Les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVECs) et d’autres types primaires de cellules endothéliales ont été employées pendant deux décennies pour modéliser la germination et le développement de vaisseaux sanguins in vitro^1. Ces plates-formes vasculaires promettent d’éclairer les mécanismes moléculaires et tissulaires des maladies cardiovasculaires et peuvent présenter un aperçu physiologique du développement des réseaux vasculaires primitifs^2,3. Bien que le domaine de la modélisation vasculaire ait connu des progrès significatifs, un essai « d’étalon-or » qui peut modéliser et évaluer quantitativement le développement vasculaire physiologique demeure insaisissable. La plupart des protocoles publiés ne récapitulent pas adéquatement la niche vasculaire pour encourager la formation de vaisseaux sanguins matures et fonctionnels ou n’ont pas de méthode pour comparer quantitativement le potentiel vasculogénique des types de cellules évaluées en trois dimensions ( 3D).

Beaucoup de modèles vasculaires actuels sont limités dans leur capacité à imiter la niche vasculaire physiologique. L’une des plates-formes in vitro les plus couramment utilisées est l’analyse de formation de tubes à base de mélange de protéines gélatineuses. En bref, les HUVEC sont ensevants sous forme de cellules uniques sur une fine couche de gel qui se compose de protéines récoltées à partir de la matrice extracellulaire du sarcome murine (ECM); dans un délai d’un à deux jours, les HUVEC s’auto-assemblent en tubes primitifs⁴. Cependant, ce processus se produit dans les deux dimensions (2D) et les cellules endothéliales (ECs) utilisées dans ce procès ne forment pas des lumens creux fermés, limitant ainsi la signification physiologique de ces études. Plus récemment, les EC et les cellules de soutien (p. ex., les cellules souches mésenchymales (MSC) et les péritéytes) ont été co-cultivées dans des microenvironnements 3D qui simulent l’architecture fibreuse de l’ECM indigène, comme le collagène ou les hydrogels à la fibrine⁵. Pour modéliser le développement vasculaire dans ce microenvironnement, les perles polymères enduites d’ECsont sont généralement employées⁶. L’ajout de facteurs de croissance exogènes et/ou de facteurs de croissance sécrétés par d’autres cellules incrustées interstitiellement dans l’hydrogel peut induire les CE, enduire les perles polymères, germer et former un lumen unique; le nombre et le diamètre des germes et des vaisseaux peuvent alors être calculés. Cependant, ces germes sont singuliers et ne forment pas un réseau clos et connecté comme on le voit dans des conditions physiologiques et rappelle donc plus un modèle de vascularisation tumorale. Des dispositifs microfluidiques ont également été utilisés pour imiter la niche vasculaire et pour promouvoir la formation de la vascularisation dans les hydrogels chargés d’EC^7,8. Typiquement, un facteur de croissance-gradient angiogénique est appliqué au milieu circulant de culture de cellules pour induire la migration et la germination d’EC. Les CE qui constituent le lumen des vaisseaux développés sont sensibles au stress de cisaillement induit par l’application du flux de fluide par le dispositif microfluidique ; ainsi, ces dispositifs microfluidiques capturent les paramètres physiologiques clés qui ne sont pas accessibles dans les modèles statiques. Cependant, ces dispositifs nécessitent des capacités de microfabrication coûteuses.

