מודל תלת מימד וצינור חישוב מתורבת לכמת את הפוטנציאל הוושלתי של iPSC-נגזר של התגובה האנטי-מגנטית
Summary
הושלתי האנדותל שנגזר מתאי גזע המושרה ביותר (iPSC-EPs) יש את הפוטנציאל לחולל מהפכה לטיפולי מחלות לב וכלי דם ולאפשר יצירת מודלים נאמנים יותר של מחלות לב וכלי דם. בזאת, כימוס של iPSC-EPs בתלת מימדי (3D) קולגן מיקרוסביבה וניתוח כמותי של הפוטנציאל הגלום בתאים אלה מתוארים.
Abstract
המושרה בתאי גזע פלוריטי (iPSCs) הם מקור ספציפי למטופל, תא שהתרבות שיכול להבדיל לכל סוג תא הסומטית. ביופוטנאל ושלתי (EPs), אשר יכול להבדיל בין סוגי התאים הדרושים כדי להרכיב בוגרת, פונקציונלית ולבלטורה, נגזר הן העובריים והמושרה תאים גזע pluripotent עם זאת, תאים אלה לא הוערכו בקפדנות בסביבות תלת ממדיות, ואת המדד הכמותי של הפוטנציאל הvas, שלהם נשאר חמקמק. כאן, הדור והבידוד של iPSC-EPs באמצעות מיון התא מופעל פלורסנט מתוארים תחילה, ואחריו תיאור של עטיפת ותרבות של iPSC-EPs ב קולגן הידרוג. מטריצה זו (ECM)-מחקה המיקרו-סביבה מעודדת תגובה חזקה ומרכזית; ליצור רשתות כלי דם לאחר שבוע של תרבות. יצירת צינור חישובית העושה שהוא משתמש בתוכנה מקור פתוח כדי לכמת את התגובה הזאת הוא התחום. צינור זה נועד במיוחד כדי לשמר את ארכיטקטורת 3d של מקלעת נימי כדי מכבש לזהות את מספר הענפים, נקודות הסתעפות, ואת אורך הרשת הכולל עם קלט משתמש מינימלי.
Introduction
וריד הטבור האנושי בתאי הטבורי (HUVECs) וסוגים אחרים של תאים אנדותל הראשי כבר מנוצל במשך שני עשורים לדגמן כלי דם לבלוב ופיתוח בתוך מבחנה1. פלטפורמות כלי דם כאלה להבטיח להאיר מולקולרית ברמת רקמות מנגנונים של מחלות לב וכלי דם והוא עשוי להציג תובנה פיזיולוגית לתוך פיתוח של רשתות כלי דם פרימיטיביים2,3. למרות שהשדה של מידול כלי הדם הגיע עד להתקדמות משמעותית, שיטת “תקן זהב” שיכולה לכמת את המודל ולהעריך את ההתפתחות הפיזיולוגית של כלי הדם, נותרה חמקנית. רוב הפרוטוקולים שפורסמו אינם מתפקדים כראוי את הנישה של כלי הדם כדי לעודד היווצרות של כלי דם בוגרים ופונקציונליים או שיטה להשוות את הפוטנציאל הגלום בסוגי התאים המוערך בשלושה מימדים ( 3D).
מודלים רבים של כלי הדם הנוכחיים מוגבלים ביכולתם לחקות את הנישה הפיזיולוגית של כלי הדם. אחד הנפוצים ביותר בפלטפורמות מבחנה הוא חלבון ז’לטין מבוססי תערובת היווצרות שפופרת. בקצרה, HUVECs הם הזרע כמו תאים בודדים על שכבה דקה של ג’ל המורכב של חלבונים שנקטפו מתוך מיטין סרקומה מורתתאי (ECM); בתוך אחד עד יומיים, HUVECs להרכיב את עצמו לתוך צינורות פרימיטיביים4. עם זאת, תהליך זה מתרחש בשני מימדים (2D) ובתאי האנדותל (ECs) הנמצאים בשימוש באותו שיטת הפעולה אינם יוצרים מוקפים, חלולים לומן, ובכך מגבילים את המשמעות הפיזיולוגית של מחקרים אלה. לאחרונה, ECs ותאים תומכים (g., תאי גזע mesenchymal (MSCs) ו קרום הלב) כבר שיתוף תרבותי במיקרו מיקרוסביבות 3D המדמים את הארכיטקטורה הסיבי של ECS יליד, כגון קולגן או פיברוב הידרוג’ל5. כדי לדגמן פיתוח כלי דם מיקרוסביבה זו, חרוזים פולימריים מצופה ECs מועסקים בדרך כלל6. התוספת של גורמי צמיחה אקסוגני ו/או גורמי גדילה מופרש על ידי תאים אחרים interstitially מוטבע הידרוג’ל יכול לגרום ECs, ציפוי חרוזים פולימריים, כדי נבט וטופס לומן יחיד; המספר והקוטר של נבטים והכלים יכולים להיות מחושבים. עם זאת, נבטים אלה הם באופן ייחודי ולא יוצרים רשת סגורה, מחובר כפי שהוא נראה בתנאים פיסיולוגיים ולכן הוא מזכיר יותר מודל הגידול של המודל. התקנים מיקרופלואידים מנוצלים גם כדי לחקות את נישה כלי הדם ולקדם את היווצרות ואצלב ב-EC-לאדן הידרוג’ל7,8. בדרך כלל, גורם גידול אנגיוגנטי-מעבר הדרגתי מוחל על בינונית תרבות התא מחזורי כדי לגרום הגירה EC ולבלוב. ECs המהווים לומן של כלי מפותח רגישים למתח ההטיה הנגרמת על ידי יישום של זרימת הנוזלים דרך המכשיר microfluidic; לכן, מכשירים אלה microflu, התקנים מיקרופלואידים ללכוד פרמטרים פיזיולוגיים מפתח כי הם לא נגישים במודלים סטטיים. עם זאת, התקנים אלה דורשים יכולות מיקרו-ייצור יקרות.
