Человеческие пупочные вены эндотелиальных клеток (HUVECs) и других основных типов эндотелиальных клеток были использованы в течение двух десятилетий для моделирования прорастания кровеносных сосудов и развития в пробирке¹. Такие сосудистые платформы обещают осветить молекулярные и тканевые механизмы сердечно-сосудистых заболеваний и могут представить физиологическое понимание развития примитивных сосудистых сетей^2,3. Хотя область сосудистого моделирования стала свидетелем значительных достижений, “золотой стандарт” анализ, который может количественно моделировать и оценивать физиологическое развитие сосудов остается неуловимым. Большинство опубликованных протоколов не адекватно резюмировать сосудистую нишу для поощрения формирования зрелых, функциональных кровеносных сосудов или не имеют метода количественного сравнения васкулогенного потенциала оцениваемых типов клеток в трех измерениях ( 3D).

Многие современные сосудистые модели ограничены в своей способности имитировать физиологическую сосудистую нишу. Один из наиболее часто используемых в пробирке платформ является желатиновый белок смеси основе трубки анализа. Кратко, HUVECs семя как одиночные клетки на тонком слое геля который consist of протеины собранные от внеклеточной матрицы саркомы murine (ECM); в течение одного-двух дней, HUVECs самостоятельно собирать сяпок в примитивные трубы⁴. Тем не менее, этот процесс происходит в двух измерениях (2D) и эндотелиальных клеток (ECs), используемых в этом исследовании не образуют закрытые, полые люмены, тем самым ограничивая физиологическое значение этих исследований. В последнее время, ECs и поддерживающие клетки (например, мезенхимальные стволовые клетки (MSC) и перициты) были совместно культивированы в 3D микросредах, которые имитируют волокнистую архитектуру родного ECM, такие как коллаген или фибринин гидрогели⁵. Для моделирования развития сосудов в этой микросреде, полимерные бусы, покрытые eCs, как правило, используются⁶. Добавление экзогенных факторов роста и/или факторов роста, выделяемых другими клетками, интерстилиально встроенными в гидрогель, может побудить ОР, покрывающие полимерные бусы, прорастать и сформировать один просвет; количество и диаметр ростков и сосудов могут быть вычислены. Тем не менее, эти ростки являются единственными и не образуют замкнутую, связанную сеть, как это видно в физиологических условиях и, таким образом, больше напоминает модель сосуды опухоли. Микрофлюидические устройства также были использованы для имитации сосудистой ниши и содействия образованию сосудов в EC-Ладена гидрогелей^7,8. Как правило, ангиогенный фактор роста градиент применяется к циркулирующей среде культуры клеток, чтобы вызвать миграцию ИК и прорастание. ЭК, составляющие просвет развитых сосудов, чувствительны к стрессу сдвига, вызванному применением потока жидкости через микрофлюидное устройство; таким образом, эти микрофлюидные устройства фиксируют ключевые физиологические параметры, которые не доступны в статических моделях. Однако эти устройства требуют дорогостоящих микрофабрикационных способностей.

Самое главное, все три сосудистые модели (2D, 3D, микрофлюидные) в подавляющем большинстве используют первичные ОР, а также первичные поддерживающие типы клеток. Первичные клетки не могут быть разработаны в эффективную сердечно-сосудистую терапию, потому что клетки породят иммунный ответ при имплантации; кроме того, HUVECs и аналогичные типы первичных клеток не являются конкретными для пациентов и не фиксируют сосудистые аномалии, которые возникают у пациентов с генетической предрасположенностью или уже существующими заболеваниями, например, сахарным диабетом. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) появились в последнее десятилетие в качестве пациента конкретных, пролиферативных клеток источника, которые могут быть дифференцированы во все соматические клетки в организме человека⁹. В частности, были опубликованы протоколы, в которых излагаются генерации и изоляции iPSC полученных эндотелиальных прародителей (iPSC-EPs)^10,11; iPSC-EPs являются бипотентными и поэтому могут быть дополнительно дифференцированы в эндотелиальные клетки и гладкие мышечные клетки/перициты, строительные блоки зрелой, функциональной сосуды. Только одно исследование убедительно подробно развитие первичного капиллярного сплетения от iPSC-EPs в 3D микросреде^12; хотя это исследование имеет решающее значение для понимания сборки iPSC-EP и дифференциации естественных и синтетических гидрогелей, оно не количественно сравнило сетевые топологии результирующей сосуды. Другое недавнее исследование использовало полимерную модель бисера для сравнения прорастания HUVECs и iPSC-производных ECs⁵. Таким образом, существует явная необходимость дальнейшего выяснения физических и химических сигнальных механизмов, которые регулируют iPSC-EP васкулогенез в 3D микросреде и определить, если эти клетки подходят для ишемической терапии и сердечно-сосудистых заболеваний Моделирования.

В последнее десятилетие были разработаны различные вычислительные трубопроводы с открытым исходным кодом и алгоритмы скелетизации для количественной оценки и сравнения длины и подключения сосудистой сети. Например, Charwat et al. разработали конвейер на основе Photoshop для извлечения фильтрованного, бинарного изображения сосудистых сетей, полученных из совместной культуры стволовых клеток, полученных из жировых стволовых клеток и экаторов в фибринной матрице^13,14. Возможно, наиболее широко используемым инструментом сравнения топологии является AngioTool, программа, опубликованная в Интернете Национальным институтом рака^15; несмотря на широкое распространение программы и хорошо документированную верность, программа ограничивается анализом судовых структур в двух измерениях и других программ, включая AngioSys и Wimasis, имеют одно и то же ограничение размерности¹⁶. Для анализа сетевой топологии микроваскулярии были разработаны мощные пакеты программного обеспечения, такие как Imaris, Lucis и Metamorph; однако эти пакеты являются непомерно затратными для большинства академических лабораторий и ограничивают доступ к исходному коду, что может помешать конечному пользователю настроить алгоритм под их конкретное приложение. 3D Slicer, с открытым исходным кодом магнитно-резонансной томографии / компьютерной томографии пакет, содержит сосудистого моделирования Toolkit, которые могут эффективно анализировать топологию 3D сосудистых сетей^17; однако, анализ зависит от пользователя, вручную размещающего конечные точки сети, которые могут стать утомительными при анализе большого набора данных и могут зависеть от подсознательных предубеждений пользователя. В этой рукописи подробно описан вычислительный конвейер, который может количественно очислить 3D сосудистые сети. Чтобы преодолеть вышеизложенные ограничения, этот вычислительный конвейер с открытым исходным кодом использует ImageJ для предварительного обработки приобретенных конфокальных изображений для загрузки 3D-объема в анализатор скелета. Анализатор скелета использует параллельный медиальная оси истончение алгоритма, и первоначально был разработан Kerschnitzki et al. для анализа длины и подключения остеоцитных сетей¹⁸; этот алгоритм может быть эффективно применен для характеристики длины и подключения инженерных микроваскулярности.

В целом, этот протокол описывает создание микрососудистых сетей в 3D микросреде и обеспечивает открытый исходный код и пользовательские предубеждения свободного вычислительного трубопровода, чтобы легко сравнить васкулогенный потенциал iPSC-EPs.