Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) e outros tipos de células endoteliais primárias têm sido utilizadas há duas décadas para modelar a germinação e o desenvolvimento de vasos sanguíneos in vitro¹. Tais plataformas vasculares prometem iluminar mecanismos de nível molecular e tecidual de doenças cardiovasculares e podem apresentar uma visão fisiológica do desenvolvimento de redes vasculares primitivas^2,3. Embora o campo da modelagem vascular tenha testemunhado avanços significativos, um ensaio “padrão-ouro” que pode modelar quantitativamente e avaliar o desenvolvimento vascular fisiológico permanece elusivo. A maioria dos protocolos publicados não recapitulam adequadamente o nicho vascular para incentivar a formação de vasos sanguíneos maduros e funcionais ou não têm um método para comparar quantitativamente o potencial vasculogênico dos tipos de células avaliados em três dimensões ( 3D).

Muitos modelos vasculares atuais são limitados em sua capacidade de imitar o nicho vascular fisiológico. Uma das plataformas mais comumente empregadas in vitro é o ensaio de formação de tubos com base em misturas de proteínas gelatinosas. Resumidamente, os HUVECs são semeados como células únicas em uma fina camada de gel que consiste de proteínas colhidas da matriz extracelular de sarcoma murino (ECM); dentro de um a dois dias, o HUVECs Self-montam em tubos primitivos⁴. Entretanto, esse processo ocorre em duas dimensões (2D) e as células endoteliais (ECs) utilizadas neste ensaio não formam lúmens fechados e ocos, limitando assim o significado fisiológico desses estudos. Mais recentemente, as ECs e as células de suporte (por exemplo, células-tronco mesenquimais (MSCs) e pericytes) foram cocultivadas em microambientes 3D que simulam a arquitetura fibrosa do ECM nativo, como colágeno ou hidrogéis de fibrina⁵. Para modelar o desenvolvimento vascular neste microambiente, os grânulos poliméricos revestidos com ECs são tipicamente empregados⁶. A adição de fatores de crescimento exógenos e/ou fatores de crescimento secretados por outras células interstitialmente encaixadas no hidrogel pode induzir o ECs, revestindo as esferas poliméricos, para brotar e formar lúmen único; o número e o diâmetro dos rebentos e das embarcações podem então ser computados. No entanto, estes rebentos são singulares e não formam uma rede fechada, conectada como é visto em condições fisiológicas e, portanto, é mais uma reminiscência de um modelo de vasculatura tumoral. Dispositivos microfluílicos também têm sido utilizados para imitar o nicho vascular e promover a formação de vasculatura em hidrogéis EC-Laden^7,8. Tipicamente, um gradiente de fator de crescimento angiogênico é aplicado ao meio de cultura celular circulante para induzir a migração e brotação da CE. Os ECs que constituem o lúmen dos vasos desenvolvidos são sensíveis à tensão de cisalhamento induzida pela aplicação do fluxo de fluido através do dispositivo microfluídico; assim, estes dispositivos microfluídicos capturam os parâmetros fisiológicos chaves que não são acessíveis nos modelos estáticos. No entanto, esses dispositivos exigem habilidades de microfabricação dispendiosas.

Mais importante ainda, todos os três modelos vasculares (2D, 3D, microfluídico) utilizam predominantemente ECs primários, bem como tipos de células de suporte primários. As células primárias não podem ser desenvolvidas em uma terapia cardiovascular efetiva, pois as células engendram uma resposta imune na implantação; Além disso, HUVECs e tipos preliminares similares da pilha não são paciente-específicos e não capturam as anomalias vasculares que ocorrem nos pacientes com uma disposição genética ou em condições de saúde pre-existing, por exemplo, mellitus de diabetes. As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) surgiram na última década como uma fonte de células proliferativa, específica do paciente, que pode ser diferenciada em todas as células somáticas do corpo humano⁹. Em particular, foram publicados protocolos que descrevem a geração e o isolamento de progenitores endoteliais derivados do iPSC (iPSC-EPs)^10,11; iPSC-EPs são bipotentes e podem, portanto, ser mais diferenciados em células endoteliais e células musculares lisas/pericytes, os blocos de construção de vasculatura madura, funcional. Somente um estudo detalhou forma convincente o desenvolvimento de um plexo capilar preliminar de IPSC-EPS em um microambiente 3D¹²; Embora este estudo seja crítico a uma compreensão da montagem do iPSC-EP e da diferenciação em hydrogels naturais e sintéticos, não compara quantitativamente as topologias da rede da vasculatura resultante. Outro estudo recente utilizou o modelo de cordão polimérico para comparar a brotação de HUVECs e ECs⁵derivado do IPSC. Portanto, há uma clara necessidade de elucidar ainda mais os mecanismos de sinalização física e química que regulam a vasculogênese de iPSC-EP em microambientes 3D e determinar se essas células são adequadas para terapia isquêmica e doença cardiovascular Modelagem.

Na última década, foram desenvolvidos diferentes pipelines computacionais de código aberto e algoritmos de esqueletização para quantificar e comparar o comprimento e a conectividade da rede vascular. Por exemplo, charwat et al. desenvolveram um pipeline baseado em Photoshop para extrair uma imagem filtrada e binarizada de redes vasculares derivadas de uma cocultura de células-tronco derivadas de Adipose e conseqüência ECS em uma matriz de fibrina^13,14. Talvez a ferramenta de comparação de topologia mais amplamente utilizada seja a AngioTool, um programa publicado on-line pelo National Cancer Institute¹⁵; Apesar da adoção generalizada do programa e da fidelidade bem documentada, o programa se limita a analisar estruturas semelhantes a vasos em duas dimensões e outros programas, incluindo AngioSys e Wimasis, compartilham a mesma limitação de dimensionalidade¹⁶. Poderosas suítes de software como Imaris, Lucis e Metamorph foram desenvolvidas para analisar a topologia de rede de microvasculatura projetada; no entanto, essas suítes são proibitivas de custo para a maioria dos laboratórios acadêmicos e limitam o acesso ao código-fonte, o que pode dificultar a capacidade do usuário final de personalizar o algoritmo para sua aplicação específica. o slicer 3D, um pacote da imagem latente de ressonância magnética da abrir-fonte/tomography computado, contem um toolkit de modelagem vascular que possa eficazmente analisar a topologia de redes vasculares 3D¹⁷; no entanto, a análise é dependente do usuário colocando manualmente os pontos finais da rede, o que pode se tornar tedioso ao analisar um grande conjunto de dados e pode ser influenciado pelos preconceitos subconscientes do usuário. Neste manuscrito, um pipeline computacional que pode quantificar redes vasculares 3D é descrito detalhadamente. Para superar as limitações acima descritas, este pipeline computacional de código aberto utiliza o ImageJ para pré-processar imagens confocais adquiridas para carregar o volume 3D em um analisador de esqueleto. O analisador de esqueleto usa um algoritmo de desbaste de eixo medial paralelo, e foi originalmente desenvolvido por Kerschnitzki et al. para analisar o comprimento e a conectividade das redes de osteócitos¹⁸; Este algoritmo pode ser aplicado eficazmente para caracterizar o comprimento e a conectividade da microvasculatura projetada.

Completamente, este protocolo esboça a criação de redes microvascular em microambientes 3D e fornece um encanamento computacional livre do aberto-fonte e do usuário-polarização para comparar prontamente o potencial vasculogenic de iPSC-EPs.