da un monostrato di inserto-cresciuta di singolo 0,33 cm2 . Come mostrato nella Figura 3, MUC2 è appena rilevabile negli strati monomolecolari di colonoid (UD) WT indifferenziati ma è altamente espressa negli strati monomolecolari WT (DF) differenziati. MUC2 è di sotto del livello di rilevazione negli strati monomolecolari della colonoid sia UD e DF trasformata con shRNA MUC2. Importante, monostrati sono un modello adatto per studiare le interazioni ospite-microbica sulla superficie apicale del epithelia. Colonoid monostrati formano uno spesso strato di muco MUC2-positiva associato al momento di differenziazione che non è facilmente pervaso da commensal batteri Escherichia coli HS (Figura 4), simili a quello che è stato suggerito nel colon umano normale. 19 tuttavia, enteroemorragica e. coli enteroemorragico (EHEC), un agente patogeno umano del colon, ha dimostrato di avere la capacità di distruggere lo strato di muco associata MUC2-arricchita per raggiungere la superficie apicale dell’epitelio (Figura 4). 14 , 20 restanti MUC2 solo è presente all’interno delle cellule di calice. Figura 1: Istituzione di umani monostrati di enteroid/colonoid. (A) esempio di colonoid frammenti dopo la dissoluzione del BMM e triturazione. (B) esempio di inserimento immediatamente dopo il placcaggio colonoid frammenti. Scala bar (A-B) = 200 μm. Proiezione di intensità massima rappresentante (C) e (D) confocale ottico Z-sezione con le proiezioni ortogonali corrispondenti mostrano che colonoid frammenti seminate su collagene umano rivestite con IV filtri forma le isole più monostrato 2-4 giorni post-semina. Aree senza cellula (asterisco) sono identificabili dall’assenza di entrambi nucleare (Hoechst 33342, blu) e apicale F-actina (falloidina, verde) colorazione sia C e D. rappresentante proiezione di massima intensità (E) ed (F) confocale ottico sezione con le proiezioni ortogonali corrispondenti mostrano un monostrato confluente colonoid con superficie apicale continua rilevato di F-actina immunostaining circa 1 settimana post-semina. (G) ad alto ingrandimento di un rappresentante di intensità massima proiezione e sezione ottica confocale (H) con le corrispondenti proiezioni ortogonali mostrano che le cellule negli strati monomolecolari confluenti colonoid formano il perijunctional di F-actina anelli (freccia bianca) e un bordo di spazzola apicale immaturi (teste di freccia gialla). Scala bar (C-H) = 20 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: valutazione di differenziazione enteroid/colonoid monostrato. (A) EdU (rosso) incorporazione dimostra una progressiva perdita di proliferazione durante la differenziazione dello strato monomolecolare del digiuno. (B) medio TER misure negli strati monomolecolari confluenti del digiuno in mezzo di espansione o di differenziazione. Barre di errore rappresentano SEM. UD, indifferenziato; DF, differenziato. I numeri corrispondono ai giorni sotto la condizione specificata; UD1 era il primo giorno di confluency, circa 1 settimana dopo la semina. (C) gli strati monomolecolari digiunale UD hanno cellule ampie, più brevi e un bordo di meno-mature apicale spazzola di actina-basato di strati monomolecolari DF 5 giorno del digiuno. Scala bar (A, C) = 50 μm. Tutti gli strati monomolecolari erano raffigurati almeno 1 settimana