Summary

Studera oxidativ Stress orsakad av den Mitis gruppen streptokocker i Caenorhabditis elegans

Published: March 23, 2019
doi:

Summary

Nematoden Caenorhabditis elegans är en utmärkt modell att dissekera värd-patogen interaktioner. Beskrivs här är ett protokoll att infektera masken med medlemmar av de mitis gruppen streptokocker och avgöra aktivering av oxidativ stress svar mot H2O2 produceras av denna grupp av organismer.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans), en frilevande nematoder, har vuxit fram som en attraktiv modell att studera värd-patogen interaktioner. Presenterade protokollet använder denna modell för att avgöra den patogenicitet som orsakas av de mitis gruppen streptokocker via produktionen av H2O2. De mitis gruppen streptokocker är en framväxande hot som orsakar många sjukdomar såsom bakteriemi, endokardit och orbital cellulit. Beskrivs här produceras ett protokoll att avgöra överlevnaden av dessa maskar som svar på H2O2 av denna grupp av patogener. Med hjälp av gen skn-1 kodning för en oxidativ stress svar transkriptionsfaktor, visas det att denna modell är viktigt för att identifiera värd gener som är viktiga mot streptokocker infektion. Dessutom är det visat att aktiveringen av oxidativ stress svar kan övervakas i närvaro av dessa patogener med hjälp av en transgen reporter mask stam, som smälts SKN-1 på grönt fluorescerande protein (GFP). Dessa testmetoder ge möjlighet att studera oxidativ stress svar H2O2 härrör från en biologisk källa i motsats till exogent ytterligare reaktivt syre arter (ROS) källor.

Introduction

Mitis gruppen streptokocker är mänskliga förknippas av orofaryngeal hålighet1. Dessa organismer kan dock fly denna nisch och orsaka en mängd invasiva sjukdomar2. Infektioner orsakade av dessa mikroorganismer inkluderar bakteriemi, endokardit och orbital cellulit2,3,4,5,6. Dessutom är de framväxande som smittämnen blodinfektioner i nedsatt immunförsvar, neutropen och cancerpatienter som genomgått kemoterapi5,7,8,9 .

Mekanismerna underliggande mitis gruppen patogenes är dunkel, eftersom några virulensfaktorer har identifierats. Mitis gruppen är kända för att producera H2O2, vilket har visat sig spela en viktig roll i muntliga mikrobiella samhällen10. Mer nyligen, flera studier har belyst en roll för H2O2 som ett cellgift som inducerar epitelial cell död11,12. S. lunginflammation, som tillhör denna grupp, har visat sig producera höga nivåer av H2O2 som inducerar DNA-skador och apoptos i alveolära celler13. Använder en akut lunginflammation djurmodell, visat samma forskare att produktionen av H2O2 av bakterier ger en virulens fördel. Studier på pneumokock meningit har också visat att patogenen-derived H2O2 verkar synergistiskt med pneumolysin att utlösa neuronala cell död14. Dessa observationer tydligt fastställa att H2O2 produceras av denna grupp av bakterier är viktigt för deras patogenicitet.

Intressant, har det också visat att medlemmar av mitis S. mitis och S. oralis orsaka döden av den nematoder C. elegans via produktionen av H2O215,16. Detta frilevande nematoder har använts som en enkel, genetiskt lätthanterlig modell för att studera många biologiska processer. Mer nyligen, masken har vuxit fram som en modell för att studera värd-patogen interaktioner17,18. Flera studier har dessutom betonat vikten av att studera oxidativ stress använder denna organism19,20,21. Dess korta livslängd, förmåga att knockdown gener av intresse av RNAi och användning av grönt fluorescerande protein (GFP)-smält reportrar att övervaka genuttryck är några av de attribut som gör det en attraktiv modellsystem. De vägar som reglerar oxidativ stress och medfödd immunitet i masken är viktigare, starkt konservativa med däggdjur20,22.

I detta protokoll, är det visat hur C. elegans att belysa den patogenicitet som orsakas av streptokocker-derived H2O2. En modifierad överlevnad analys visas, och medlemmar i gruppen mitis kunna döda maskar snabbt via produktionen av H2O2. Med hjälp av medlemmar i gruppen mitis, en ihållande biologisk källa av reaktiva syreradikaler föreskrivs (ROS), i motsats till kemiska källor att inducerar oxidativ stress i maskar. Bakterierna är dessutom kunna kolonisera maskar snabbt, vilket ger H2O2 riktas direkt till intestinala celler (jämfört med andra källor som måste korsa flera hinder). Analysen är validerad antingen 1) genom att fastställa överlevnad skn-1 mutant stam eller (2) genom att knacka ner skn-1 med hjälp av RNAi i maskar i förhållande till N2 vildtyp och vector kontroll behandlas maskar. SKN-1 är en viktig transkriptionsfaktor som styr den oxidativa stressreaktion i C. elegans23,24,25. Utöver överlevnad analyser används en mask stam uttrycker en SKN-1B/C::GFP transgena reporter att övervaka aktivering av den oxidativa stress svar via produktionen av H2O2 av gruppen mitis.