והכי חשוב, כל שלושת מודלים כלי הדם (2D, 3D, microfluidic) להשתמש באופן גורף ECs הראשי, כמו גם הראשי התומך בסוגי תאים. לא ניתן לפתח תאים ראשוניים לטיפול קרדיווסקולרי אפקטיבי, כי התאים היו לעורר תגובה חיסונית על השרשה; יתר על כן, HUVECs וסוג התאים הראשוניים דומים אינם מסוימים המטופל ולא ללכוד חריגות כלי הדם המתרחשים בחולים עם מתכונת גנטית או מראש קיים תנאי הבריאות, למשל, סוכרת. המושרה בתאי גזע פלאוריטי (iPSCs) התפתחה בעשור האחרון כמו מקור מטופל ספציפי, המקור התא מתרבים כי ניתן לבדיל את כל התאים הסומטיים בגוף האדם9. בפרט, הפרוטוקולים פורסמו כי המתאר את הדור והבידוד של iPSC הנגזר ושלתי (iPSC-EPs)10,11; iPSC-EPs הם בעלי עוצמה והוא יכול, ולכן, להיות מובחנת עוד לתוך תאים אנדותל ותאי שריר חלקה/קרום הלב, אבני הבניין של בוגרת, פונקציונלי תפקודית. רק מחקר אחד יש מפורט משכנעת את הפיתוח של מקלעת נימי העיקרי מ-iPSC-EPs ב מיקרוסביבה 3D12; למרות שמחקר זה הוא קריטי להבנת ההרכבה iPSC-EP ובידול טבעי וסינתטי הידרוג, זה לא להשוות את טופולוגיות הרשת של המערכת המתקבלת. עוד מחקר שנערך לאחרונה השתמש במודל חרוז פולימרי כדי להשוות את הנביטה של HUVECs ו-iPSC-נגזר ECs5. לכן, יש צורך ברור נוסף להבהיר את מנגנוני האיתות הפיזיים והכימיים לווסת iPSC-EP vasculogenesis בסביבות מיקרו 3D וכדי לקבוע אם תאים אלה מתאימים לטיפול איסכמי ומחלות לב וכלי דם דוגמנות.
בעשור האחרון, קווים שונים של מקור פתוח ואלגוריתמים השלד הינם מפותחים לכמת ולהשוות את אורך הרשת והקישוריות של כלי הדם. לדוגמה, charwat ואח ‘ פיתח צינור מבוסס פוטושופ כדי לחלץ תמונה מסוננת, בינארית של רשתות כלי דם נגזר תרבות שיתוף של תאי גזע נגזר של אדיפוז ו-ecs הצמיחה של מטריצה הפיטין13,14. אולי הכלי הנפוץ ביותר להשוואת הטופולוגיה הוא אנגיוtool, תוכנית שפורסמה באינטרנט על ידי המכון הלאומי לסרטן15; למרות אימוץ נרחב של התוכנית נאמנות מתועדת היטב, התוכנית מוגבלת לניתוח מבנים כמו כלי בשני ממדים ותוכניות אחרות, כולל AngioSys ו Wimasis, לשתף את אותה הגבלה מימדי16. חבילות תוכנה רבות עוצמה כגון Imaris אריס, לוסיא והתמרה פותחו כדי לנתח את טופולוגיית הרשת של מיקרובילטורה מהונדסים; עם זאת, סוויטות אלה הן מעלות עבור מעבדות אקדמיות ביותר ולהגביל את הגישה לקוד המקור, אשר עשוי לעכב את היכולת של משתמש הקצה להתאים את האלגוריתם ליישום הספציפי שלהם. 3D מבצעה, מקור פתוח דימות תהודה מגנטית/חבילת טומוגרפיה ממוחשבת, מכיל ערכת מידול כלי דם שיכול לנתח ביעילות את הטופולוגיה של רשתות 3D כלי דם17; עם זאת, הניתוח תלוי במשתמש מציב ידנית את נקודות הקצה של הרשת, דבר העלול להיות מייגע בעת ניתוח ערכת נתונים גדולה ויכול להיות מושפע מהטיות התת-מודע של המשתמש. בכתב יד זה, צינור חישובית שיכול לכמת רשתות כלי דם 3D מתואר בפרוטרוט. כדי להתגבר על מגבלות הנ ל, זה צינור בחישוב מקור פתוח מנצל ImageJ כדי לעבד מראש התמונות מיקוד רכשה לטעון את נפח 3D לתוך מנתח שלד. מנתח השלד משתמש באלגוריתם מקביל של ציר דליל, והוא פותח במקור על ידי קרשניצקי ואח ‘. כדי לנתח את האורך והקישוריות של רשתות אוסטאופציט18; אלגוריתם זה ניתן להחיל באופן יעיל כדי לאפיין את האורך ואת הקישוריות של מיקרוקולטורה הנדסה.
