Mänskliga navel ven endotelceller (huvecs) och andra primära endotelceller celltyper har utnyttjats i två decennier för att modellera blodkärl gro och utveckling in vitro-¹. Sådana vaskulära plattformar lovar att belysa molekylär och vävnad-nivå mekanismer för hjärt-kärlsjukdom och kan presentera fysiologiska insikt i utvecklingen av primitiva vaskulära nätverk^2,3. Även om området vaskulär modellering har bevittnat betydande framsteg, en “Gold Standard”-analys som kvantitativt kan modellera och bedöma fysiologiska vaskulär utveckling förblir svårfångade. De flesta publicerade protokoll inte tillräckligt rekapitulera den vaskulära nisch för att uppmuntra bildandet av mogna, funktionella blodkärl eller inte har en metod för att kvantitativt jämföra vasculogenic potentialen hos de bedömda celltyper i tre dimensioner ( 3D).

Många nuvarande vaskulära modeller är begränsade i sin förmåga att efterlikna den fysiologiska vaskulära nisch. En av de vanligaste används in vitro-plattformar är gelatinös proteinblandning-baserade rör formation assay. Kortfattat, huvecs är seedade som enstaka celler på ett tunt lager av gel som består av proteiner skördas från murina sarkom extracellulära matrix (ECM); inom en till två dagar, HUVECs själv montera i primitiva rör⁴. Emellertid, denna process sker i två dimensioner (2D) och endotelceller (ECs) utnyttjas i denna analys inte bildar slutna, ihåliga lumen, vilket begränsar den fysiologiska betydelsen av dessa studier. Mer nyligen, ECs och stödjande celler (t. ex., mesenkymala stamceller (MSCS) och pericyter) har samodlas i 3D-mikromiljöer som simulerar den fibrösa arkitekturen hos den infödda ECM, såsom kollagen eller fibrin hydrogeler⁵. För att modellera vaskulär utveckling i denna mikromiljö, polymera pärlor belagda med ECs vanligtvis används⁶. Tillsats av exogena tillväxtfaktorer och/eller tillväxtfaktorer som utsöndras av andra celler som är inbäddade i Hydrogelen kan inducera ECs, belägga polymerpärlor, spira och bilda enkellumen. antalet och diametern på groddar och kärl kan sedan beräknas. Emellertid, dessa groddar är singular och inte bildar en sluten, anslutna nätverk som ses i fysiologiska förhållanden och därmed är mer påminner om en tumör kärlsystemet modell. Microfluidic enheter har också utnyttjats för att efterlikna den vaskulära nisch och att främja bildandet av kärl i EG-lastad hydrogeler^7,8. Typiskt, en angiogen tillväxtfaktor-gradient appliceras på cirkulerande cellodlingsmedium för att inducera EG migration och Sprouting. ECs som utgör lumen av utvecklade fartyg är känsliga för skjuvning stress induceras av tillämpningen av vätskeflödet genom mikroflödessystem enheten; dessa mikrofluidiska enheter fångar därför viktiga fysiologiska parametrar som inte är tillgängliga i de statiska modellerna. Dessa enheter kräver dock kostsamma mikrofabrikationsförmågor.

Viktigast av allt, alla tre vaskulära modeller (2D, 3D, microfluidic) överväldigande utnyttja primära ECs samt primära stödjande celltyper. Primära celler kan inte utvecklas till en effektiv kardiovaskulär terapi eftersom cellerna skulle kunna skapa ett immunsvar vid implantation; Dessutom, HUVECs och liknande primära celltyper är inte patientspecifika och inte fånga vaskulära avvikelser som förekommer hos patienter med en genetisk disposition eller redan existerande hälsotillstånd, t. ex., diabetes mellitus. Inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) har vuxit fram under det senaste decenniet som en patient-specifik, proliferativ cell källa som kan differentieras till alla somatiska celler i människokroppen⁹. I synnerhet har protokoll publicerats som beskriver generering och isolering av IPSC-härledda endotelceller progenitorer (IPSC-EPS)^10,11; iPSC-EPs är bipotenta och kan därför ytterligare differentieras till endotelceller och glatta muskelceller/pericyter, byggstenarna i mogna, funktionell vasculature. Endast en studie har övertygande detaljerade utvecklingen av en primär kapillär plexus från iPSC-EPs i en 3D-mikromiljö¹²; även om denna studie är kritisk till en förståelse av iPSC-EP församling och differentiering i naturliga och syntetiska hydrogels, det inte kvantitativt jämföra nätverkstopologier av den resulterande vasculature. En annan nyligen studie har använt polymera pärla modell för att jämföra groning av huvecs och IPSC-härledda ECs⁵. Därför finns det ett tydligt behov av att ytterligare belysa de fysiska och kemiska signalmekanismerna som reglerar iPSC-EP vasculogenesis i 3D-mikromiljöer och för att avgöra om dessa celler är lämpliga för ischemisk terapi och kardiovaskulär sjukdom Modellering.

Under det senaste decenniet har olika öppen källkod Computational pipelines och skeletonization algoritmer utvecklats för att kvantifiera och jämföra vaskulär nätverks längd och anslutning. Till exempel, charwat et al. utvecklat en Photoshop-baserad pipeline för att extrahera en filtrerad, binarized bild av vaskulära nätverk som härrör från en co-kultur av adipose-härledda stamceller och utväxt ECs i en fibrin matris^13,14. Kanske den mest använda topologin jämförelseverktyg är AngioTool, ett program som publicerats på nätet av National Cancer Institute¹⁵; Trots programmets utbredda antagande och väldokumenterade Fidelity, är programmet begränsat till att analysera fartyg-liknande strukturer i två dimensioner och andra program, inklusive AngioSys och Wimasis, dela samma dimensionalitet begränsning¹⁶. Kraftfulla mjukvarupaket som Imaris, Lucis och METAMORPH har utvecklats för att analysera nätverkets topologi av konstruerad mikrovaskulatur; Dessa sviter är dock kostnads oöverkomliga för de flesta akademiska labb och begränsar åtkomsten till källkoden, vilket kan hindra slutanvändaren från att anpassa algoritmen till deras specifika program. 3D slicer, en öppen källkod magnetisk resonanstomografi/datortomografi paket, innehåller en vaskulär modellering Toolkit som effektivt kan analysera topologin av 3D vaskulära nätverk¹⁷; analysen är dock beroende av användaren manuellt placera slutpunkter i nätverket, vilket kan bli tråkigt när du analyserar en stor datauppsättning och kan påverkas av användarens undermedvetna fördomar. I detta manuskript beskrivs i detalj en beräkningspipeline som kan kvantifiera 3D-vaskulära nätverk. För att övervinna de ovan beskrivna begränsningarna, denna öppen källkod Computational pipeline använder ImageJ till pre-process förvärvade konfokala bilder för att ladda 3D-volym till en skelett analysator. Skeleton Analyzer använder en parallell medial axel gallring algoritm, och utvecklades ursprungligen av Kerschnitzki et al. att analysera längd och konnektivitet av osteocyte nätverk¹⁸; denna algoritm kan tillämpas effektivt för att karakterisera längd och konnektivitet av konstruerad mikrovaskulatur.

Sammantaget beskriver detta protokoll skapandet av mikrovaskulära nätverk i 3D-mikromiljöer och ger en öppen källkod och User-bias gratis Computational pipeline för att lätt jämföra vasculogenic potential iPSC-EPs.