Een in vitro 3D-model en computationele pijpleiding om het Vasculogenic potentieel van door iPSC afgeleide Endotheelprogenitors te kwantificeren
Summary
Endotheliale voor ouders die zijn afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC-EPs) hebben het potentieel om de behandeling van cardiovasculaire aandoeningen te revolutioneren en om de creatie van meer getrouwe cardiovasculaire ziekte modellen mogelijk te maken. Hierin wordt de inkaping van iPSC-EPs in driedimensionale (3D) collageen micro omgevingen en een kwantitatieve analyse van het vasculogene potentieel van deze cellen beschreven.
Abstract
Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) zijn een patiëntspecifieke, proliferatieve celbron die zich kan onderscheiden in een somatisch celtype. Bipotente endotheliale voorlopercellen (EPs), die kunnen differentiëren in de celtypen die nodig zijn voor het monteren van volwassen, functionele vasculatuur, zijn afgeleid van zowel embryonale en geïnduceerde pluripotente stammen. Echter, deze cellen zijn niet rigoureus geëvalueerd in driedimensionale omgevingen, en een kwantitatieve maatstaf van hun vasculogenic potentieel blijft ongrijpbaar. Hier worden de generatie en isolatie van iPSC-EPs via TL-geactiveerde celsortering eerst geschetst, gevolgd door een beschrijving van de inkaping en cultuur van iPSC-EPs in collageen hydrogels. Deze extracellulaire matrix (ECM)-nabootsen micro omgeving stimuleert een robuuste vasculogenic reactie; vasculaire netwerken vormen na een week van cultuur. De creatie van een computationele pijpleiding die open-source software gebruikt om deze vasculogene respons te kwantificeren wordt afgebakend. Deze pijplijn is speciaal ontworpen om de 3D-architectuur van de capillaire plexus te behouden om krachtig het aantal vertakkingen, vertakkingspunten en de totale netwerk lengte met minimale gebruikersinvoer te identificeren.
Introduction
Humane navelstreng ader endotheliale cellen (huvecs) en andere primaire endotheliale celtypen zijn gebruikt voor het modelleren van bloedvat kiemen en ontwikkeling in vitro1. Dergelijke vasculaire platformen beloven om te verlichten van de moleculaire en weefsel-niveau mechanismen van hart-en vaatziekten en fysiologische inzicht in de ontwikkeling van primitieve vasculaire netwerken2,3kunnen presenteren. Hoewel het gebied van vasculaire modellering aanzienlijke vooruitgang heeft gekend, is een “gouden standaard”-assay die de fysiologische vasculaire ontwikkeling kwantitatief kan modelleren en beoordelen nog ongrijpbaar. De meeste gepubliceerde protocollen kunnen de vasculaire niche niet adequaat recapituleren om de vorming van volwassen, functionele bloedvaten aan te moedigen of hebben geen methode om het vasculogene potentieel van de beoordeelde celtypen in drie dimensies te vergelijken ( 3D).
Veel huidige vasculaire modellen zijn beperkt in hun vermogen om na te bootsen de fysiologische vasculaire niche. Een van de meest gebruikte in vitro platforms is de geleiachtige eiwitmengsel-gebaseerde buis vorming assay. In het kort worden HUVECs als enkelvoudige cellen op een dun laagje gel, dat bestaat uit eiwitten die zijn geoogst uit de muriene Sarcoom extracellulaire matrix (ECM); binnen een tot twee dagen, de HUVECs zelf-assembleren in primitieve buizen4. Dit proces vindt echter plaats in twee dimensies (2D) en de endotheliale cellen (ECs) die in deze test worden gebruikt, vormen geen ingesloten, holle lumen, waardoor de fysiologische betekenis van deze onderzoeken wordt beperkt. Meer recentelijk zijn ECs en ondersteunende cellen (bijv. mesenchymale stamcellen (MSCs) en pericytes) gecocultureerd in 3D-Micro omgevingen die de vezelachtige architectuur van de inheemse ECM simuleren, zoals collageen of fibrine hydrogels5. Voor het model van vasculaire ontwikkeling in deze micro-omgeving, polymere kralen bekleed met ECs worden meestal gebruikt6. De toevoeging van exogene groeifactoren en/of groeifactoren afgescheiden door andere cellen interstitially ingebed in de hydrogel kan de ECs induceren, coating van de polymere kralen, ontkiemen en vormen van enkelvoudig lumen; het aantal en de diameter van kiemgroenten en vaten kunnen vervolgens worden berekend. Echter, deze spruiten zijn enkelvoud en vormen geen gesloten, verbonden netwerk zoals wordt gezien in fysiologische omstandigheden en dus meer doet denken aan een tumor therapieën model. Microfluïdische apparaten zijn ook gebruikt om de vasculaire niche na te bootsen en om de vorming van vasculatuur in EC-beladen hydrogels7,8te bevorderen. Typisch wordt een angiogene groeifactor-gradiënt toegepast op het circulerende celkweekmedium om de migratie van de EG en het kiemen te induceren. ECs die het lumen van de ontwikkelde schepen vormen zijn gevoelig voor de shear stress geïnduceerd door de toepassing van vloeistof stroom door het microfluïdische apparaat; Dus, deze microfluïdische apparaten vastleggen belangrijke fysiologische parameters die niet toegankelijk zijn in de statische modellen. Echter, deze apparaten vereisen dure microfabricage capaciteiten.
