Menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) und andere primäre Endothelzelltypen werden seit zwei Jahrzehnten verwendet, um das Keimen von Blutgefäßen und die Entwicklung in vitro¹zu modellieren. Solche Gefäßplattformen versprechen, molekulare und Gewebe-Level-Mechanismen von Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu beleuchten und können physiologische Einblicke in die Entwicklung von primitiven Gefäßnetzwerken darstellen^2,3. Obwohl das Gebiet der vaskulären Modellierung erhebliche Fortschritte gemacht hat, bleibt ein “Goldstandard”-Assay, der die physiologische Gefäßentwicklung quantitativ modellieren und bewerten kann, schwer fassbar. Die meisten veröffentlichten Protokolle rekapitulieren die vaskuläre Nische nicht angemessen, um die Bildung reifer, funktioneller Blutgefäße zu fördern, oder verfügen nicht über eine Methode, um das vaskulogene Potenzial der untersuchten Zelltypen quantitativ in drei Dimensionen zu vergleichen ( 3D).

Viele aktuelle Vaskuläre Sind in ihrer Fähigkeit, die physiologische Vaskuläre Nische nachzuahmen, begrenzt. Eine der am häufigsten eingesetzten In-vitro-Plattformen ist der gelatinöse Protein-Gemisch-basierte Rohrbildungstest. Kurz gesagt, HUVECs werden als einzelne Zellen auf einer dünnen Gelschicht gesät, die aus Proteinen besteht, die aus der extrazellulären Matrix des murinen Sarkoms (ECM) geerntet werden; innerhalb von ein bis zwei Tagen bauen sich die HUVECs selbst in primitive Rohre⁴zusammen. Dieser Prozess findet jedoch in zwei Dimensionen (2D) statt und die in diesem Test verwendeten Endothelzellen (ECs) bilden keine geschlossenen, hohlen Lumen, wodurch die physiologische Bedeutung dieser Studien eingeschränkt wird. In jüngerer Zeit wurden ECs und unterstützende Zellen (z. B. mesenchymale Stammzellen (MSCs) und Pericyte) in 3D-Mikroumgebungen mitkultiviert, die die faserige Architektur des nativen ECM simulieren, wie Kollagen oder Fibrinhydrogele⁵. Um die Gefäßentwicklung in dieser Mikroumgebung zu modellieren, werden in der Regel mit ECs beschichtete Polymerperlen verwendet⁶. Die Zugabe von exogenen Wachstumsfaktoren und/oder Wachstumsfaktoren, die von anderen Zellen, die interstitiell in das Hydrogel eingebettet sind, sezerniert werden, kann die ECs, die die polymeren Perlen beschichten, dazu veranlassen, zu sprießen und ein einziges Lumen zu bilden; Die Anzahl und der Durchmesser von Sprossen und Gefäßen können dann berechnet werden. Diese Sprossen sind jedoch einzigartig und bilden kein geschlossenes, vernetztes Netzwerk, wie es bei physiologischen Bedingungen zu beobachten ist, und erinnern daher eher an ein Tumorvaskulaturmodell. Mikrofluidische Geräte wurden auch verwendet, um die vaskuläre Nische nachzuahmen und die Bildung von Vaskulatur in EC-beladenen Hydrogelen^7,8zu fördern. Typischerweise wird ein angiogener Wachstumsfaktor-Gradient auf das zirkulierende Zellkulturmedium angewendet, um DIE MIGRATION und das Keimen der EG zu induzieren. ECs, die das Lumen der entwickelten Gefäße bilden, reagieren empfindlich auf die Scherspannung, die durch die Anwendung des Flüssigkeitsflusses durch die mikrofluidische Vorrichtung verursacht wird; Daher erfassen diese mikrofluidischen Geräte wichtige physiologische Parameter, die in den statischen Modellen nicht zugänglich sind. Diese Geräte erfordern jedoch kostspielige Mikrofertigungsfähigkeiten.

