מחקר על חילוף החומרים של שישה קוטלי חרקים מערכתית החדש הוקמה התא תרבות ההשעיה נגזר תה (Camellia Sinensis L.) עלים
Summary
עבודה זו מציגה פרוטוקול להקמת תרבות ההשעיה התא נגזר תה (Camellia סיננסיס L.) עלים כי ניתן להשתמש כדי ללמוד את חילוף החומרים של תרכובות חיצוניות, כי ניתן לקחת על ידי המפעל כולו, כגון הדברה.
Abstract
פלטפורמה לחקר חילוף החומרים קוטל חרקים באמצעות רקמות מבחנה של צמח תה פותחה. עלים של שתילי תה סטרילי המושרה כדי ליצור שיחה רופפת על מורראשיג ‘ ו Skoog (MS) בסיס מדיה עם הורמוני הצמח 2, 4-diלורוophenאוקסיאנפנול חומצה (2, 4-D, 1.0 mg L-1) ו kinetin (KT, 0.1 mg l-1). Callus נוצר לאחר 3 או 4 סיבובים של subculturing, כל אחד נמשך 28 ימים. יבלות משוחרר (כ 3 גרם) היה לאחר מכן מחוסן לתוך מדיה נוזלי B5 המכיל את אותו הורמוני צמח היה תרבותי באינקובטור רועד (120 rpm) בחושך ב 25 ± 1 ° c. לאחר 3 שלוש ארבע תרבויות, השעיית תא נגזר מעלה תה הוקמה ביחס תת-תרבות החל בין 1:1 ו 1:2 (אמא ההשעיה נוזל: בינוני טרי). באמצעות פלטפורמה זו, שישה קוטלי חרקים (5 μg mL-1 כל thiamethoxam, imidacloprid, מרחאמפריד, imidacloprid, מתודיטה, ו-omethoate) נוספו לתרבות ההשעיה של התה הנגזר של התא. מעקב אחר חילוף החומרים של הקוטלי חרקים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית וכרומטוגרפיה של גז. כדי לאמת את התועלת של תרבות תא תה ההשעיה, מטבוליטים של thiamethoxan ו diמתואט הקיימים בתרביות תאים מטופלים וצמחים שלמים הושוו באמצעות ספקטרומטר מסה. בתרבויות תה מטופלים, שבעה מטבוליטים של טימאמתוסן ושני מטבוליטים של דימיואט נמצאו, בעוד שבצמחים שלמים שטופלו, רק שני מטבוליטים של תיאמטוקסאם ואחד מדיותוטה נמצאו. השימוש בתא מושעה באופן מפושט את ניתוח חילוף החומרים לעומת שימוש בצמחי תה שלמים, במיוחד עבור מטריצה קשה כגון תה.
Introduction
תה הוא אחד המשקאות הלא אלכוהוליים הנפוצים ביותר בעולם1,2. תה מופק מן העלים וניצנים של Camellia סיננסיס וודי צמחי תה מגודלים במטעים עצומים ורגישים מזיקים חרקים רבים3,4. בדרך כלל משתמשים בחומרי הדברה זרחניים ובneonicotinoid, כמו קוטלי חרקים מערכתית5 כדי להגן על צמחי תה ממזיקים כגון ויטנפלאס, העלים, ומינים שחדוניים6,7. לאחר היישום, חומרי הדברה אלה נספגים או ממוקמים בתוך הצמח. בתוך הצמח, קוטלי חרקים מערכתית אלה עשויים להשתנות באמצעות הידרוליזה, חמצון או הפחתת תגובות על ידי אנזימים צמח. מוצרי טרנספורמציה אלה יכולים להיות יותר קוטביים ורעילים פחות מאשר תרכובות האב. עם זאת, עבור חלק מהזרחן, הביו-פעילות של מוצרים מסוימים גבוהה יותר. לדוגמה, acephate הוא מטבוליזם לתוך מתיאמאמאופטות2 הרעילים יותר8,9, ומתועד לתוך omethoate10,11. מחקרים מטבוליים צמחיים חשובים ולכן לקביעת גורלם של חומרי הדברה בתוך צמח12.
תרביות רקמות הצמח הוכחו להיות פלטפורמה שימושית לחקירת חילוף החומרים של חומרי הדברה, עם מטבוליטים מזוהה דומה לאלה שנמצאו צמחים שלמים13,14,15. השימוש בתרביות רקמות, בעיקר בתרבויות ההשעיה של התא, יש מספר יתרונות. ראשית, ניסויים יכולים להתבצע ללא מיקרואורגניזמים, ובכך הימנעות הפרעות של שינוי הדברה או השפלה על ידי חיידקים. שנית, תרבות הרקמה מספקת חומרים עקביים לשימוש בכל עת. שלישית, מטבוליטים קל יותר לחלץ מתרבויות רקמה מאשר צמחים שלמים, ותרבויות רקמה לעתים קרובות יש פחות תרכובות interring והמורכבות הנמוכה של תרכובות. לבסוף, תרבויות רקמה יכול לשמש יותר בקלות כדי להשוות סדרה של חומרי הדברה מטבוליזם בניסוי אחד16.
