Human navle vene endothelial celler (HUVECs) og andre primære endothelial celletyper har blitt benyttet for to ti år å modellere blod fartøy spirende og utvikling i vitro¹. Slike vaskulære plattformer lover å belyse molekylær og vev-nivå mekanismer av hjerte-og karsykdommer og kan presentere fysiologiske innsikt i utviklingen av primitive vaskulære nettverk^2,3. Selv om feltet av vaskulær modellering har vært vitne til betydelige fremskritt, en “gull standard” analysen som kan kvantitativt modell og vurdere fysiologiske vaskulær utvikling fortsatt unnvikende. De fleste publiserte protokoller ikke tilstrekkelig recapitulate den vaskulære nisje å oppmuntre til dannelse av modne, funksjonelle blodårer eller ikke har en metode for å kvantitativt sammenligne vasculogenic potensialet i vurdert celletyper i tre dimensjoner ( 3D).

Mange aktuelle vaskulære modeller er begrenset i sin evne til å etterligne den fysiologiske vaskulær nisje. En av de mest brukte in vitro plattformer er geléaktige protein blanding-basert rør formasjon analysen. Kort, HUVECs er sådd som enkeltceller på et tynt lag av gel som består av proteiner høstes fra murine sarkom ekstracellulære matrise (ECM); innen en til to dager, det HUVECs selv-montere i primitive rør⁴. Imidlertid skjer denne prosessen i to dimensjoner (2D) og endothelial celler (ECs) benyttes i denne analysen ikke danner vedlagt, hule lumen, og dermed begrense fysiologiske betydningen av disse studiene. Flere nylig, ECs og støtte celler (for eksempel Mesenchymal stamceller (MSCs) og pericytes) har vært co-kultivert i 3D-microenvironments som simulerer fiber arkitekturen til de innfødte ECM, slik som kollagen eller fibrin hydrogeler⁵. Å modellere vaskulær utvikling i denne mikromiljøet, polymer perler belagt med ECs er vanligvis ansatt⁶. Tillegg av eksogene vekstfaktorer og/eller vekstfaktorer skilles ut av andre celler interstitially innebygd i hydrogel kan indusere ECs, belegg på polymer perler, å spire og danne enkelt lumen; antall og diameter på spirer og fartøy kan deretter beregnes. Men disse spirer er entall og ikke danner et vedlagt, tilkoblet nettverk som er sett i fysiologiske forhold og dermed er mer minner om en svulst blodkar modell. Mikrovæskebasert enheter har også blitt benyttet for å etterligne den vaskulære nisje og å fremme dannelsen av blodkar i EC-Laden hydrogeler^7,8. Vanligvis brukes en angiogenic vekstfaktor-gradient på sirkulerende cellekultur medium for å indusere EC migrasjon og spirende. ECs som utgjør lumen av utviklede fartøy er følsomme for skjær stresset indusert ved anvendelse av væske strømme gjennom mikrovæskebasert enheten; dermed fanger disse mikrovæskebasert enhetene opp viktige fysiologiske parametre som ikke er tilgjengelige i de statiske modellene. Men disse enhetene krever kostbare microfabrication evner.

Viktigst, alle tre vaskulære modeller (2D, 3D, mikrovæskebasert) overveldende utnytte primære ECs så vel som primære støtte celletyper. Primær-celler kan ikke utvikles til en effektiv kardiovaskulær behandling fordi cellene ville skape en immunrespons ved implantation; Videre, HUVECs og lignende primære celletyper er ikke pasientspesifikke og ikke fange vaskulær unormalt som oppstår hos pasienter med en genetisk disposisjon eller pre-eksisterende helsemessige forhold, for eksempel diabetes mellitus. Indusert Pluripotent stamceller (iPSCs) har dukket opp i det siste tiåret som en pasient-spesifikk, proliferativ celle kilde som kan skilles i alle somatiske celler i menneskekroppen⁹. Spesielt har protokoller blitt publisert som skisserer generering og isolering av iPSC-avledet endothelial forfedre (iPSC-EPs)^10,11; iPSC-EPs er bipotent og kan derfor være ytterligere differensiert i endothelial celler og glatte muskelceller/pericytes, byggesteinene av modne, funksjonelle blodkar. Bare én studie har overbevisende detaljert utvikling av en primær kapillær plexus fra iPSC-EPs i en 3D-mikromiljøet¹²; Selv om denne studien er avgjørende for en forståelse av iPSC-EP montering og differensiering i naturlige og syntetiske hydrogeler, det gjorde ikke kvantitativt sammenligne nettverket topologi av den resulterende blodkar. En annen fersk studie har brukt polymer perle modell for å sammenligne spirende av HUVECs og iPSC-avledet ECs⁵. Derfor er det et klart behov for å ytterligere belyse den fysiske og kjemiske signalering mekanismer som regulerer iPSC-EP vasculogenesis i 3D microenvironments og å finne ut om disse cellene er egnet for iskemiske terapi og hjerte-og karsykdommer Modellering.

I det siste tiåret, har ulike åpen kildekodedata samlebånd og skeletonization algoritmer er utviklet for å kvantifisere og sammenligne vaskulær nettverks lengde og tilkobling. For eksempel, Charwat et al. utviklet en Photoshop-basert rørledning for å trekke ut en filtrert, binarized bilde av vaskulære nettverk avledet fra en co-kultur av fett-avledet stamceller og utvekst ECs i en fibrin matrise^13,14. Kanskje den mest brukte topologi sammenligningsverktøy er AngioTool, et program utgitt online av National Cancer Institute¹⁵; til tross for programmets utbredte adopsjon og godt dokumentert troskap, er programmet begrenset til å analysere fartøy-lignende strukturer i to dimensjoner og andre programmer, inkludert AngioSys og Wimasis, deler samme dimensionality begrensning¹⁶. Kraftfull programvare suite som Imaris, Lucis, og programmet ha blitt bebygget å analysere nettverket topologi av konstruert microvasculature; Disse suitene er imidlertid kostnads uoverkommelige for de fleste akademiske laboratorier og begrenser tilgangen til kildekoden, noe som kan hindre muligheten for sluttbrukeren å tilpasse algoritmen til deres spesifikke program. 3D slicer, en åpen kildekode magnetisk resonans imaging/beregnet tomografi pakken inneholder en vaskulær modellering Toolkit som effektivt kan analysere topologien av 3D vaskulære nettverk¹⁷; Imidlertid er analysen avhengig av brukeren manuelt plassere endepunktene i nettverket, som kan bli kjedelige når analysere et stort datasett og kan bli påvirket av brukerens underbevissthet fordommer. I dette manuskriptet, en beregningsorientert rørledning som kan kvantifisere 3D vaskulære nettverk er beskrevet i detalj. Å overvinne det over-skissert begrensninger, denne åpen kilde beregningsorientert rørledning utnytter ImageJ å pre-forarbeide ervervet konfokalmikroskopi profilen å belaste det 3D kvantum i en skjelett analyserer. Skjelettet analysator bruker en parallell midtre akse tynning algoritme, og ble opprinnelig utviklet av Kerschnitzki et al. å analysere lengden og tilkobling av osteocyte nettverk¹⁸; denne algoritmen kan effektivt brukes til å karakterisere lengden og tilkobling av konstruert microvasculature.

Til sammen skisserer denne protokollen opprettelsen av mikrovaskulær nettverk i 3D-microenvironments og gir en åpen kildekode og bruker-bias gratis datasamlebånd rør for å lett sammenligne vasculogenic potensialet i iPSC-EPs.