Protocol

1. beredning av THY (Todd-Hewitt jästextrakt) agarplattor För 1 L av media, tillsätt 30 g Todd-Hewitt pulver, 2 g jästextrakt och 20 g agar till en 2 L Erlenmeyer-kolv. Lägg till 970 mL avjoniserat vatten till innehållet i kolven och inkluderar en uppståndelse bar. Autoklav media vid en temperatur på 121 ° C och tryck på 15 lb/tum2 för 30 min. Därefter ställa in media på en uppståndelse tallrik och tillåta för kylning med skonsam omrörning. Häll media i lämplig storlek s…

Representative Results

Medlemmar av mitis grupp S. mitis, S. oralis, och S. gordonii snabbt dödade maskar, i motsats till S. mutans, S. salivarius, och icke-patogena E. coli OP50 (figur 3A). Medianöverlevnadstiden för S. mitis, S. oralis, och S. gordonii var 300 min, 300 min, 345 min, respektive. För att avgöra om dödandet var medieras av H2O2, kompletterade…

Discussion

Metoderna kan användas för andra patogena bakterier såsom Enterococcus faecium, som också tillverkar H2O2 odlats under anaeroba eller namnet villkor26. Typiskt, för mest sjukdomsframkallande organismer, det tar flera dagar till veckor att slutföra överlevnad analyserna. Dock på grund av den robusta produktionen av H2O2 av medlemmar i gruppen mitis, kunde dessa testmetoder slutföras inom 5-6 h enligt villkoren. Detta säkerställer förm…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar Dr. Bing-Yan Wang, Dr Gena Tribble (The University of Texas, skolan för odontologi), Dr Richard Lamont (University of Louisville, skolan för odontologi) och Dr. Samuel Shelburne (MD Anderson Cancer Center) för att tillhandahålla laboratorie- och kliniska stammar av mitis grupp streptokocker. Vi tackar också Dr Keith Blackwell (Institutionen för genetik, Harvard Medical School) i C. elegans -stammar. Slutligen, vi tackar Dr. Danielle Garsin och hennes lab (The University of Texas, McGovern Medical School) för att tillhandahålla reagens och mask stammar att genomföra studien. Vissa mask stammar tillhandahölls av CGC, som finansieras av NIH Office infrastruktur forskningsprogram (P40 OD010440).

Materials

Media and chemicals
Agarose  Sigma Aldrich A9539-50G
Bacto peptone  Fisher Scientific DF0118-17-0
BD Bacto Todd Hewitt Broth Fisher Scientific DF0492-17-6
BD BBL Sheep Blood, Defibrinated   Fisher Scientific B11947
BD Difco Agar  Fisher Scientific DF0145-17-0
BD Difco LB Broth Fisher Scientific DF0446-17-3
Blood agar (TSA with Sheep Blood) Fisher Scientific R01200
Calcium Chloride Fisher Scientific BP510-500
Carbenicillin Fisher Scientific BP26481
Catalase  Sigma Aldrich C1345-1G
Cholesterol Fisher Scientific ICN10138201
IPTG Fisher Scientific MP21021012
Magnesium sulfate Fisher Scientific BP213-1
Nystatin Acros organics AC455500050
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Scientific BP363-500
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific BP362-500
Sodium Azide Sigma Aldrich S2002-25G
Sodium chloride  Fisher Scientific BP358-1
Sodium Hydroxide Fisher Scientific SS266-1
8.25% Sodium Hypochlorite
Sodium Phosphate Dibasic  Fisher Scientific BP332-500
Streptomycin Sulfate  Fisher Scientific BP910-50
Tetracyclin Sigma Aldrich 87128-25G
(−)-Tetramisole hydrochloride Sigma Aldrich L9756
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-500 
Consumables 
15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes  Fisher Scientific 12-565-269
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL Fisher Scientific 07-200-574
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL Fisher Scientific 07-200-575
Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 x 10 mm) Fisher Scientific 08-757-100A
No. 1.5  18 mm X 18 mm Cover Slips Fisher Scientific 12-541A
Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) Fisher Scientific FB0875713A
Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) Fisher Scientific FB0875712
Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) Fisher Scientific 12-544-4
Software 
Prism Graphpad
Bacterial Strains
S. oralis ATCC 35037
S. mitis ATCC 49456
S. gordonii DL1 Challis  
E. coli OP50
E. coli HT115
Worm Strains
Strain Genotype Transgene Source
N2 C. elegans wild isolate CGC
EU1 skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) CGC
LD002 IdIs1 SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) Keith Blackwell