post-semina ed erano confluenti prima dell’inizio di differenziazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Colonoids di tipo selvaggio e shRNA trasdotte atterramento (KD) colonoids ogni monostrati confluenti forma. (A) immagini rappresentative di monostrato confluente umano colonoid wild type (WT) differenziano per 5 giorni e (B) allo stesso modo coltivato monostrati derivata da culture colonoid MUC2 KD. Scala bar (A-B) = 50 μm (C) rappresentante immunoblot di culture colonoid trasformate con shRNA strapazzata o shRNA MUC2 dimostra che i cambiamenti nell’espressione di proteine a causa di KD possono essere quantificati da immunoblot. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Enteroid/colonoid monostrati sono modelli adatti per studiare le interazioni di luminal microbo-host. (A) intensità massima rappresentante proiezione e sezione ottica ortogonale di un monostrato di colonoid viene illustrato lo spesso strato di muco apicale MUC2-positivo che non è permeabile ad Escherichia coli HS (frecce nere) seduto presso il muco apicale superficie. Il monostrato è stato infettato per 6 ore con 106 cfu/mL HS. (B) proiezione intensità massima rappresentante di colonoid umano monostrato apically infettato da EHEC (106 cfu/mL, 6 ore). Scala bar (A-B) = 50 μm. (C) misure di intensità di MUC2 immunofluorescenza mostrano una diminuzione significativa in MUC2 negli strati monomolecolari colonoid EHEC-infettati rispetto ai comandi non infetti. Barre di errore rappresentano SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Proteina Numero di accessione Abbondanza di peptide Basolateral Media proteina legante dell’acido grasso, fegata [Homo sapiens] NP_001434.1 1299 profilina-1 [Homo sapiens] NP_005013.1 797 precursore dell’apolipoproteina A-IV [Homo sapiens] NP_000473.2 744 ecto-ADP-queuine 4 precursore [Homo sapiens] NP_066549.2 633 gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi isoforma 1 [Homo sapiens] NP_002037.2 (+ 1) 616 serotransferrin precursore [Homo sapiens] NP_001054.1 (+ 1) 572 precursore di vitamina D-legante della proteina isoforma 3 [Homo sapiens] NP_001191236.1 (+ 2) 567 catalasi [Homo sapiens] NP_001743.1 427 agrina isoforma 1 precursore [Homo sapiens] NP_940978.2 (+ 1) 377 lactotransferrin isoforma 1 precursore [Homo sapiens] NP_002334.2 (+ 1) 262 Apicale Media precursore di fattore 3 trifoglio [Homo sapiens] NP_003217.3 326 precursore di fattore 1 di trifoglio [Homo sapiens] NP_003216.1 304 specifiche della membrana dello scantinato eparan solfato proteoglicano nucleo proteina isoforma un precursore [Homo sapiens] NP_001278789.1 (+ 3) 303 filamina-B isoforma 1 [Homo sapiens] NP_001157789.1 (+ 2) 240 precursore di fattore 2 trifoglio [Homo sapiens] NP_005414.1 182 eliminati nel precursore di cerebrale maligno tumori 1 proteina isoforma b [Homo sapiens] NP_015568.2 (+ 3) 169 cheratina, tipo II del citoscheletro 1 [Homo sapiens] NP_006112.3 157 miosina-9 [Homo sapiens] NP_002464.1 150 aminopeptidasi N precursore [Homo sapiens] NP_001141.2 (+ 1) 145 agrina precursore [Homo sapiens] NP_940978.2 (+ 1) 112 Tabella 1. Un elenco parziale dei peptidi identificati tramite spettrometria liquida di cromatografia/tandem massa in apicale e basolaterale fluidi campionati da differenziato strati monomolecolari del digiuno.

