iPSC 유래 내피 선조의 혈관 전위를 정량화하는 체외 3D 모델 및 전산 파이프라인
Summary
유도 된 만능 줄기 세포에서 파생 된 내피 전구체 (iPSC-EP)는 심혈관 질환 치료에 혁명을 일으킬 잠재력을 가지고 있으며 보다 충실한 심혈관 질환 모델을 생성 할 수 있습니다. 본 명세서에서, 3차원(3D) 콜라겐 미세환경에서 iPSC-EP의 캡슐화 및 이들 세포의 혈관전위액의 정량적 분석이 기재되어 있다.
Abstract
유도된 만능 줄기 세포(iPSCs)는 임의의 체세포 유형으로 분화할 수 있는 환자 특이적, 증식성 세포 공급원이다. 성숙하고 기능적인 혈관을 조립하는 데 필요한 세포 유형으로 분화할 수 있는 이중내피 전구체(EP)는 배아 및 유도 만능 줄기 세포 모두에서 유래되었습니다. 그러나, 이 세포는 3차원 환경에서 엄격하게 평가되지 않았고, 그들의 혈관 전위도의 양적 측정은 애매하게 남아 있습니다. 여기서, 형광 활성화 세포 선별을 통한 iPSC-EP의 생성 및 격리가 먼저 설명되고, 그 다음에 콜라겐 하이드로겔에서 iPSC-EP의 캡슐화 및 배양에 대한 설명이 뒤따랐다. 이 세포외 매트릭스 (ECM)모방 미세 환경은 강력한 혈관 반응을 장려합니다. 혈관 네트워크는 배양의 주 후에 형성됩니다. 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 이러한 혈관 반응을 정량화하는 계산 파이프라인의 생성이 설명됩니다. 이 파이프라인은 모세관 신경총의 3D 아키텍처를 보존하여 최소한의 사용자 입력으로 분기, 분기 점 및 전체 네트워크 길이를 강력하게 식별하도록 설계되었습니다.
Introduction
인간 배꼽 정맥 내피 세포(HUVECs) 및 기타 1차 내피 세포 유형은 2년 동안 시험관내 혈관 발아및 발달을 모델링하기 위해 활용되어 왔다. 이러한 혈관 플랫폼은 심혈관 질환의 분자 및 조직 수준 메커니즘을 조명할 것을 약속하고 원시 혈관네트워크의 발달에 대한 생리학적 통찰력을 제시할 수 있다 2,3. 혈관 모델링 분야는 상당한 발전을 목격했지만 생리학적 혈관 발달을 정량적으로 모델링하고 평가할 수 있는 “금 본위제” 분석은 여전히 애매합니다. 대부분의 출판된 프로토콜은 성숙하고 기능적인 혈관의 형성을 장려하기 위해 혈관 틈새 시장을 적절히 회수하지 못하거나 평가된 세포 유형의 혈관 전위를 3차원으로 정량적으로 비교하는 방법이 없는 경우( 3D).
많은 현재 혈관 모형은 생리적인 혈관 틈새시장을 모방하는 그들의 기능에 있는 제한됩니다. 시험관내 에서 가장 일반적으로 사용되는 것 중 하나는 젤라틴 단백질 혼합물 계 튜브 형성 분석이다. 간략하게, HUVECs는 뮤린 육종 세포 외 매트릭스 (ECM)에서 수확 한 단백질로 구성된 겔의 얇은 층에 단일 세포로 시드된다; 1 ~ 2 일 이내에 HUVECs는 원시 튜브4로자체 조립됩니다. 그러나, 이러한 과정은 2차원(2D)과 이 분석법에서 활용되는 내피 세포(ECs)에서 발생하며, 이러한 연구의 생리학적 중요성을 제한함으로써 동봉된 중공 루멘을 형성하지 않는다. 보다 최근에는, ECs 및 지지 세포(예를 들어, 중간엽 줄기 세포(SC) 및 회구)는 콜라겐 또는 피브린 하이드로겔과 같은 네이티브 ECM의 섬유질 구조를 시뮬레이션하는3D 미세 환경에서 공동 배양되고 있다 5. 이러한 미세 환경의 혈관 발달을 모델링하기 위해, EC로 코팅된 중합체 비드는 전형적으로6을채용한다. 하이드로겔에 간질적으로 내장된 다른 세포에 의해 분비되는 외인성 성장 인자 및/또는 성장 인자의 첨가는 ECs를 유도할 수 있고, 중합체 비드를 코팅하고, 싹트고 단일 루멘을 형성할 수 있다; 그런 다음 새싹과 용기의 수와 직경을 계산할 수 있습니다. 그러나, 이러한 새싹은 단수이며 생리학적 조건에서 볼 수 있듯이 동봉된 연결된 네트워크를 형성하지 않으므로 종양 혈관 구조 모델을 연상시킵니다. 미세유체 장치는 또한 혈관 틈새 시장을 모방하고 EC-라덴 하이드로겔7,8에서혈관 구조의 형성을 촉진하기 위해 활용되었다. 전형적으로, 혈관신생 성장 인자-구배는 순환 세포 배양 배지에 적용되어 EC 이동 및 발아를 유도한다. 개발된 용기의 루멘을 구성하는 ECs는 미세유체 장치를 통한 유체 흐름의 적용에 의해 유도된 전단 응력에 민감하며; 따라서 이러한 미세 유체 장치는 정적 모델에서 액세스할 수 없는 주요 생리학적 매개 변수를 캡처합니다. 그러나 이러한 장치는 비용이 많이 드는 미세 제작 능력이 필요합니다.