במחקר זה, השעיית תא נגזר העלים של שתילי תה סטרילי מבוגרים הוקמה בהצלחה. התרבות ההשעיה של תא התה הייתה משמשת להשוואת התנהגויות הפיזור של שישה קוטלי חרקים מערכתית.
פרוטוקול זה מפורט נועד לספק מספר הדרכה כך החוקרים יכולים להקים מפעל התרבות הצמח פלטפורמה שימושי לחקר גורלם של מטבולית של xenobiotics לתה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מציג את התהליך המפורט של הקמת מודל של חילוף חומרים של חומרי הדברה ברקמת צמח תה, כולל הבחירה של explants, קביעת הכדאיות של התא, והקמת תרבות תא תה ההשעיה עם מטבולית גבוהה פעילות. חלקים כלשהם של רקמת הצמח יכול לשמש כדי ליזום יבלות בסביבה מחוטאת25. עלי תה נבחרו עבור חניכה יבלות במ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית פיתוח מפתח & לאומי (2016YFD0200900) של סין, הקרן הלאומית המדעית הטבעית של סין (No. 31772076 ו-No. 31270728), סין פוסט דוקטורט הקרן (2018M630700), ואת הקרן הפתוחה של מפתח המעבדה לביולוגיה של צמח התה וניצול (SKLTOF20180111).
Materials
| Acetamiprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 46717 | CAS No: 135410-20-7 |
| Acetonitrile (CAN, 99.9%) | Tedia | AS1122-801 | CAS No: 75-05-8 |
| Agar | Solarbio Science & Technology | A8190 | CAS No: 9002-18-0 |
| Clothianidin (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 525 | CAS No: 210880-92-5 |
| Dimethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 109217 | CAS No: 60-51-5 |
| Imidacloprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 91029 | CAS No: 138261-41-3 |
| Imidaclothiz (99.5%) | Toronto Research Chemical | I275000 | CAS No: 105843-36-5 |
| Kinetin (KT, >98.0%) | Solarbio Science & Technology | K8010 | CAS No: 525-79-1 |
| Omethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 105491 | CAS No: 1113-02-6 |
| Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) | Solarbio Science & Technology | P8070 | CAS No: 25249-54-1 |
| Sucrose | Tocris Bioscience | 5511 | CAS No: 57-50-1 |
| Thiamethoxam (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 20625 | CAS No: 153719-23-4 |
| Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%) | Solarbio Science & Technology | T8170 | CAS No: 298-96-4 |
| 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%) | Guangzhou Saiguo Biotech | D8100 | CAS No: 94-75-7 |
| chiral column | Agilent CYCLOSIL-B | 112-6632 | Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) |
| Gas chromatography (GC) | Shimadu | 2010-Plus | Paired with Flame Photometric Detector (FPD) |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1260 | Paired with Ultraviolet detector (UV) |
| HSS T3 C18 column | Waters | 186003539 | Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Agilent | 1290-6545 | Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Thermo Scientific | Ultimate 3000-Q Exactive Focus | Connected to a Orbitrap mass spectrometer |
Referências
- Zhao, Y., et al. Tentative identification, quantitation, and principal component analysis of green pu-erh, green, and white teas using UPLC/DAD/MS. Food Chemistry. 126 (3), 1269-1277 (2011).
- Alcazar, A., et al. Differentiation of green, white, black, Oolong, and Pu-erh teas according to their free amino acids content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (15), 5960-5965 (2007).
- Kopjar, M., Tadic´, M., Pilizˇota, V. Phenol content and antioxidant activity of green, yellow and black tea leaves. Chemical and Biological Technologies in Agriculture. 2 (1), 1-6 (2015).
- Chen, H., Yin, P., Wang, Q., Jiang, Y., Liu, X. A modified QuEChERS sample preparation method for the analysis of 70 pesticide residues in tea using gas chromatography-tandem mass spectrometry. Food Analytical Methods. 7 (8), 1577-1587 (2014).
- Hou, R. Y., et al. Alteration of the Nonsystemic Behavior of the Pesticide Ferbam on Tea Leaves by Engineered Gold Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 50 (12), 6216-6223 (2016).
- Abdel-Gawad, H., Mahdy, F., Hashad, A., Elgemeie, G. H. Fate of C-14-Ethion insecticide in the presence of deltamethrin and dimilin pesticides in cotton seeds and oils, removal of ethion residues in oils, and bioavailability of its bound residues to experimental animals. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (51), 12287-12293 (2014).