Discussion

I parametri critici per la formazione di successo di enteroid/colonoid monostrati includono 1) sano, proliferando 3D culture come materia prima; 2) ricoprire la superficie di inserto di cultura cellulare con collagene umano IV prima del monostrato semina; 3) frammentazione del 3D culture meccanicamente o enzimaticamente, ma non a livello della singola cellula.

Durante l’isolamento di 3D enteroids/colonoids, la velocità di agitazione ottima può variare a seconda del diametro di rotazione di un modello dato shaker. L’intento è non solo agitare la piastra per una miscelazione efficiente, ma anche evitare spruzzi la sospensione cellulare sul coperchio della piastra o in pozzetti adiacenti. Periodi di incubazione di < 30 min possono produrre residui BMM aggrappato alle cellule, che possono ostacolare l'attaccamento e la formazione di strati monomolecolari della cellula uniforme quando placcato su inserti. Incubazione estesa (≥ 1h) resa di attuabilità delle cellule significativamente in diminuzione.

Il grado di triturazione per dissociare 3D enteroids/colonoids necessaria può variare con destrezza di rigidità e utente di pistone. L’esame periodico del contenuto bene su un microscopio ottico a contrasto di fase è consigliabile per determinare frammento uniformità durante la triturazione, con l’obiettivo di circa 30 celle per frammento. In luogo di o oltre a triturazione, la sospensione può essere digerita brevemente con tripsina per ottenere più piccoli frammenti uniforme. Digest di tripsina può essere desiderabile se monostrati contengono una grande percentuale di 3D-come le strutture tra un altrimenti singolo strato epiteliale. Tuttavia, dissociazione di singole cellule non è desiderabile come questo riduce significativamente l’attuabilità delle cellule. Un pozzo di enteroids/colonoids coltivate in una gocciolina BMM 35 μL sarà generalmente sufficiente per popolare 2-3 inserti, ma questo fattore può variare a seconda del numero e la dimensione media di enteroids/colonoids.

Colonoid monostrati possono assorbire un volume considerevole del mezzo apicale come si differenziano. Questo può essere aggirato mediante l’applicazione di ulteriori DM alla camera di inserto superiore (150-200 μL), anche se parziale essiccazione della camera superiore non sembra influenzare negativamente la redditività dello strato monomolecolare o funzione nelle analisi a valle. Dopo circa 4-5 giorni di differenziazione, colonoid monostrati sviluppano muco extracellulare che può essere visibile come materiale di spessore/gelatinoso sulla superficie delle cellule dopo l’attenta aspirazione del DM.

Per l’interazione con lo strato esterno muco EHEC, usiamo ordinariamente il periodo di titolo ed incubazione batterico specificato nel protocollo. Tuttavia, unici ceppi batterici inizialmente devono essere analizzati a più concentrazioni e periodi di incubazione per determinare i parametri appropriati per l’effetto desiderato.

Durante la fissazione di muco, aspirando il mezzo apicale probabilmente rimuoverà la maggior parte del livello extracellulare muco non collegato. Pertanto, è importante a riversare attentamente il mezzo. Se il supporto è mantenuto nell’inserto dalla tensione superficiale, è possibile utilizzare l’angolo di un fazzoletto di carta piegato laboratorio per rompere la tensione superficiale e stoppino via la maggior parte del mezzo. Dopo la fissazione e colorazione, lo strato di muco può essere sloggiato involontariamente o appiattito mentre montaggio un coprioggetto sopra l’inserimento del filtro. Per mantenere l’altezza di muco, posizionare il filtro su una goccia di supporti di montaggio e posizionare con cura il coprioggetto sul filtro. Non toccare o premere giù il coprioggetto come questo può appiattire significativamente lo strato di muco.

Per formare un monostrato polarizzato da cellule in coltura 3D, è necessario per riprodurre l’interazione tra le integrine di membrana basolaterale delle cellule epiteliali intestinali e proteine della matrice extracellulare (ECM). Laminina, collagene IV, fibronectina e una matrice di proteoglicani costituiscono l’ECM epiteliale intestinale. 21 , 22 abbiamo confrontato umano cellule derivate laminina, fibronectina, collagene IV e BMM murino-derivati come inserto rivestimenti. Solo collagene IV supportato la formazione di stabili, a lungo termine (fino a 4 settimane) monostrati confluenti di enteroid/colonoid (figure 1-2). Piccole macchie di crescita simil-monostrato sono stati ottenuti su ciascuna delle altre matrici testati, ma queste regioni non è riuscito a progredire al confluency. Uso di collagene umano IV come il surrogato di ECM ha un certo numero di vantaggi. BMM derivato da Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) cellule di sarcoma murino non sono di origine umana, mentre il collagene umano IV è commercialmente disponibile e generalmente più conveniente. Inoltre, il BMM è una miscela complessa delle proteine con variabilità intrinseca e può contenere i fattori di crescita secernuti dal sarcoma che influenzano l’espressione genica. 23

