Bir In vitro 3D model ve hesaplamalı boru hattı PSC-türetilen endotel progenitors Vazculogenik potansiyelini ölçmek için
Summary
İndüklenen pluripotent kök hücrelerinden (IPSC-EPs) elde edilen endotel progenatörler, kardiyovasküler hastalık tedavilerinin devrimleştirilmesi ve daha sadık kardiyovasküler hastalık modellerinin oluşturulmasını sağlamak için potansiyele sahiptir. Burada, üç boyutlu (3D) kollajen mikroortamlarda IPSC-EPs kapsülleme ve bu hücrelerin vasculogenik potansiyelinin nicel Analizi açıklanmıştır.
Abstract
İndüklenen pluripotent kök hücreleri (iPSCs), herhangi bir somatik hücre tipine ayırt edilebilir bir hastaya özgü, proliferatif hücre kaynağıdır. Olgun, fonksiyonel damar montajı için gerekli hücre türlerine ayırt edilebilir bipotent endotel ataları (EPS), embriyonik ve indüklenen pluripotent kök hücrelerden elde edilmiştir. Ancak bu hücreler, üç boyutlu ortamlarda titizlikle değerlendirilmemiştir ve vasculogenik potansiyelinin nicel bir ölçüsüdür zor kalır. Burada, floresan-aktif hücre sıralama yoluyla IPSC-EPs üretimi ve yalıtım ilk özetlenmiştir, kollajen Hidrojeller içinde IPSC-EPs kapsülleme ve kültürün bir açıklamasını izledi. Bu hücre dışı matris (ECM)-mikroortamı taklit etmek, sağlam bir vasculogenik tepkisi teşvik eder; Kültür bir hafta sonra vasküler ağlar formu. Bu vasculogenik yanıtı ölçmek için açık kaynaklı yazılım kullanan bir hesaplama boru hattı oluşturulması belirlendi. Bu boru hattı özellikle dalların sayısını, dallanma noktalarını ve minimum kullanıcı girişine sahip toplam ağ uzunluğunu belirlemek için kılcal plekpların 3D mimarisini korumak için tasarlanmıştır.
Introduction
İnsan göbek ven endotel hücreleri (huvecs) ve diğer primer endotel hücre tipleri iki yıldır kan damar çimlenme ve geliştirme in vitro1model için kullanılmıştır. Bu tür vasküler platformlar kardiyovasküler hastalığın moleküler ve doku seviyesi mekanizmalarını aydınlatmaya söz verir ve ilkel vasküler ağlar2,3‘ ün gelişmesine fizyolojik anlayış sunabilir. Vasküler modelleme alanı önemli gelişmeler tanık olmasına rağmen, niceliksel olarak model ve fizyolojik vasküler gelişimi değerlendirmek olabilir bir “altın standart” tahlil zor kalır. En çok yayınlanan protokoller, Olgun, fonksiyonel kan damarlarının oluşumunu teşvik etmek için damar niş veya niceliksel olarak değerlendirilen hücre türlerinin vasculogenik potansiyelini üç boyutta karşılaştırmak için bir yöntem yok yeterli özetlemek yok ( 3D).
Birçok mevcut damar modelleri fizyolojik vasküler niş taklit yeteneğini sınırlıdır. En sık kullanılan in vitro platformlardan biri jelatinli protein karışımı bazlı tüp oluşumu tahlil olduğunu. Kısaca, huvecs, murine sarkomu ekstrellüler matrisinden (ECM) hasat edilen proteinlerden oluşan ince bir jel katmanında tek hücreler olarak toplanır; bir ila iki gün içinde, HUVECs kendi kendine ilkel tüpler içine monte4. Ancak, bu süreç iki boyutlu oluşur (2D) ve endotel hücreleri (ECs) bu tahlil içinde kullanılan kapalı formu yok, boş lümen, böylece bu çalışmaların fizyolojik önemini sınırlandırmak. Daha yakın zamanda, ECS ve destekleyici hücreler (örn., mezenkimal kök hücreler (MSCS) ve perikayt), yerel ECM ‘nin fibröz mimarisini simüle eden, kollajen veya fibrin hidrojellerin5gibi 3D mikro ortamlarda ortak kültürlü olmuştur. Bu mikroortamda vasküler gelişimi modellemek için, ECs ile kaplı polimerik boncuk genellikle6istihdam edilmektedir. Eksojen büyüme faktörleri ve/veya büyüme faktörleri interstitially hidrojel gömülü diğer hücreler tarafından salgılanan ek ECS, kaplama polimerik boncuklar, filiz ve tek lümen oluşturmak için; lahanası ve damarların sayısı ve çapı daha sonra hesaplanabilir. Ancak, bu lahanası tekil ve fizyolojik koşullarda görülen ve böylece daha fazla bir tümör damar modeli anımsatan bir kapalı, bağlı ağ oluşturmayın. Mikrofluidik cihazlar da vasküler niş taklit ve ak-yüklü Hidrojeller7,8damar oluşumunu teşvik etmek için kullanılmıştır. Genellikle, bir anjiyojenik büyüme faktörü-gradyan ak göç ve sprouting teşvik etmek için dolaşım hücre kültür ortamına uygulanır. Geliştirilen damarların lümeni oluşturan ECs, mikrofluidik cihazla sıvı akışının uygulanması ile indüklenen kesme stresine duyarlıdır; Bu nedenle, bu mikrofluidik cihazlar statik modellerde erişilmeyen anahtar fizyolojik parametreleri yakalar. Ancak, bu cihazlar pahalı mikroimalat yetenekleri gerektirir.