Belangrijker nog, alle drie vasculaire modellen (2D, 3D, microfluidic) overweldigend gebruik van primaire ECs en primaire ondersteunende celtypen. Primaire cellen kunnen niet worden ontwikkeld tot een effectieve cardiovasculaire therapie omdat de cellen een immuunrespons bij implantatie zouden hebben; Bovendien zijn HUVECs en soortgelijke primaire celtypen niet patiëntspecifiek en vangen ze geen vasculaire afwijkingen op die optreden bij patiënten met een genetische dispositie of reeds bestaande veterinairrechtelijke voorschriften, bijvoorbeeld diabetes mellitus. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) zijn in het afgelopen decennium ontstaan als een patiëntspecifieke, proliferatieve celbron die kan worden gedifferentieerd in alle somatische cellen in het menselijk lichaam9. In het bijzonder zijn er protocollen gepubliceerd die de opwekking en isolatie van door iPSC afgeleide endotheelprogenitoren (iPSC-EPs)10,11beschrijven; iPSC-EPs zijn bipotent en kunnen daarom verder worden gedifferentieerd in endotheliale cellen en gladde spiercellen/pericytes, de bouwstenen van volwassen, functionele vasculatuur. Slechts één studie heeft overtuigend gedetailleerd de ontwikkeling van een primaire capillaire plexus van iPSC-EPs in een 3D-Micro-omgeving12; Hoewel deze studie van cruciaal belang is voor een goed begrip van iPSC-EP-assemblage en differentiatie in natuurlijke en synthetische hydrogels, vergelijkt het de netwerktopologieën van de resulterende vasculatuur niet kwantitatief. Een andere recente studie heeft het polymere kraal model gebruikt om het ontkiemen van HUVECs en iPSC-afgeleide ECs5te vergelijken. Daarom is er een duidelijke noodzaak om de fysische en chemische signalerings mechanismen die iPSC-EP-vasculogenese in 3D-Micro-omgevingen reguleren, verder te verhelderden en om te bepalen of deze cellen geschikt zijn voor ischemische therapie en cardiovasculaire aandoeningen Modeling.
In het afgelopen decennium, verschillende open-source computationele pijpleidingen en skeletonisatie algoritmen zijn ontwikkeld om te kwantificeren en vergelijk vasculaire netwerk lengte en connectiviteit. Bijvoorbeeld, charwat et al. ontwikkelde een op Photoshop gebaseerde pijplijn om een gefilterd, gebinariseerd beeld van vasculaire netwerken te extraheren, afgeleid van een co-cultuur van door de vetweefsel afgeleide stamcellen en uitgroei ECs in een fibrinematrix13,14. Misschien wel de meest gebruikte topologie vergelijking tool is angio tool, een programma online gepubliceerd door de National Cancer Institute15; Ondanks de wijdverbreide adoptie en goed gedocumenteerde getrouwheid van het programma, is het programma beperkt tot het analyseren van bloedvat achtige structuren in twee dimensies en andere Programma’s, waaronder AngioSys en Wimasis, met dezelfde dimensionaliteits beperking16. Krachtige software suites zoals Imaris, Lucis en Metamorph zijn ontwikkeld om de netwerktopologie van engineered microvasculature te analyseren; Deze suites zijn echter kostenbelemmerend voor de meeste academische laboratoria en beperken de toegang tot de broncode, wat het vermogen van de eindgebruiker om het algoritme aan te passen aan hun specifieke toepassing kan belemmeren. 3D slicer, een open-source magnetische resonantie imaging/computertomografie pakket, bevat een vasculaire Modeling Toolkit die effectief kan analyseren van de topologie van 3D vasculaire netwerken17; de analyse is echter afhankelijk van de gebruiker die de eindpunten van het netwerk handmatig plaatst, wat vervelend kan worden bij het analyseren van een grote gegevensset en kan worden beïnvloed door onbewuste biases van de gebruiker. In dit manuscript wordt een computationele pijplijn die 3D-vasculaire netwerken kan kwantificeren in detail beschreven. Om de bovengenoemde beperkingen te overwinnen, gebruikt deze open source computationele pijplijn ImageJ voor het vooraf verwerken van confocale afbeeldingen om het 3D-volume in een skelet analysator te laden. De Skeleton Analyzer gebruikt een parallel mediale Axis dunner wordend-algoritme en werd oorspronkelijk ontwikkeld door kerschnitzki et al. om de lengte en connectiviteit van osteocyte netwerken te analyseren18; Dit algoritme kan effectief worden toegepast om de lengte en connectiviteit van engineered microvasculature te karakteriseren.