Interazioni tra cellule epiteliali intestinali e l’ECM sottostante in restituzione epiteliale intestinale è ancora in modo incompleto capiti. L’importanza del collagene IV, ma non laminin, come un ligando di adesione per i colonocytes umani24 e rinforzatore della cripta intestinale delle cellule epiteliali restituzione25 è stato suggerito usando gli anticorpi contro il collagene IV che ha impedito di allegato . Epiteliale-espresso β1-integrina sembra essere importante per l’interazione di ECM, come un anticorpo specifico per β1-integrina bloccato significativamente l’adesione dei colonocytes di tipo collageno di IV. 24 mentre collagene IV fornisce un affidabile ECM per enteroid/colonoid monostrato formazione sugli inserti, epiteliali rimodellamento dell’ECM nel corso del tempo non è ancora stata valutata in questo modello, né ha l’influenza di miscele di ECM più complesse e definite di collagene IV, laminina e fibronectina.

Umana enteroids/colonoids in formato monostrato (figure 1-4) consentire manipolazioni e campionamento che sarebbe ingombrante o impossibile da realizzare utilizzando 3D incorporati matrice culture. 3D enteroids/colonoids variano in dimensione, complessità strutturale e luminal volume, e così microinjection dei microbi o piccole molecole sono difficili da quantificare con precisione. Inoltre, in contrasto con gli strati monomolecolari (tabella 1), 3D culture impediscono l’accesso diretto su entrambe le superfici luminale e basolaterale per misurare ioni, sostanze nutritive, citochine o secreti fattori associati ai processi fisiologici o patofisiologici . Confluency (figure 1-2) è una delle proprietà principali di strato monomolecolare del enteroid/colonoid necessaria per stabilire non solo i gradienti fisiologici delle sostanze nutrienti, ioni e altre macromolecole,16 ma anche la creazione della barriera corretta tra il microbiota luminal e ambienti serosal popolate delle cellule mesenchimali/immunitario sterili. Questi aspetti sono importanti da considerare per gli studi futuri che incorporano monostrati di enteroid/colonoid con tipi di cellule mesenchimali, immuni o neuronale per costruire modelli fisiologici più complessi.

Noti limitazioni del modello di inserto cultura cellulare descritto qui includono mancanza di forze fisiche come fluido shear stress e tratto/compressione meccanica (peristalsi) e l’assenza di un ambiente anaerobico apicale normalmente vissuto da intestinale epiteli in vivo. Questi elementi hanno il potenziale per essere affrontato con più sofisticate piattaforme di microphysiological,26 , ma richiedono anche ulteriori spese, attrezzature e competenze per implementare. Colture monostrato e 3D sono anche senza interazioni con o contributi dal microbioma intestinale, popolazioni di cellule stromali e il sistema immunitario a meno che questi componenti sono volutamente aggiunto.

Applicazioni future di strato monomolecolare del enteroid/colonoid il collagene IV-rivestito cella cultura inserti possono includere altri studi di interazione microbica patogena o commensale, l’assorbimento del farmaco o sostanza nutriente, tossicità, metabolismo e funzione di barriera e funzionale potenziamento catalizzata dalla co-cultura con tipi aggiuntivi delle cellule intestinali. Valutazioni possono essere realizzate solo all’interno di epiteli di donatori sani, ma anche da individui con mutazioni genetiche o disturbi intestinali, purché i fenotipi in vivo sono stabiliti sia conservato nei ex vivo enteroid/colonoid cultura.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Quest’opera è stata sostenuta da sovvenzioni NIH P01 AI125181, K01 DK106323 (JGI) e K01 DK113043 (JFA). Ringraziamo James Kaper (Università del Maryland, Baltimora, MD, USA) per la fornitura di e. coli ceppo HS ed EHEC. Riconosciamo anche la fisiologia integrata e Imaging Core della base malattia digestiva Hopkins Conte e traduzione Research Core Center (P30 DK089502) e la spettrometria di massa di Johns Hopkins e Proteomics Core.