Referências

  1. Human Microbiome Project, C. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).
  2. Mitchell, J. Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis. Molecular Oral Microbiology. 26 (2), 89-98 (2011).
  3. Dyson, C., Barnes, R. A., Harrison, G. A. Infective endocarditis: an epidemiological review of 128 episodes. Journal of Infection. 38 (2), 87-93 (1999).
  4. Sahasrabhojane, P., et al. Species-level assessment of the molecular basis of fluoroquinolone resistance among viridans group streptococci causing bacteraemia in cancer patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 43 (6), 558-562 (2014).
  5. Shelburne, S. A., et al. Streptococcus mitis strains causing severe clinical disease in cancer patients. Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 762-771 (2014).
  6. van der Meer, J. T., et al. Distribution, antibiotic susceptibility and tolerance of bacterial isolates in culture-positive cases of endocarditis in The Netherlands. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (9), 728-734 (1991).
  7. Han, X. Y., Kamana, M., Rolston, K. V. Viridans streptococci isolated by culture from blood of cancer patients: clinical and microbiologic analysis of 50 cases. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 160-165 (2006).
  8. Hoshino, T., Fujiwara, T., Kilian, M. Use of phylogenetic and phenotypic analyses to identify nonhemolytic streptococci isolated from bacteremic patients. Journal of Clinical Microbiology. 43 (12), 6073-6085 (2005).
  9. Kohno, K., et al. Infectious complications in patients receiving autologous CD34-selected hematopoietic stem cell transplantation for severe autoimmune diseases. Transplant Infectious Disease. 11 (4), 318-323 (2009).
  10. Zhu, L., Kreth, J. The role of hydrogen peroxide in environmental adaptation of oral microbial communities. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 717843 (2012).
  11. Okahashi, N., et al. Hydrogen peroxide contributes to the epithelial cell death induced by the oral mitis group of streptococci. PLoS One. 9 (1), 88136 (2014).
  12. Stinson, M. W., Alder, S., Kumar, S. Invasion and killing of human endothelial cells by viridans group streptococci. Infection and Immunity. 71 (5), 2365-2372 (2003).
  13. Rai, P., et al. Streptococcus pneumoniae secretes hydrogen peroxide leading to DNA damage and apoptosis in lung cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (26), 3421-3430 (2015).
  14. Braun, J. S., et al. Pneumococcal pneumolysin and H(2)O(2) mediate brain cell apoptosis during meningitis. Journal of Clinical Investigation. 109 (2), 19-27 (2002).
  15. Naji, A., et al. The activation of the oxidative stress response transcription factor SKN-1 in Caenorhabditis elegans by mitis group streptococci. PLoS One. 13 (8), 0202233 (2018).
  16. Bolm, M., Jansen, W. T., Schnabel, R., Chhatwal, G. S. Hydrogen peroxide-mediated killing of Caenorhabditis elegans: a common feature of different streptococcal species. Infection and Immunity. 72 (2), 1192-1194 (2004).
  17. Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M. The worm has turned–microbial virulence modeled in Caenorhabditis elegans. Trends in Microbiology. 13 (3), 119-127 (2005).
  18. Irazoqui, J. E., Ausubel, F. M. 99th Dahlem conference on infection, inflammation and chronic inflammatory disorders: Caenorhabditis elegans as a model to study tissues involved in host immunity and microbial pathogenesis. Clinical & Experimental Immunology. 160 (1), 48-57 (2010).
  19. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship. Antioxidants & Redox Signaling. 13 (12), 1911-1953 (2010).
  20. Tissenbaum, H. A. Using C. elegans for aging research. Invertebrate Reproduction & Development. 59, 59-63 (2015).
  21. Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology & Medicine. 88, 290-301 (2015).
  22. Irazoqui, J. E., Urbach, J. M., Ausubel, F. M. Evolution of host innate defence: insights from Caenorhabditis elegans and primitive invertebrates. Nature Reviews Immunology. 10 (1), 47-58 (2010).
  23. Park, S. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8 (3), 258-269 (2009).
  24. An, J. H., et al. Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).
  25. An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes & Development. 17 (15), 1882-1893 (2003).
  26. Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium. Infection and Immunity. 72 (8), 4512-4520 (2004).
  27. Pincus, Z., Mazer, T. C., Slack, F. J. Autofluorescence as a measure of senescence in C. elegans: look to red, not blue or green. Aging (Albany NY). 8 (5), 889-898 (2016).
  28. Teuscher, A. C., Ewald, C. Y. Overcoming Autofluorescence to Assess GFP Expression During Normal Physiology and Aging in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8 (14), (2018).

Play Video

Citar este artigo
Naji, A., Al Hatem, A., van der Hoeven, R. Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (145), e59301, doi:10.3791/59301 (2019).

View Video