Dagliga ljusbehandling med rött ljus att reglera Candida albicans Biofilm tillväxt
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att bedöma resultatet av rött ljus ansökan om tillväxten av Candida albicans biofilm. En icke-koherent rött ljus enhet med våglängd 635 nm och energitäthet av 87,6 J·cm-2 tillämpades under hela tillväxten av Candida albicans biofilmer för 48 h.
Abstract
Här presenterar vi ett protokoll för att bedöma resultaten av traktamente rött ljus behandling på tillväxten av Candida albicans biofilm. För att öka plankton tillväxten av C. albicans SN425, växte inoculums på jäst kväve Base media. För biofilm bildning tillämpades RPMI 1640 media, som har höga halter av aminosyror, för att hjälpa biofilm tillväxt. Biofilmer på 48 h behandlades två gånger dagligen under en period av 1 min med en icke-koherent ljus enhet (rött ljus, våglängd = 635 nm; energitäthet = 87,6 J·cm-2). Som en positiv kontroll (PC), 0,12% klorhexidin (CHX) tillämpades, och som en negativ kontroll (NC), 0,89% NaCl tillämpades på biofilmer. Kolonibildande enheter (CFU), torr vikt, lösliga och olösliga exopolysaccharides kvantifierades efter behandlingar. Kortfattat, det protokoll som presenteras här är enkel, reproducerbar och ger svar om livskraft, torr-vikt och extracellulära polysackarid belopp efter rött ljus behandling.
Introduction
Den ökade incidensen av diabetes, immunsuppressiv terapi program, HIV-infektion, AIDS-epidemin, kliniska ingrepp och brett spektrum antibiotika förbrukning under de senaste åren har ökade incidensen av Candida albicans relaterade sjukdomar1,2. C. albicans infektioner är ofta relaterade till biofilm utveckling och kan orsaka kliniska manifestationer, exempelvis candidiasis eller systemiska manifestationer, såsom candidemi1,2. En av de mest anmärkningsvärda virulensfaktorer biofilm tillväxt är extracellulära polysackarid matrix etableringen. Biofilm bildning samarbetar för att öka motståndet mot befintliga svampdödande läkemedel, miljöbelastning och värd immunologiska mekanismer3.
Biofilm tillväxten av C. albicans börjar med plankton celler tidig anslutning till ett substrat, följt av förökningen av jästceller genom substrat yta och hyphal tillväxt. Den sista fasen av biofilm tillväxt är den mognad fasen, vari jäst-liknande utvecklingen dämpas, hyphal utveckling expanderar och extracellulärmatrix omsluter den biofilm4. C. albicans exopolysaccharides (EPS) i matrisen samverkar för att bilda mannan-glukan komplexa5,6. Växelverkan av exopolysaccharides är avgörande för försvar av biofilmer mot droger7. Minskning av EPS från C. albicans extracellulärmatrix kunde därför stödja utvecklingen av nya antimikrobiella protokoll för oral candidos kontroll.
Ljus reglerar tillväxt, utveckling och uppförande av flera organismer8 och den har använts som en antimikrobiell i fotodynamisk antimikrobiell kemoterapi (PACT). PAKTEN gäller en synligt ljus av en viss våglängd och en ljus-absorberande photosensitizer9. Photosensitizers har dock svårigheter att penetrera biofilmen, orsakar lägre effekt10. Terapeutiska medel underlåtenhet att fullt infiltrera biofilmer är en anledning att biofilmer ibland motstå traditionell antimikrobiell terapi3,5. Om du vill inaktivera bifogade mikrobiella cellerna, behöver antimikrobiella ämnen genomsyra genom den extracellular matrisen; dock karaktäriserar EPS en diffusionsstyrd hinder för sådana molekyler genom att fråga deras nivå av transport in i biofilm eller genom att påverka svaret av det antimikrobiella medlet uteslutande med matrisen själv11.
Med tanke på nackdelarna med pakten, användningen av ljus i sig framstår som en värdefull förbättring. Preliminära data visade att behandling med blått ljus dagligen betydligt hämmade produktionen av EPS-olöslig i Streptococcus mutans biofilm. Av minskningen av EPS-olöslig minskat blått ljus biofilm tillväxt. Dock är resultaten av ljusbehandling med rött ljus i C. albicans biofilmer knappa. Därför var syftet med denna undersökning att utvärdera i vilken sätt ljusbehandling med rött ljus påverkar tillväxt och arrangemang av C. albicans biofilm. För behandling två gånger dagligen, vi anpassat våra laboratoriets föregående protokoll9,12 för att ge en lätt och reproducerbara biofilm modell som ger svar om livskraft, torr-vikt och extracellulära polysackarider belopp efter rött ljus behandling. Samma protokoll som kan användas för att testa andra behandlingar.