Materials

2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol Sigma T4661 Tris base, Component of lysis buffer
A-83-01 Tocris 2939 ALK4/5/7 inhibitor
Acetic acid, glacial Fisher Scientific A38
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634-010 Component of growth medium
Alexa Fluor 488 phalloidin Life Technologies A12379 Fluorescent probe for F-actin
Antibiotic/antimycotic cocktail Invivogen ant-pm-2 Primocin (100x)
B27, 50x Life Technologies 17504-044 Component of growth medium
Cell culture inserts Corning 3470 Transwell, PET membrane, 0.4 μm pore, 24-well plate
CHIR 99021 Tocris 4423 GSK3β inhibitor
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit Life Technologies C10639
Collagen IV, from human placenta Sigma C5533
Cultrex Organoid Harvesting Solution Trevigen 3700-100-01 Depolymerizes basement membrane matrix
Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) Kaper lab, University of Maryland
Epithelial voltohmmeter World Precision Instruments EVOM2
Epithelial voltohmmeter electrode World Precision Instruments STX3
Escherichia coli strain HS Kaper lab, University of Maryland
Ethanol, absolute Pharmco 111000200
FluorSave mounting medium Millipore 345789 For mounting insert membrane on microscope slide
GlutaMAX Life Technologies 35050-061 L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 200 mM
HEK293T/Noggin-Fc cell line van den Brink lab, Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research For production of Noggin conditioned medium
HEK293T/RSPO1-Fc-HA cell line Trevigen 3710-001-K For production of Rspondin-1 conditioned medium
HEPES, 1 M Life Technologies 15630-080 Component of growth medium
Heraeus Multifuge X1R Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004250
Hoechst 33342 Life Technologies H3570 Fluorescent nuclear dye
Human epidermal growth factor (EGF) R&D Systems 236-EG-01M Component of growth medium
IGEPAL CA-630 Sigma I8896 Component of lysis buffer
Inverted cell culture light microscope Olympus CKX51
LB broth EMD Millipore 1.10285.0500
L-WNT3A cell line ATCC CRL-2647 For production of Wnt3a conditioned medium
Matrigel, growth factor reduced Corning 356231 Basement membrane matrix for 3D culture
Mini cell scraper United BioSystems MCS-200
MUC2 antibody, mouse monoclonal Abcam ab11197 Use at 1:100 for immunostaining, 1:500 for immunoblotting
MUC2 shRNA lentiviral particles GE Dharmacon RHS4531 GIPZ lentiviral shRNA, ID: 4583
Orbital shaker Grant Instruments PSU-10i
Penicillin-streptomycin, 100x Life Technologies 15140-122 Component of growth medium
Phosphate buffered saline Corning 21-031
Probe sonicator with microtip Branson Ultrasonics 450
Protease inhibitor cocktail for mammalian cells Sigma P8340 Component of lysis buffer
SB 202190 Tocris 1264 p38 MAPK inhibitor
Sodium chloride Sigma S3014 Component of lysis buffer
Sodium dexoycholate Sigma D6750 Component of lysis buffer
Sodium dodecyl sulfate Sigma L3771 Component of lysis buffer
TrypLE Express, 1x Life Technologies 12605-010 Trypsin, for digesting enteroid/colonoid fragments
Vinculin antibody, rabbit monoclonal Abcam ab129002 Use at 1:1000 for immunoblotting
Water, tissue culture grade, sterile filtered Corning 25-055
Y-27632 Tocris 1254 RhoA/ROCK inhibitor
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Referências

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In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium. J. Vis. Exp. (146), e59357, doi:10.3791/59357 (2019).
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