In totaal schetst dit protocol de creatie van microvasculaire netwerken in 3D-Micro-omgevingen en biedt het een open-source en User-bias gratis computationele pijplijn om het vasculogenic potentieel van iPSC-EPs gemakkelijk te vergelijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol omvat de lange termijn cultuur van cellen in drie soorten celkweek media: E8, LaSR basal en EGM-2. Daarom moet er veel zorg worden besteed aan het adequaat steriliseren van alle materialen. Bovendien moeten labjassen en met ethanol gereinigde handschoenen altijd worden gedragen bij het werken in de laminaire stroom afzuigkap van het laboratorium. Het wordt aanbevolen om regelmatig te testen op Mycoplasma besmetting; Als een grote hoeveelheid vuil wordt waargenomen tijdens de iPSC-cultuur of een plotselinge d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de American Heart Association (subsidie nummer 15SDG25740035, toegekend aan J.Z.), het National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) van de National Institutes of Health (subsidie nummer EB007507, toegekend aan C.C.), en de Alliantie voor regeneratief revalidatie onderzoek & training (AR3T, grantnummer 1 P2C HD086843-01, toegekend aan J.Z.). We willen Prof. Jeanne Stachowiak (de Universiteit van Texas in Austin) graag erkennen voor haar technisch advies over confocale microscopie. We zijn ook dankbaar voor de besprekingen met Samuel Mihelic (de Universiteit van Texas in Austin), Dr. Alicia allen (de Universiteit van Texas in Austin), Dr. Julie Rytlewski (Adaptive Biotech) en Dr. Leon Bellan (Vanderbilt University) voor hun inzicht in de computationele analyse van 3D-netwerken. Tot slot danken we Dr. Xiaoping Bao (University of California, Berkeley) voor zijn advies over het differentiëren van iPSCs in iPSC-EPs.
Materials
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | N/A | A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging |
| 96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile | Corning | 7007 | Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Scientific | 12634010 | The base media for iPSC-EP differentiation. |
| Barnstead GenPure xCAD Plus | Thermo Fisher Scientific | 50136165 | Water purification system; others can be readily substituted |
| Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture | Fisher Scientific | A8412 | To preserve cell viability when FACs sorting |
| CD34-PE, human (clone: AC136) | Miltenyi Biotec | 130-098-140 | Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs |
| CHIR99021 | LC Laboratories | C-6556 | Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells |
| Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg | VWR | 354249 | Main component of the 3D microenvironment |
| Conical centrifuge tubes (15/50 mL) | Fisher Scientific | 14-959-49D/A | Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | To counterstain and visualize cell nuclei |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-250 | To wash monolayer cultures |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E8008 | For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | Promotes endothelial cell viability and proliferation |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For maintenance of pluripotent stem cells |
| Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT) | Sigma-Aldrich | 50046 | Neutralizes remaining detergent |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95% | Sigma-Aldrich | A8960 | Component of iPSC-EP differentiation medium |
| MATLAB | MathWorks | 1.8.0_152 | Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions) |
| Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture) | Fisher Scientific | 356231 | Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation |
| Medium-199 10X | Thermo Fisher Scientific | 1825015 | Used to balance final hydrogel osmolarity and pH |
| Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | VWR | 87003-294 | Stores small volumes of reagents |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | The main ingredient of the immunostaining solutions |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument |
| Recombinant Human VEGF 165 Protein | R&D Systems | 293-VE | Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis |
| Rhodamine phalloidin | Themo Fisher Scientific | R415 | To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks |
| Triton X-100 (nonionic surfactant) | Sigma-Aldrich | X-100 | Detergent used to gently permeabilize cells |
| Tween-20 (emulsifying reagent) | Fisher Scientific | BP337 | Increases the binding specificity of the added antibodies |
| VE-Cadherin (F-8) | Santa Cruz Biotechnology | sc-9989 | To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels |
| Vitronectin | ThermoFisher | A14700 | For maintenance of pluripotent stem cells |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded |
Referências
- Wang, K., Lin, R. -. Z., Melero-Martin, J. M. Bioengineering human vascular networks: trends and directions in endothelial and perivascular cell sources. Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-19 (2018).