가장 중요한 것은, 세 가지 혈관 모델(2D, 3D, 미세유체)이 1차 EC뿐만 아니라 1차 지지 세포 유형을 압도적으로 활용했다는 것입니다. 세포가 이식시 면역 반응을 일으키기 때문에 1 차적인 세포는 효과적인 심장 혈관 치료로 발전될 수 없습니다; 더욱이, HUVECs 및 유사한 1 차적인 세포 모형은 환자 특정하지 않으며 유전 처리 또는 기존 건강 상태, 예를 들면, 당뇨병 mellitus를 가진 환자에서 생기는 혈관 이상을 포착하지 않습니다. 유도된 만능 줄기세포(iPSCs)는 지난 10년간 인체내의 모든 체세포로 분화될 수 있는 환자 특이적, 증식성 세포 공급원으로 나타났다. 특히, iPSC 유래 내피 선조(iPSC-EP)의 생성 및 격리를 설명하는 프로토콜이 10,11; iPSC-EP는 이중성이며, 따라서, 성숙하고 기능적인 혈관구조의 빌딩 블록인 내피 세포와 평활근 세포/회핵세포로 더욱 분화될 수 있다. 단 하나의 연구는 설득력 3D 미세 환경12에서iPSC-EP에서 기본 모세관 신경총의 개발을 상세히했다; 본 연구는 iPSC-EP 어셈블리의 이해와 천연 및 합성 하이드로겔의 분화에 매우 중요하지만, 생성된 혈관구조의 네트워크 와 사과를 정량적으로 비교하지는 않았다. 또 다른 최근 연구는 HUVECs 및 iPSC 유래 ECs5의 발아를 비교하기 위해 폴리머 비드 모델을 사용했다. 따라서 3D 미세 환경에서 iPSC-EP 혈관 발생을 조절하는 물리적 및 화학적 신호 메커니즘을 더 명확히 밝히고 이러한 세포가 허혈성 치료 및 심혈관 질환에 적합한지 여부를 결정할 필요가 있습니다. 모델링.
지난 10년 동안 혈관 네트워크 길이와 연결을 정량화하고 비교하기 위해 다양한 오픈 소스 계산 파이프라인과 스켈레톤 알고리즘이 개발되었습니다. 예를 들어, Charwat 등은 피브린 매트릭스13,14에서지방 유래 줄기 세포 및 아웃성장 EC의 공동 배양으로부터 유래된 혈관 네트워크의 필터링된 이불화 이미지를 추출하는 포토샵 기반 파이프라인을 개발하였다. 아마도 가장 널리 사용되는 토폴로지 비교 도구는 AngioTool, 국립 암 연구소에 의해 온라인으로 출판 된 프로그램입니다15; 프로그램의 광범위한 채택과 잘 문서화 된 충실도에도 불구하고,이 프로그램은 AngioSys 및 Wimasis를 포함한 두 가지 차원의 선박과 같은 구조를 분석하는 것으로 제한되며 동일한 차원 제한16을공유합니다. Imaris, Lucis 및 변형과 같은 강력한 소프트웨어 제품군은 엔지니어링 된 미세 혈관 구조의 네트워크 토폴로지를 분석하기 위해 개발되었습니다. 그러나 이러한 제품군은 대부분의 학술 실습에서 비용이 많이 들며 소스 코드에 대한 액세스를 제한하므로 최종 사용자가 특정 응용 프로그램에 맞게 알고리즘을 사용자 지정하는 데 방해가 될 수 있습니다. 3D 슬라이서, 오픈 소스 자기 공명 영상 / 컴퓨터 단층 촬영 패키지, 효과적으로 3D 혈관 네트워크의 토폴로지를 분석 할 수있는 혈관 모델링 도구 키트를 포함(17; 그러나 분석은 사용자가 네트워크의 끝점을 수동으로 배치하는 데 의존하며, 이는 큰 데이터 집합을 분석할 때 지루해질 수 있으며 사용자의 잠재 의식 편향에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 이 원고에서는 3D 혈관 네트워크를 정량화할 수 있는 계산 파이프라인을 자세히 설명합니다. 위에서 설명한 한계를 극복하기 위해 이 오픈 소스 계산 파이프라인은 ImageJ를 활용하여 획득한 공초점 이미지를 사전 처리하여 3D 볼륨을 스켈레톤 분석기로 로드합니다. 상기 골격 분석기는 병렬 내측축 숱이 알고리즘을 사용하며, 원래 Kerschnitzki 등에서 개발하여 골혈구망(18)의 길이 및 연결을 분석한다. 이 알고리즘은 엔지니어링 된 미세 혈관 구조의 길이와 연결을 특성화하기 위해 효과적으로 적용 될 수 있습니다.
