Humane navle formede vene endotelceller (HUVECs) og andre primære endotelcelle typer er blevet udnyttet i to årtier til model blodkar spiring og udvikling in vitro¹. Sådanne vaskulære platforme lover at belyse molekylære og vævs-niveau mekanismer af hjerte-kar-sygdom og kan præsentere fysiologisk indsigt i udviklingen af primitive vaskulære netværk^2,3. Selvom feltet af vaskulær modellering har været vidne til betydelige fremskridt, en “guld standard” assay, der kan kvantitativt model og vurdere fysiologiske vaskulære udvikling forbliver undvigende. De fleste offentliggjorte protokoller ikke i tilstrækkelig grad rekapitulere den vaskulære niche til at fremme dannelsen af modne, funktionelle blodkar eller ikke har en metode til kvantitativt at sammenligne vasculogenic potentiale af de vurderede celletyper i tre dimensioner ( 3D).

Mange nuværende vaskulære modeller er begrænset i deres evne til at efterligne den fysiologiske vaskulære niche. En af de mest almindeligt anvendte in vitro-platforme er den gelatinøse protein blandings baserede rørdannelses analyse. Kort, HUVECs er seedet som enkeltceller på et tyndt lag af gel, der består af proteiner høstet fra murine sarkom ekstracellulær matrix (ECM); inden for en til to dage, HUVECs selv samles i primitive rør⁴. Denne proces forekommer dog i to dimensioner (2D), og endotelcellerne (ECs), der anvendes i denne analyse, danner ikke indesluttet, hule lumen og begrænser derved den fysiologiske betydning af disse undersøgelser. For nylig er ECs og understøttende celler (f. eks. mesenchymal stamceller (MSCS) og pericytes) blevet Co-dyrket i 3D-mikromiljøer, der simulerer den lokale ECM-fiber arkitektur, såsom kollagen eller fibrin silicagelrogeler⁵. At modellere vaskulære udvikling i dette mikromiljø, polymere perler belagt med ECs er typisk ansat⁶. Tilføjelsen af eksogene vækstfaktorer og/eller vækstfaktorer udskillet af andre celler interstitielt indlejret i hydrogel kan inducere ECs, belægning af polymere perler, at spire og danne enkelt lumen; antallet og diameteren af spirer og fartøjer kan derefter beregnes. Men disse spirer er ental og ikke danner en lukket, forbundet netværk som ses i fysiologiske forhold og dermed er mere minder om en tumor Vaskulaturen model. Microfluidic enheder er også blevet udnyttet til at efterligne den vaskulære niche og til at fremme dannelsen af Vaskulaturen i EC-laden silicagelrogeler^7,8. Typisk påføres en angiogen vækstfaktor-gradient på det cirkulerende cellekulturmedium for at inducere EF-migration og spiring. ECs, der udgør lumen af udviklede fartøjer er følsomme over for forskydnings stress induceret af anvendelsen af fluid flow gennem mikrofluidisk enhed; således, disse mikrofluidisk enheder fange vigtige fysiologiske parametre, der ikke er tilgængelige i de statiske modeller. Men, disse enheder kræver dyre mikrofabrikation evner.

Vigtigst af alt, alle tre vaskulære modeller (2D, 3D, microfluidic) overvældende udnytte primære ECs samt primære understøttende celletyper. Primære celler kan ikke udvikles til en effektiv kardiovaskulær behandling, fordi cellerne vil skabe en immunrespons ved implantation; Desuden er Huvec’er og lignende primære celletyper ikke patientspecifikke og indfanger ikke vaskulære abnormaliteter, der forekommer hos patienter med genetisk disposition eller allerede eksisterende helbredstilstande, f. eks. Inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) er dukket op i det seneste årti som en patientspecifik, proliferativ celle kilde, der kan differentieres i alle somatiske celler i den menneskelige krop⁹. Navnlig er der offentliggjort protokoller, som skitserer dannelse og isolering af iPSC-afledte endotelorer (iPSC-EPs)^10,11; iPSC-EPs er bipotent og kan derfor være yderligere differentieret i endotelceller og glatte muskelceller/pericytes, byggestenene i moden, funktionel vaskulatur. Kun én undersøgelse har overbevisende beskrevet udviklingen af en primær kapillar plexus fra iPSC-EPs i et 3D-mikromiljø¹²; selv om denne undersøgelse er afgørende for en forståelse af iPSC-EP forsamling og differentiering i naturlige og syntetiske hydrogels, det ikke kvantitativt sammenligne nettopologier af den resulterende Vaskulaturen. En anden nylig undersøgelse har brugt den polymere perle model til at sammenligne spiring af HUVECs og iPSC-afledte ECs⁵. Derfor er der et klart behov for yderligere at belyse de fysiske og kemiske signalerings mekanismer, der regulerer iPSC-EP vasculogenesis i 3D-mikromiljøer, og for at afgøre, om disse celler egner sig til iskæmisk behandling og Kardiovaskulær sygdom Modellering.

I det seneste årti, forskellige open-source beregningsmæssige pipelines og skeletonization algoritmer er blevet udviklet til at kvantificere og sammenligne vaskulære netværk længde og tilslutningsmuligheder. For eksempel, charwat et al. udviklet en Photoshop-baserede pipeline til at udtrække en filtreret, binarized billede af vaskulære netværk afledt af en co-kultur af Adipose-afledte stamceller og udvækst ECs i en fibrin matrix^13,14. Måske den mest udbredte topologi sammenligning værktøj er AngioTool, et program offentliggjort online af National Cancer Institute¹⁵; på trods af programmets udbredte vedtagelse og veldokumenteret troskab, programmet er begrænset til at analysere fartøj-lignende strukturer i to dimensioner og andre programmer, herunder AngioSys og Wimasis, deler den samme dimensionalitet begrænsning¹⁶. Kraftfulde software suiter som Imaris, Lucis og Metamorph er blevet udviklet til at analysere netværkstopologien af manipuleret mikrovaskulatur; men disse suiter er cost-prohibitive for de fleste akademiske laboratorier og begrænse adgangen til kildekoden, som kan hæmme muligheden for slutbrugeren til at tilpasse algoritmen til deres specifikke anvendelse. 3D slicer, en open source magnetisk resonans imaging/computertomografi pakke, indeholder en vaskulær modellering Toolkit, der effektivt kan analysere topologi af 3D vaskulære netværk¹⁷; Men, analysen er afhængig af brugeren manuelt placere slutpunkter af netværket, som kan blive kedelig, når du analyserer et stort datasæt og kan påvirkes af brugerens underbevidste bias. I dette manuskript er en beregnings pipeline, der kan kvantificere 3D-vaskulære netværk, beskrevet i detaljer. For at overvinde de ovenfor skitserede begrænsninger, bruger denne open source Computational pipeline ImageJ til at forbehandle erhvervede confokale billeder for at indlæse 3D-volumen i en skelet analysator. Skelet analysatoren bruger en parallel mediale-akse udtynding algoritme, og blev oprindeligt udviklet af Kerschnitzki et al. at analysere længden og forbindelsen af osteocyte Networks¹⁸; denne algoritme kan effektivt anvendes til at karakterisere længden og konnektivitet af manipuleret microvasculature.

I alt, denne protokol skitserer oprettelsen af microvaskulære netværk i 3D mikromiljøer og giver en open-source og User-bias gratis Computational pipeline til let sammenligne vasculogenic potentiale af iPSC-EPs.