Am wichtigsten ist, dass alle drei Vaskulärenmodelle (2D, 3D, mikrofluidic) überwiegend primäre ECs sowie primäre unterstützende Zelltypen nutzen. Primärzellen können nicht zu einer wirksamen kardiovaskulären Therapie entwickelt werden, da die Zellen bei der Implantation eine Immunantwort hervorrufen würden; Darüber hinaus sind HUVECs und ähnliche primäre Zelltypen nicht patientenspezifisch und erfassen keine Gefäßanomalien, die bei Patienten mit einer genetischen Disposition oder bereits bestehenden Gesundheitlichen Erkrankungen auftreten, z. B. Diabetes mellitus. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) haben sich in den letzten zehn Jahren als patientenspezifische, proliferative Zellquelle herauskristallisiert, die in alle somatischen Zellen im menschlichen Körper unterschieden werden kann⁹. Insbesondere wurden Protokolle veröffentlicht, die die Erzeugung und Isolierung von iPSC-abgeleiteten endotheliale Vorläuferitoren (iPSC-EPs)^10,11beschreiben; iPSC-EPs sind bipotent und lassen sich daher weiter in Endothelzellen und glatte Muskelzellen/Pericyten, die Bausteine einer reifen, funktionellen Vaskulatur, differenzieren. Nur eine Studie hat die Entwicklung eines primären Kapillarplexus aus iPSC-EPs in einer 3D-Mikroumgebung überzeugend detailliert beschrieben¹²; Obwohl diese Studie für das Verständnis der iPSC-EP-Montage und Differenzierung in natürlichen und synthetischen Hydrogelen von entscheidender Bedeutung ist, wurden die Netzwerktopologien der resultierenden Vaskulatur nicht quantitativ verglichen. Eine weitere aktuelle Studie hat das Polymerperlenmodell verwendet, um das Keimen von HUVECs und iPSC-abgeleiteten ECs⁵zu vergleichen. Daher besteht die klare Notwendigkeit, die physikalischen und chemischen Signalmechanismen, die die iPSC-EP-Vaskulogenese in 3D-Mikroumgebungen regulieren, weiter aufzuklären und festzustellen, ob diese Zellen für ischämische Therapien und Herz-Kreislauf-Erkrankungen geeignet sind. Modellierung.

In den letzten zehn Jahren wurden verschiedene Open-Source-Rechenpipelines und Skelettierungsalgorithmen entwickelt, um die Länge und Konnektivität von vaskulären Netzwerken zu quantifizieren und zu vergleichen. Zum Beispiel entwickelten Charwat et al. eine Photoshop-basierte Pipeline, um ein gefiltertes, binarisiertes Bild von Gefäßnetzwerken zu extrahieren, das aus einer Kokultur von adipose-abgeleiteten Stammzellen und Auswuchs-ECs in einer Fibrin-Matrix^13,14abgeleitet wurde. Das vielleicht am weitesten verbreitete Topologie-Vergleichstool ist AngioTool, ein Programm, das online vom National Cancer Institute¹⁵veröffentlicht wurde; trotz der weit verbreiteten Akzeptanz und gut dokumentierten Treue des Programms beschränkt sich das Programm auf die Analyse von schiffsähnlichen Strukturen in zwei Dimensionen und andere Programme, einschließlich AngioSys und Wimasis, teilen die gleiche Maßeinheitsbeschränkung¹⁶. Leistungsstarke Software-Suiten wie Imaris, Lucis und Metamorph wurden entwickelt, um die Netzwerktopologie der technischen Mikrovaskulatur zu analysieren; Diese Suiten sind jedoch für die meisten akademischen Labors kostenprohibitiv und beschränken den Zugriff auf den Quellcode, was die Fähigkeit des Endbenutzers, den Algorithmus an seine spezifische Anwendung anzupassen, behindern kann. 3D Slicer, ein Open-Source-Magnetresonanztomographie/Computertomographie-Paket, enthält ein Vascular Modeling Toolkit, das die Topologie von 3D-Gefäßnetzwerken effektiv analysieren kann¹⁷; Die Analyse hängt jedoch davon ab, dass der Benutzer die Endpunkte des Netzwerks manuell platziert, was bei der Analyse eines großen Datasets mühsam werden kann und durch die unbewussten Verzerrungen des Benutzers beeinflusst werden kann. In diesem Manuskript wird eine Rechnerpipeline beschrieben, die 3D-Gefäßnetzwerke quantifizieren kann. Um die oben beschriebenen Einschränkungen zu überwinden, verwendet diese Open-Source-Rechenpipeline ImageJ, um erfasste konfokale Bilder vorab zu verarbeiten, um das 3D-Volumen in einen Skelettanalysator zu laden. Der Skelettanalysator verwendet einen parallelen medialen Achsenausdünnungsalgorithmus und wurde ursprünglich von Kerschnitzki et al. entwickelt, um die Länge und Konnektivität von Osteozytennetzwerken zu analysieren¹⁸; Dieser Algorithmus kann effektiv angewendet werden, um die Länge und Konnektivität der technischen Mikrovaskulatur zu charakterisieren.

Insgesamt skizziert dieses Protokoll die Schaffung mikrovaskulärer Netzwerke in 3D-Mikroumgebungen und bietet eine Open-Source- und Benutzer-Bias-freie Rechenpipeline, um das vaskulogene Potenzial von iPSC-EPs leicht zu vergleichen.