En önemlisi, üç vasküler model (2D, 3D, microfluidic), birincil ECs ‘nin yanı sıra primer destek hücresi tiplerini de ezici bir şekilde kullanır. Hücreler implantasyon üzerine bağışıklık tepkisi doğuracak çünkü Primer hücreler etkili bir kardiyovasküler tedavi haline olamaz; Ayrıca, HUVECs ve benzer primer hücre tipleri hasta spesifik değildir ve genetik bir eğilim veya önceden mevcut sağlık koşulları, örneğin, diabetes mellitus olan hastalarda meydana Vasküler anomaliler yakalamak değil. İndüklenen pluripotent kök hücreler (iPSCs) insan vücudunda tüm somatik hücrelere ayırt edilebilir bir hasta spesifik, proliferatif hücre kaynağı olarak son on yıl içinde ortaya çıkmıştır9. Özellikle, protokollerin oluşturulması ve IPSC-türetilen endotel ataları (IPSC-EPS)10,11; IPSC-EPs bipotent ve olabilir, bu nedenle, daha fazla endotel hücreleri ve pürüzsüz Kas hücreleri/perikayt, Olgun, fonksiyonel damar yapı taşları ayırt edilebilir. Sadece bir çalışma, bir 3D mikro12‘ de IPSC-EPS ‘ d a k i primer kapiller plekpmanın gelişimini inandırıcı bir şekilde ayrıntılıdır; Bu çalışma, IPSC-EP montajının ve doğal ve sentetik hidrojellerin farklılaşması açısından kritik öneme sahip olsa da, elde edilen damardaki ağ topolojilerini niceliksel olarak karşılaştırmadı. Başka bir son çalışma huvecs ve IPSC-türetilen ECS5çimlenme karşılaştırmak için polimerik boncuk modeli kullandı. Bu nedenle, 3D mikro ortamlarda IPSC-EP vaskülojenez düzenleyen fiziksel ve kimyasal sinyalizasyon mekanizmaları daha fazla aydınlatmak ve bu hücrelerin iskemik tedavi ve kardiyovasküler hastalık için uygun olup olmadığını belirlemek için net bir ihtiyaç vardır Modelleme.
Son on yıl içinde, vasküler ağ uzunluğunu ve bağlantısını ölçmek ve karşılaştırmak için farklı açık kaynaklı Hesaplamalı boru hatları ve çerçeve yapısı çıkarma algoritmaları geliştirilmiştir. Örneğin, charwat et al. bir fibrin matriks13,14, Adipose türetilen kök hücreleri ve büyüme ECS bir Co-kültürü türetilen vasküler ağlar süzülmüş, binarized görüntü ayıklamak için bir Photoshop tabanlı boru hattı geliştirdi. Belki de en yaygın olarak kullanılan topoloji karşılaştırma aracı AngioTool, Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından online yayınlanan bir program15; programın yaygın kabulü ve iyi belgelenmiş sadakat rağmen, program iki boyut ve diğer programlar, AngioSys ve Wimasis de dahil olmak üzere gemi benzeri yapıları analiz sınırlıdır, pay aynı dimensionality sınırlama16. Imaris, Lucis ve MetaMorph gibi güçlü yazılım paketleri, mühendislik microvasculature ağ topolojisini analiz etmek için geliştirilmiştir; Ancak, bu süitler en akademik laboratuvarlar için maliyet-yasaktır ve kaynak koduna erişimi sınırlamak, hangi Son Kullanıcı yeteneğini kendi özel uygulama algoritması özelleştirmek için engel olabilir. 3D dilimleyici, bir açık kaynak manyetik rezonans görüntüleme/bilgisayarlı tomografi paketi, etkili 3D vasküler ağlar topolojisi analiz edebilir bir vasküler modelleme Toolkit içerir17; Ancak, analiz Kullanıcı el ile büyük bir veri kümesi analiz ederken sıkıcı hale gelebilir ve kullanıcının bilinçaltı önyargıları tarafından etkilenebilir ağın son noktaları yerleştirerek bağlıdır. Bu yazıda, 3D vasküler ağları ölçebilir bir hesaplama boru hattı ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Yukarıdaki özetlenen sınırlamaları aşmak için, bu açık kaynak hesaplama boru hattı, 3B hacmi bir iskelet analizörüne yüklemek için elde edilen Konfokal görüntüleri önceden işlemek için ımagej kullanır. İskelet analizörü, paralel bir medial eksen inceltme algoritması kullanır ve aslen Kerschnitzki ve Al tarafından geliştirilmiştir. osteosit ağlarının uzunluğunu ve bağlantısını analiz etmek18; Bu algoritma, mühendislik microvasculature uzunluğu ve bağlantı karakterize etmek için etkili bir şekilde uygulanabilir.