Protocol
Representative Results
Discussion
De viktigaste stegen för framgångsrik odling av C. albicans biofilm är: 1) att göra det före inokulatet och inokulatet i YNB medium kompletteras med 100 mM glukos; (2) att vänta 90 min för fasen vidhäftning och noggrant tvätta två gånger brunnarna med 0,89% NaCl att avlägsna icke-följs celler; och 3) lägga till RPMI medium till klibbade cellerna att starta biofilm bildning, eftersom RPMI kommer att stimulera hyfer tillväxten. Aneuploidies kan uppstå när odling C. albicans. Det är där…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Paula da Silveira, Dr Cecília Atem Gonçalves de Araújo Costa, Shawn M. Maule, Shane M. Maule, Dr Malvin N. Janal och Dr. Iriana Zanin för utvecklingen av denna studie. Vi erkänner också Dr. Alexander D. Johnson (UCSF) för att donera den stam som analyseras i denna studie.
Materials
| Clorhexidine 20% | Sigma-Aldrich | C9394 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydroous | Fisher Chemical | D16-500 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories | DSP-MD.43 | |
| LumaCare LC-122 A | LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA | ||
| NaCl | Fisher Chemical | S641-500 | |
| NaOH | Fisher Bioreagents | BP 359-500 | |
| Phenol 5% | Milipore Sigma | 843984 | |
| RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino) | Sigma | R7755 | |
| Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicol | Acumedia | 7306A | |
| Sulfuric acid | Fisher Chemical | SA200-1 | |
| Yeast nitrogen base | Difco | DF0392-15-9 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| 24-well polystyrene plate | Falcon | 353935 |
Referências
- Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, J. M. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62 (Pt 1), 10-24 (2013).
- Harriott, M. M., Noverr, M. C. Candida albicans and Staphylococcus aureus form polymicrobial biofilms: effects on antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3914-3922 (2009).
- Srinivasan, A., Lopez-Ribot, J. L., Ramasubramanian, A. K. Overcoming antifungal resistance. Drug Discovery Today Technologies. 11, 65-71 (2014).
- Finkel, J. S., Mitchell, A. P. Genetic control of Candida albicans biofilm development. Nature Reviews Microbiology. 9 (2), 109-118 (2011).
- Zarnowski, R., et al. Novel entries in a fungal biofilm matrix encyclopedia. MBio. 5, e013333 (2014).
- Mitchell, K. F., et al. Community participation in biofilm matrix assembly and function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4092-4097 (2015).
- Mitchell, K. F., Zarnowski, R., Andes, D. R. Fungal super glue: the biofilm matrix and its composition, assembly, and functions. PLoS Pathogens. 12, e1005828 (2016).
- Dai, T., et al. Blue light rescues mice from potentially fatal Pseudomonas aeruginosa burn infection: efficacy, safety, and mechanism of action. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (3), 1238-1245 (2013).
- de Sousa, D. L., Lima, R. A., Zanin, I. C., Klein, M. I., Janal, M. N., Duarte, S. Effect of twice-daily blue light treatment on matrix-rich biofilm development. PLoS One. 10 (7), e0131941 (2015).
- Fontana, C. R., et al. The antibacterial effect of photodynamic therapy in dental plaque-derived biofilms. Journal of Periodontal Research. 44 (6), 751-759 (2009).
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
- Panariello, B. H. D., Klein, M. I., Pavarina, A. C., Duarte, S. Inactivation of genes TEC1 and EFG1 in Candida albicans influences extracellular matrix composition and biofilm morphology. Journal of Oral Microbiology. 9 (1), 1385372 (2017).
- Gulati, M., Lohse, M. B., Ennis, C. L., Gonzalez, R. E., Perry, A. M., Bapat, P., Valle Arevalo, A., Rodriguez, D. L., L, D., Nobile, C. J. In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), e60 (2018).
- Roberts, A. E., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3646-3661 (2015).
- Kucharíková, S., Tournu, H., Lagrou, K., Van Dijck, P., Bujdáková, H. Detailed comparison of Candida albicans and Candida glabrata biofilms under different conditions and their susceptibility to caspofungin and anidulafungin. Journal of Medical Microbiology. 60 (Pt 9), 1261-1269 (2011).
- Weerasekera, M. M., Wijesinghe, G. K., Jayarathna, T. A., et al. Culture media profoundly affect Candida albicans and Candida tropicalis growth, adhesion and biofilm development. Memórias Do Instituto Oswaldo Cruz. 111 (11), 697-702 (2016).
- Kadosh, D., Johnson, A. D. Induction of the Candida albicans filamentous growth program by relief of transcriptional repression: a genome-wide analysis. Molecular biology of the cell. 16 (6), 2903-2912 (2005).
- Paschoal, M. A., Lin, M., Santos-Pinto, L., Duarte, S. Photodynamic antimicrobial chemotherapy on Streptococcus mutans using curcumin and toluidine blue activated by a novel LED device. Lasers in Medical Science. 30 (2), 885-890 (2015).