- Kant, R. J., Coulombe, K. L. K. Integrated approaches to spatiotemporally directing angiogenesis in host and engineered tissues. Acta Biomaterialia. 69, 42-62 (2018).
- Briquez, P. S., Clegg, L. E., Martino, M. M., Mac Gabhann, F., Hubbell, J. A. Design principles for therapeutic angiogenic materials. Nature Reviews Materials. 1 (1), 1-15 (2016).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: State of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
- Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures. Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).
- Nakatsu, M. N., et al. VEGF121 and VEGF165 regulate blood vessel diameter through vascular endothelial growth factor receptor 2 in an in vitro angiogenesis model. Laboratory Investigation. 83 (12), 1873-1885 (2003).
- Shamloo, A., Heilshorn, S. C. Matrix density mediates polarization and lumen formation of endothelial sprouts in VEGF gradients. Lab on a Chip. 10 (22), 3061 (2010).
- Jeon, J. S., et al. Generation of 3D functional microvascular networks with human mesenchymal stem cells in microfluidic systems. Integrative Biology. 6 (5), 555-563 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Kusuma, S., Macklin, B., Gerecht, S. Derivation and network formation of vascular cells from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1202, 1-9 (2014).
- Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).
- Kusuma, S., Shen, Y. -. I., Hanjaya-Putra, D., Mali, P., Cheng, L., Gerecht, S. Self-organized vascular networks from human pluripotent stem cells in a synthetic matrix. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12601-12606 (2013).
- Charwat, V., et al. Potential and limitations of microscopy and Raman spectroscopy for live-cell analysis of 3D cell cultures. Journal of Biotechnology. 205, 70-81 (2015).
- Holnthoner, W., et al. Adipose-derived stem cells induce vascular tube formation of outgrowth endothelial cells in a fibrin matrix. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (2), 127-136 (2012).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS ONE. 6 (11), 1-12 (2011).
- Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (9), 895-906 (2011).
- Rytlewski, J. A., Geuss, L. R., Anyaeji, C. I., Lewis, E. W., Suggs, L. J. Three-dimensional image quantification as a new morphometry method for tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (7), 507-516 (2012).
- Kerschnitzki, M., et al. Architecture of the osteocyte network correlates with bone material quality. Journal of Bone and Mineral Research. 28 (8), 1837-1845 (2013).
- Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via Wnt activation under defined conditions. Wnt Signaling: Methods and Protocols. 1481 (1), 183-196 (2016).
- Crosby, C. O., et al. Quantifying the vasculogenic potential of iPSC-derived endothelial progenitors in collagen hydrogels. Tissue Engineering Part A. , (2019).
- Li, C. H., Tam, P. K. S. An iterative algorithm for minimum cross entropy thresholding. Pattern Recognition Letters. 19 (8), 771-776 (1998).
- Kollmannsberger, P., Kerschnitzki, M., Repp, F., Wagermaier, W., Weinkamer, R., Fratzl, P. The small world of osteocytes: Connectomics of the lacuno-canalicular network in bone. New Journal of Physics. 19 (7), (2017).
- Crosby, C. O., Zoldan, J. Mimicking the physical cues of the ECM in angiogenic biomaterials. Regenerative Biomaterials. , (2019).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Kniazeva, E., Kachgal, S., Putnam, A. J., Ph, D. Effects of extracellular matrix density and mesenchymal stem cells on neovascularization in vivo. Tissue Engineering Part A. 17 (7-8), 905-914 (2011).
- Ghajar, C. M., et al. The effect of matrix density on the regulation of 3-D capillary morphogenesis. Biophysical Journal. 94 (5), 1930-1941 (2008).
- Morin, K. T., Smith, A. O., Davis, G. E., Tranquillo, R. T. Aligned human microvessels formed in 3D fibrin gel by constraint of gel contraction. Microvascular Research. 90, 12-22 (2013).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