이 프로토콜은 3D 미세 환경에서 미세 혈관 네트워크의 생성을 간략하게 설명하고 iPSC-EP의 혈관 전위를 쉽게 비교할 수 있는 오픈 소스 및 사용자 편향 없는 계산 파이프라인을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 E8, LaSR 기저, 및 EGM-2의 세 가지 유형의 세포 배양 배지에서 세포의 장기 배양을 포함한다. 따라서 모든 물질을 적절하게 살균하기 위해 세심한주의를 기울여야합니다. 또한 실험실 코트와 에탄올 세척 장갑은 실험실의 층류 후드에서 작업할 때 항상 착용해야 합니다. 마이코 플라즈마 오염을 자주 테스트하는 것이 좋습니다. iPSC 배양 중에 다량의 파편이 관찰되는 경우 또는 분화 효…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 미국 심장 협회 (교부금 번호 15SDG25740035, J.Z.에 수여), 국립 보건원의 생물 의학 영상 및 생명 공학 (NIBIB)의 국립 연구소 (보조금 번호 EB007507, C.C.에 수여), 및 재생 재활 연구 및 훈련을위한 연합 (AR3T, 부여 번호 1 P2C HD086843-01, J.Z.에 수여). 우리는 공초점 현미경 검사법에 대한 그녀의 기술적인 조언을 위해 Jeanne Stachowiak 교수 (오스틴텍사스 대학)를 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 사무엘 미헬릭 (오스틴 텍사스 대학), 알리시아 알렌 박사 (오스틴 텍사스 대학), 줄리 Rytlewski 박사 (적응 생명 공학), 박사 레온 벨란 (밴더빌트 대학)와 의논에 감사드립니다 3D 네트워크의 계산 분석. 마지막으로, 우리는 박사 샤오 핑 바오 (캘리포니아 대학, 버클리) iPSC-EP로 iPSCs를 차별화에 대한 그의 조언에 감사드립니다.
Materials
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | N/A | A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging |
| 96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile | Corning | 7007 | Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Scientific | 12634010 | The base media for iPSC-EP differentiation. |
| Barnstead GenPure xCAD Plus | Thermo Fisher Scientific | 50136165 | Water purification system; others can be readily substituted |
| Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture | Fisher Scientific | A8412 | To preserve cell viability when FACs sorting |
| CD34-PE, human (clone: AC136) | Miltenyi Biotec | 130-098-140 | Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs |
| CHIR99021 | LC Laboratories | C-6556 | Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells |
| Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg | VWR | 354249 | Main component of the 3D microenvironment |
| Conical centrifuge tubes (15/50 mL) | Fisher Scientific | 14-959-49D/A | Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | To counterstain and visualize cell nuclei |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-250 | To wash monolayer cultures |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E8008 | For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | Promotes endothelial cell viability and proliferation |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For maintenance of pluripotent stem cells |
| Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT) | Sigma-Aldrich | 50046 | Neutralizes remaining detergent |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95% | Sigma-Aldrich | A8960 | Component of iPSC-EP differentiation medium |
| MATLAB | MathWorks | 1.8.0_152 | Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions) |
| Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture) | Fisher Scientific | 356231 | Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation |
| Medium-199 10X | Thermo Fisher Scientific | 1825015 | Used to balance final hydrogel osmolarity and pH |
| Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | VWR | 87003-294 | Stores small volumes of reagents |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | The main ingredient of the immunostaining solutions |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument |
| Recombinant Human VEGF 165 Protein | R&D Systems | 293-VE | Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis |
| Rhodamine phalloidin | Themo Fisher Scientific | R415 | To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks |
| Triton X-100 (nonionic surfactant) | Sigma-Aldrich | X-100 | Detergent used to gently permeabilize cells |
| Tween-20 (emulsifying reagent) | Fisher Scientific | BP337 | Increases the binding specificity of the added antibodies |
| VE-Cadherin (F-8) | Santa Cruz Biotechnology | sc-9989 | To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels |
| Vitronectin | ThermoFisher | A14700 | For maintenance of pluripotent stem cells |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded |
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