בסך הכל, פרוטוקול זה מתאר את היצירה של רשתות microvascular מיקרונימי בסביבות תלת-ממד, ומספק צינור חישוב מקור פתוח ומשתמש-הטיה בחינם כדי להשוות את הפוטנציאל vasculogenic של iPSC-EPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה כולל את התרבות הארוכת טווח של תאים בשלושה סוגים של מדיית תרבות התא: E8, LaSR בסיס ו-EGM-2. לכן יש לנקוט בזהירות רבה כדי לעקר את כל החומרים. בנוסף, מעילי מעבדה וכפפות שעברו ניקוי אתנול צריכים תמיד להיות שחוקים כשעובדים במכסה הזרימה המבינארי של המעבדה. מומלץ לבדוק לעתים קרובות לזיהום mycop…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי איגוד הלב האמריקני (מענק מספר 15SDG25740035, הוענק J.Z.), המכון הלאומי לדימות ביו-רפואי ו Bioהנדסאים (NIBIB) של המוסדות הלאומיים לבריאות (גרנט מספר EB007507, הוענק סיסי), ו הברית למחקר שיקום משובי & הדרכה (AR3T, גרנט מספר 1 P2C HD086843-01, הוענק J.Z.). ברצוני להכיר בפרופ ‘ ז’אן סטצ’ויאק (אוניברסיטת טקסס באוסטין) לעצתה הטכנית במיקרוסקופיה. אנחנו גם אסירי תודה על דיונים עם סמואל Mihelic (אוניברסיטת טקסס באוסטין), ד ר אלישיה אלן (אוניברסיטת טקסס באוסטין), ד ר ג ‘ ולי Rytlewski (ביוטכנולוגיה מסתגלת), וד ר ליאון Bellan (אוניברסיטת ואנדרבילט) על התובנה שלהם על אנליזה חישובית של רשתות תלת-מימד. לבסוף, אנו מודים לדר ‘ שיאופינג באו (אוניברסיטת קליפורניה בברקלי) על עצתו להבדיל iPSCs לתוך iPSC-EPs.
Materials
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | N/A | A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging |
| 96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile | Corning | 7007 | Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Scientific | 12634010 | The base media for iPSC-EP differentiation. |
| Barnstead GenPure xCAD Plus | Thermo Fisher Scientific | 50136165 | Water purification system; others can be readily substituted |
| Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture | Fisher Scientific | A8412 | To preserve cell viability when FACs sorting |
| CD34-PE, human (clone: AC136) | Miltenyi Biotec | 130-098-140 | Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs |
| CHIR99021 | LC Laboratories | C-6556 | Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells |
| Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg | VWR | 354249 | Main component of the 3D microenvironment |
| Conical centrifuge tubes (15/50 mL) | Fisher Scientific | 14-959-49D/A | Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | To counterstain and visualize cell nuclei |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-250 | To wash monolayer cultures |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E8008 | For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | Promotes endothelial cell viability and proliferation |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For maintenance of pluripotent stem cells |
| Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT) | Sigma-Aldrich | 50046 | Neutralizes remaining detergent |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95% | Sigma-Aldrich | A8960 | Component of iPSC-EP differentiation medium |
| MATLAB | MathWorks | 1.8.0_152 | Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions) |
| Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture) | Fisher Scientific | 356231 | Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation |
| Medium-199 10X | Thermo Fisher Scientific | 1825015 | Used to balance final hydrogel osmolarity and pH |
| Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | VWR | 87003-294 | Stores small volumes of reagents |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | The main ingredient of the immunostaining solutions |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument |
| Recombinant Human VEGF 165 Protein | R&D Systems | 293-VE | Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis |
| Rhodamine phalloidin | Themo Fisher Scientific | R415 | To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks |
| Triton X-100 (nonionic surfactant) | Sigma-Aldrich | X-100 | Detergent used to gently permeabilize cells |
| Tween-20 (emulsifying reagent) | Fisher Scientific | BP337 | Increases the binding specificity of the added antibodies |
| VE-Cadherin (F-8) | Santa Cruz Biotechnology | sc-9989 | To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels |
| Vitronectin | ThermoFisher | A14700 | For maintenance of pluripotent stem cells |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded |
Referências
- Wang, K., Lin, R. -. Z., Melero-Martin, J. M. Bioengineering human vascular networks: trends and directions in endothelial and perivascular cell sources. Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-19 (2018).