Tamamen, bu protokol 3D mikroortamlarda mikrovasküler ağlar oluşturulmasını özetliyor ve kolayca IPSC-EPs vasculogenik potansiyelini karşılaştırmak için bir açık kaynak ve Kullanıcı-önyargı ücretsiz hesaplama boru hattı sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, üç hücre kültürü ortamındaki hücrelerin uzun vadeli kültürünü içerir: E8, LaSR basal ve EGM-2. Bu nedenle, tüm malzemeleri uygun sterilize etmek için büyük bir özen yapılmalıdır. Laboratuvarın laminar akış kaputunda çalışırken Ayrıca, laboratuar Mont ve etanol temizlenmiş eldiven her zaman giyilmelidir. Sık Mikoplazma kontaminasyonu için test edilmesi tavsiye edilir; IPSC kültürü sırasında büyük miktarda enkaz gözlenirse veya farklılaşma verimliliğinde ani bir düş…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Amerikan Kalp Derneği (hibe numarası 15, 25740035, J.Z.), Ulusal Sağlık Enstitüsü Biyomedikal görüntüleme ve Biyomühendislik (NıBıB) Ulusal sağlığı (Grant numarası EB007507, C.C. tarafından verilir) tarafından destekleniyordu ve Rejeneratif rehabilitasyon araştırmaları & eğitimi (AR3T, Grant numarası 1 P2C HD086843-01, J.Z. ‘ a verilir) için Ittifak. Prof. Jeanne Stachowiak ‘ı (Austin ‘deki Texas Üniversitesi) Konfokal mikroskopiye yönelik teknik tavsiyelerini kabul etmek istiyoruz. Biz de Samuel Mihelic (Austin University of Texas), Dr Alicia Allen (Texas University of Austin), Dr Julie Rytlewski (Adaptive Biotech) ve Dr Leon Bellan (Vanderbilt Üniversitesi) ile tartışmalar için minnettarız 3B ağların Hesaplamalı analizi. Son olarak, ISC-EPs içine iPSCs ayrım hakkında onun tavsiyesi için Dr Xiaoping Bao (Kaliforniya Üniversitesi, Berkeley) teşekkür ederiz.
Materials
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | N/A | A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging |
| 96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile | Corning | 7007 | Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Scientific | 12634010 | The base media for iPSC-EP differentiation. |
| Barnstead GenPure xCAD Plus | Thermo Fisher Scientific | 50136165 | Water purification system; others can be readily substituted |
| Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture | Fisher Scientific | A8412 | To preserve cell viability when FACs sorting |
| CD34-PE, human (clone: AC136) | Miltenyi Biotec | 130-098-140 | Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs |
| CHIR99021 | LC Laboratories | C-6556 | Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells |
| Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg | VWR | 354249 | Main component of the 3D microenvironment |
| Conical centrifuge tubes (15/50 mL) | Fisher Scientific | 14-959-49D/A | Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | To counterstain and visualize cell nuclei |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-250 | To wash monolayer cultures |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E8008 | For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | Promotes endothelial cell viability and proliferation |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For maintenance of pluripotent stem cells |
| Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT) | Sigma-Aldrich | 50046 | Neutralizes remaining detergent |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95% | Sigma-Aldrich | A8960 | Component of iPSC-EP differentiation medium |
| MATLAB | MathWorks | 1.8.0_152 | Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions) |
| Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture) | Fisher Scientific | 356231 | Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation |
| Medium-199 10X | Thermo Fisher Scientific | 1825015 | Used to balance final hydrogel osmolarity and pH |
| Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | VWR | 87003-294 | Stores small volumes of reagents |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | The main ingredient of the immunostaining solutions |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument |
| Recombinant Human VEGF 165 Protein | R&D Systems | 293-VE | Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis |
| Rhodamine phalloidin | Themo Fisher Scientific | R415 | To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks |
| Triton X-100 (nonionic surfactant) | Sigma-Aldrich | X-100 | Detergent used to gently permeabilize cells |
| Tween-20 (emulsifying reagent) | Fisher Scientific | BP337 | Increases the binding specificity of the added antibodies |
| VE-Cadherin (F-8) | Santa Cruz Biotechnology | sc-9989 | To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels |
| Vitronectin | ThermoFisher | A14700 | For maintenance of pluripotent stem cells |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded |
Referências
- Wang, K., Lin, R. -. Z., Melero-Martin, J. M. Bioengineering human vascular networks: trends and directions in endothelial and perivascular cell sources. Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-19 (2018).