- Fang, Q., et al. Degradation Dynamics and Dietary Risk Assessments of Two Neonicotinoid Insecticides during Lonicerajaponica Planting, Drying, and Tea Brewing Processes. Journal of Agricultural and Food. 65 (8), 1483-1488 (2017).
- Pan, R., et al. Dissipation pattern, processing factors, and safety evaluation for dimethoate and its metabolite (omethoate) in tea (Camellia sinensis). PloS One. 10 (9), e0138309 (2015).
- Pavlic, M., Haidekker, A., Grubwieser, P., Rabl, W. Fatal intoxication with omethoate. International Journal of Legal Medicine. 116 (4), 238-241 (2002).
- Mohapatra, S., Ahuja, A. K., Deepa, M., Sharma, D. Residues of acephate and its metabolite methamidophos in/on mango fruit (Mangifera indica L.). Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 86 (1), 101-104 (2011).
- Phugare, S. S., Gaikwad, Y. B., Jadhav, J. P. Biodegradation of acephate using a developed bacterial consortium and toxicological analysis using earthworms (Lumbricus terrestris) as a model animal. International Biodeterioration & Biodegradation. 69, 1-9 (2012).
- Ford, K. A., Casida, J. E. Comparative metabolism and pharmacokinetics of seven neonicotinoid insecticides in spinach. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10168-10175 (2008).
- Frear, D. S., Swanson, H. R. Metabolism of cisanilide (cis-2,5-Dimethyl-1-Pyrrolidinecarboxanilide) by Excised Leaves and Cell Suspension Cultures of Carrot and Cotton. Pesticide Biochemistry and Physiology. 5, 73-80 (1975).
- Sandermann, H., Scheel, D., Trenck, T. H. V. D. Use of plant cell cultures to study the metabolism of environmental chemicals. Ecotoxicology and Environmental Safety. 8 (2), 167-182 (1984).
- Karmakar, R., Bhattacharya, R., Kulshrestha, G. Comparative metabolite profiling of the insecticide thiamethoxam in plant and cell suspension culture of tomato. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (14), 6369-6374 (2009).
- Lichtner, F. Phloem mobility of crop protection products. Australian Journal of Plant Physiology. 27, 609-614 (2000).
- Sun, J., et al. Shoot basal ends as novel explants for in vitro plantlet regeneration in an elite clone of tea. Journal of Horticultural Science & Biotechnology. 87 (1), 71-76 (2012).
- Meng, M. T., et al. Uptake, Translocation, Metabolism, and Distribution of Glyphosate in Nontarget Tea Plant (Camellia sinensis L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. (65), 7638-7646 (2017).
- Hou, R. Y., et al. Effective Extraction Method for Determination of Neonicotinoid Residues in Tea. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 12565-12571 (2013).
- Karmakar, R., Kulshrestha, G. Persistence, metabolism and safety evaluation of thiamethoxam in tomato crop. Pest Management Science. 65 (8), 931-937 (2009).
- Dauterman, W. C., Viado, G. B., Casida, J. E., O’Brien, R. D. Persistence of Dimethoate and Metabolites Following Foliar Application to Plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 8 (2), 115-119 (1960).
- Lucier, G. W., Menzer, R. E. Nature of oxidative metabolites of dimethoate formed in rats, liver microsomes, and bean plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 18 (4), 698-704 (1970).
- Yang, G. W. . Construction of Camellia sinensis Cell Suspension Culture and Primary Study on Kineties. , (2004).
- Jiao, W., et al. Comparison of the Metabolic Behaviors of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (L.) Leaves. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66, 8593-8601 (2018).
- Mustafa, N. R., Winter, D. W., Iren, F. V., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nature Protocols. 6, 715-742 (2011).
- Zhong, J. J., Bai, Y., Wang, S. J. Effects of plant growth regulators on cell growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax quinquefolium. Journal of Biotechnology. 45, 227-234 (1996).
- Grover, A., et al. Production of monoterpenoids and aroma compounds from cell suspension cultures of Camellia sinensis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 108, 323-331 (2012).
- Lei, P. D., et al. Prevent Browning of Axillary Buds in vitro Culture of Camellia sinensis. Chinese Agricultural Science Bulletin. 28, 190-193 (2012).
- Hou, X., Guo, W. The effect of various nitrogen sources on the growth and nitrate assimilation indicator of suspension roselle cell. Guihaia. 18, 169-172 (1998).
- Shimabukuro, R. H., Walsh, W. C. Xenobiotic Metabolism in Plants: In vitro Tissue, Organ, and Isolated Cell Techniques. ACS Symposium Series. 97 (1), 3-34 (1979).