- Kant, R. J., Coulombe, K. L. K. Integrated approaches to spatiotemporally directing angiogenesis in host and engineered tissues. Acta Biomaterialia. 69, 42-62 (2018).
- Briquez, P. S., Clegg, L. E., Martino, M. M., Mac Gabhann, F., Hubbell, J. A. Design principles for therapeutic angiogenic materials. Nature Reviews Materials. 1 (1), 1-15 (2016).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: State of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
- Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures. Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).
- Nakatsu, M. N., et al. VEGF121 and VEGF165 regulate blood vessel diameter through vascular endothelial growth factor receptor 2 in an in vitro angiogenesis model. Laboratory Investigation. 83 (12), 1873-1885 (2003).
- Shamloo, A., Heilshorn, S. C. Matrix density mediates polarization and lumen formation of endothelial sprouts in VEGF gradients. Lab on a Chip. 10 (22), 3061 (2010).
- Jeon, J. S., et al. Generation of 3D functional microvascular networks with human mesenchymal stem cells in microfluidic systems. Integrative Biology. 6 (5), 555-563 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Kusuma, S., Macklin, B., Gerecht, S. Derivation and network formation of vascular cells from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1202, 1-9 (2014).
- Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).
- Kusuma, S., Shen, Y. -. I., Hanjaya-Putra, D., Mali, P., Cheng, L., Gerecht, S. Self-organized vascular networks from human pluripotent stem cells in a synthetic matrix. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12601-12606 (2013).
- Charwat, V., et al. Potential and limitations of microscopy and Raman spectroscopy for live-cell analysis of 3D cell cultures. Journal of Biotechnology. 205, 70-81 (2015).
- Holnthoner, W., et al. Adipose-derived stem cells induce vascular tube formation of outgrowth endothelial cells in a fibrin matrix. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (2), 127-136 (2012).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS ONE. 6 (11), 1-12 (2011).
- Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (9), 895-906 (2011).
- Rytlewski, J. A., Geuss, L. R., Anyaeji, C. I., Lewis, E. W., Suggs, L. J. Three-dimensional image quantification as a new morphometry method for tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (7), 507-516 (2012).
- Kerschnitzki, M., et al. Architecture of the osteocyte network correlates with bone material quality. Journal of Bone and Mineral Research. 28 (8), 1837-1845 (2013).
- Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via Wnt activation under defined conditions. Wnt Signaling: Methods and Protocols. 1481 (1), 183-196 (2016).
- Crosby, C. O., et al. Quantifying the vasculogenic potential of iPSC-derived endothelial progenitors in collagen hydrogels. Tissue Engineering Part A. , (2019).
- Li, C. H., Tam, P. K. S. An iterative algorithm for minimum cross entropy thresholding. Pattern Recognition Letters. 19 (8), 771-776 (1998).
- Kollmannsberger, P., Kerschnitzki, M., Repp, F., Wagermaier, W., Weinkamer, R., Fratzl, P. The small world of osteocytes: Connectomics of the lacuno-canalicular network in bone. New Journal of Physics. 19 (7), (2017).
- Crosby, C. O., Zoldan, J. Mimicking the physical cues of the ECM in angiogenic biomaterials. Regenerative Biomaterials. , (2019).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Kniazeva, E., Kachgal, S., Putnam, A. J., Ph, D. Effects of extracellular matrix density and mesenchymal stem cells on neovascularization in vivo. Tissue Engineering Part A. 17 (7-8), 905-914 (2011).
- Ghajar, C. M., et al. The effect of matrix density on the regulation of 3-D capillary morphogenesis. Biophysical Journal. 94 (5), 1930-1941 (2008).
- Morin, K. T., Smith, A. O., Davis, G. E., Tranquillo, R. T. Aligned human microvessels formed in 3D fibrin gel by constraint of gel contraction. Microvascular Research. 90, 12-22 (2013).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