Plus important encore, les trois modèles vasculaires (2D, 3D, microfluidique) utilisent massivement les ECprimaires ainsi que les types de cellules primaires de soutien. Les cellules primaires ne peuvent pas être développées en une thérapie cardio-vasculaire efficace parce que les cellules engendreraient une réponse immunitaire à l’implantation ; en outre, les HUVEC et les types semblables de cellules primaires ne sont pas patients-spécifiques et ne saisissent pas des anomalies vasculaires qui se produisent dans les patients présentant une disposition génétique ou des conditions de santé préexistantes, par exemple, le diabète sucré. Les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) ont émergé au cours de la dernière décennie comme une source cellulaire proliférante spécifique au patient qui peut être différenciée en toutes les cellules somatiques du corps humain⁹. En particulier, des protocoles ont été publiés qui décrivent la génération et l’isolement des progéniteurs endothéliaux dérivés de l’iPSC (iPSC-EPs)^10,11; iPSC-EPs sont bipotents et peuvent, par conséquent, être différenciés en cellules endothéliales et cellules musculaires lisses / périytes, les éléments constitutifs de la maturité, vascularisation fonctionnelle. Une seule étude a détaillé de manière convaincante le développement d’un plexus capillaire primaire à partir d’iPSC-EPs dans un microenvironnement 3D¹²; bien que cette étude soit essentielle à la compréhension de l’assemblage iPSC-EP et à la différenciation dans les hydrogels naturels et synthétiques, elle n’a pas comparé quantitativement les topologies réseau de la vascularisation résultante. Une autre étude récente a utilisé le modèle de perle polymère pour comparer la germination des HUVEC et des EC 5 dérivés de l’iPSC. Par conséquent, il est clairement nécessaire d’élucider davantage les mécanismes de signalisation physique et chimique qui régulent la vasculogenèse iPSC-EP dans les microenvironnements 3D et de déterminer si ces cellules sont appropriées pour la thérapie ischémique et les maladies cardiovasculaires Modélisation.

Au cours de la dernière décennie, différents pipelines et algorithmes de squezation de réseau open source ont été développés pour quantifier et comparer la longueur et la connectivité du réseau vasculaire. Par exemple, Charwat et coll. ont mis au point un pipeline basé sur Photoshop pour extraire une image filtrée et binarisée des réseaux vasculaires dérivée d’une co-culture de cellules souches dérivées de l’adipose et d’ECs excroissance dans une matrice de fibrine^13,14. Peut-être l’outil de comparaison topologie le plus largement utilisé est AngioTool, un programme publié en ligne par l’Institut national du cancer^15; malgré l’adoption généralisée du programme et sa fidélité bien documentée, le programme se limite à l’analyse de structures semblables à des navires en deux dimensions et d’autres programmes, y compris AngioSys et Wimasis, partagent la même limitation de dimensionnalité¹⁶. De puissantes suites logicielles telles que Imaris, Lucis et Metamorph ont été développées pour analyser la topologie réseau de la microvasculature modifiée; cependant, ces suites sont prohibitives pour la plupart des laboratoires universitaires et limitent l’accès au code source, ce qui peut entraver la capacité de l’utilisateur final à personnaliser l’algorithme à leur application spécifique. 3D Slicer, un ensemble d’imagerie par résonance magnétique et de tomographie calculée en source, contient une trousse d’outils de modélisation vasculaire qui peut analyser efficacement la topologie des réseaux vasculaires 3D^17; cependant, l’analyse dépend de l’utilisateur plaçant manuellement les points de terminaison du réseau, qui peuvent devenir fastidieux lors de l’analyse d’un grand jeu de données et peuvent être influencés par les biais subconscients de l’utilisateur. Dans ce manuscrit, un pipeline computationnel qui peut quantifier les réseaux vasculaires 3D est décrit en détail. Pour surmonter les limites décrites ci-dessus, ce pipeline de calcul open source utilise ImageJ pour pré-traiter les images confocalisées acquises pour charger le volume 3D dans un analyseur squelette. L’analyseur de squelette utilise un algorithme d’amincissement médial parallèle de l’axe, et a été initialement développé par Kerschnitzki et coll. pour analyser la longueur et la connectivité des réseaux d’ostéocytes¹⁸; cet algorithme peut être appliqué efficacement pour caractériser la longueur et la connectivité de la microvasculature modifiée.

Au total, ce protocole décrit la création de réseaux microvasculaires dans les microenvironnements 3D et fournit un pipeline de calcul libre et libre de biais utilisateur et open-source pour comparer facilement le potentiel vasculogénique des iPSC-EPs.