- Kant, R. J., Coulombe, K. L. K. Integrated approaches to spatiotemporally directing angiogenesis in host and engineered tissues. Acta Biomaterialia. 69, 42-62 (2018).
- Briquez, P. S., Clegg, L. E., Martino, M. M., Mac Gabhann, F., Hubbell, J. A. Design principles for therapeutic angiogenic materials. Nature Reviews Materials. 1 (1), 1-15 (2016).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: State of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
- Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures. Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).
- Nakatsu, M. N., et al. VEGF121 and VEGF165 regulate blood vessel diameter through vascular endothelial growth factor receptor 2 in an in vitro angiogenesis model. Laboratory Investigation. 83 (12), 1873-1885 (2003).
- Shamloo, A., Heilshorn, S. C. Matrix density mediates polarization and lumen formation of endothelial sprouts in VEGF gradients. Lab on a Chip. 10 (22), 3061 (2010).
- Jeon, J. S., et al. Generation of 3D functional microvascular networks with human mesenchymal stem cells in microfluidic systems. Integrative Biology. 6 (5), 555-563 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Kusuma, S., Macklin, B., Gerecht, S. Derivation and network formation of vascular cells from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1202, 1-9 (2014).
- Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).
- Kusuma, S., Shen, Y. -. I., Hanjaya-Putra, D., Mali, P., Cheng, L., Gerecht, S. Self-organized vascular networks from human pluripotent stem cells in a synthetic matrix. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12601-12606 (2013).
- Charwat, V., et al. Potential and limitations of microscopy and Raman spectroscopy for live-cell analysis of 3D cell cultures. Journal of Biotechnology. 205, 70-81 (2015).
- Holnthoner, W., et al. Adipose-derived stem cells induce vascular tube formation of outgrowth endothelial cells in a fibrin matrix. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (2), 127-136 (2012).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS ONE. 6 (11), 1-12 (2011).
- Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (9), 895-906 (2011).
- Rytlewski, J. A., Geuss, L. R., Anyaeji, C. I., Lewis, E. W., Suggs, L. J. Three-dimensional image quantification as a new morphometry method for tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (7), 507-516 (2012).
- Kerschnitzki, M., et al. Architecture of the osteocyte network correlates with bone material quality. Journal of Bone and Mineral Research. 28 (8), 1837-1845 (2013).
- Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via Wnt activation under defined conditions. Wnt Signaling: Methods and Protocols. 1481 (1), 183-196 (2016).
- Crosby, C. O., et al. Quantifying the vasculogenic potential of iPSC-derived endothelial progenitors in collagen hydrogels. Tissue Engineering Part A. , (2019).
- Li, C. H., Tam, P. K. S. An iterative algorithm for minimum cross entropy thresholding. Pattern Recognition Letters. 19 (8), 771-776 (1998).
- Kollmannsberger, P., Kerschnitzki, M., Repp, F., Wagermaier, W., Weinkamer, R., Fratzl, P. The small world of osteocytes: Connectomics of the lacuno-canalicular network in bone. New Journal of Physics. 19 (7), (2017).
- Crosby, C. O., Zoldan, J. Mimicking the physical cues of the ECM in angiogenic biomaterials. Regenerative Biomaterials. , (2019).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Kniazeva, E., Kachgal, S., Putnam, A. J., Ph, D. Effects of extracellular matrix density and mesenchymal stem cells on neovascularization in vivo. Tissue Engineering Part A. 17 (7-8), 905-914 (2011).
- Ghajar, C. M., et al. The effect of matrix density on the regulation of 3-D capillary morphogenesis. Biophysical Journal. 94 (5), 1930-1941 (2008).
- Morin, K. T., Smith, A. O., Davis, G. E., Tranquillo, R. T. Aligned human microvessels formed in 3D fibrin gel by constraint of gel contraction. Microvascular Research. 90, 12-22 (2013).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
