Очистка дендритной филоподии богатой фракцией
Summary
В этом протоколе мы внедряем метод очистки дендритной филоподии богатой фракцией от фагоцитарной структуры выступа на культивированных гиппокампальных нейронах, воспользовавшись специфической и сильной близостью между дендритным филоподиалом молекула адгезии, TLCN и внеклеточная матричная молекула, витронектин.
Abstract
Дендритная филоподия тонкие и длинные выступы на основе нити актина, и они расширяются и убираются, как будто ища целевой аксон. Когда дендритная филоподия устанавливает контакт с аксоном-мишенью, они начинают созревать в шипы, что приводит к образованию синапса. Теленцефин (ТЛКН) обильно локализован в дендритной филоподии и постепенно исключается из шипов. Переэкспрессия TLCN в культивированных гиппокампальных нейронов вызывает дендритное образование филоподии. Мы показали, что теленцефин сильно связывается с внеклеточной молекулой матрицы, витронэктином. Микрошарики с покрытием витронектина индуцированные фагоцитарные чаши на нейрональных дендритов. В фагоцитической чашке, TLCN, TLCN-связывающих белков, таких как фосфорилированный эзрин/ Радисин / Моезин (фосфо-ERM), и F-актин накапливаются, что свидетельствует о том, что компоненты фагоцитарной чашки похожи на дендритный филоподия. Таким образом, мы разработали метод очистки фагоцитарной чашки вместо дендритной филоподии. Магнитные бусы полистирола были покрыты витронектином, который обильно присутствует в культуре среды гиппокампа нейронов и который вызывает формирование фагоцитарной чашки на нейрональных дендритов. После 24 ч инкубации, фагоцитарные чашки были слегка растворимы с моющим средством и собраны с помощью магнитного сепаратора. После мытья бисера, связывающие белки были eluted и проанализированы серебра окрашивания и западного blotting. В связывающей фракции, TLCN и актин были обильно присутствуют. Кроме того, многие белки, идентифицированные из фракции, были локализованы в дендритную филоподию; Таким образом, мы назвали связывающую фракцию дендритной филоподией богатой фракцией. В этой статье описаны детали относительно метода очистки для дендритной фракции, богатой филоподией.
Introduction
Дендритная филоподия считается предшественниками шипов. Актиновые нити в дендритной филоподии регулируютих расширение и опрокиды 1,2,3. После контакта с аксоном, выбранный дендритный филоподия начинает свое созревание в шипы, и синапс образуется4,5. Компоненты шипов были определены на основе всестороннегоанализа постсинаптических фракций плотности 6,7,в то время как компоненты дендритной филоподии остаются в значительной степени неизвестными. Было показано, что теленцефин (TLCN), ERM, SynGAP, Рас, PI3 киназы, Akt, mTOR, поло-как киназа 2, CaMKII, синдекан-2, паралемин-1, ARF6, и ЭфБ регулировать дендритное образование филоподии5,8,9 ,10,11, в то время как метод не был разработан для всестороннего анализа молекул, присутствующих в дендритной филоподии.
TLCN (ICAM-5) специально выражается колючими нейронами в самом ростральном сегменте мозга, теленефалионе12. TLCN имеет 9 Ig-подобных доменов в внеклеточной области, трансмембранной области, и цитоплазмический хвост13. TLCN связывается с витронектином (VN) и lfA-1 в его внеклеточной области, пресенилином в трансмембранной области, а также с фосфо-ЭРМ и А-актинином в его цитоплазменской области5,8,14,15 ,16. TLCN связывается с актином цитоскелетом через фосфо-ЭРМ на кончиках дендритной филоподии и актинина в шипах и дендритных валах8,16.
Мы показали, что переэкспрессия TLCN расширенной дендритной филоподии формирования и индуцированных реверсии шипов к филоподии10. Консилитативная активная форма эзрина связана с цитоплазменным регионом TLCN и усиленным дендритным образованием филоподия8. Таким образом, TLCN регулирует образование дендритного филоподии с помощью актиносвязных белков. Esselens et al. продемонстрировали, что микробусы индуцированные накопления TLCN на культурных нейронах17. Мы показали, что фагоцитные структуры чашки были сформированы на нейрональных дендритов вокруг VN покрытием микробусы в TLCN-зависимым образом15. Компоненты дендритной филоподии аналогичны фагоцитарной чашке. Трудно собрать дендритную филоподию, но собрать фагоцитарную чашку с помощью магнитных микробусов относительно легче. Таким образом, мы разработали метод очистки фагоцитарной чашки вместо дендритной филоподии18. Здесь мы описываем метод очищения дендритной фракции, богатой филоподией.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы разработали метод очистки дендритной фракции, богатой филоподией, используя сродство между молекулой клеточной адгезии TLCN и внеклеточным матричным белками vitronectin. По сравнению с фракцией PSD, можно было бы определить синаптические белки, действующие на незрелый синапс из дендритной …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Сигэо Окабе и Хитоми Мацуно за культуру низкой плотности гиппокампа нейронов, Масаёси Мишина за несовершенных мышей TLCN, Сатико Мицуи и Момоко Сиодзаки за техническую помощь, а также членов лаборатории Yoshihara для полезных обсуждений . Эта работа была поддержана JSPS KAKENHI Грант Нос. JP20700307, JP22700354, а также JP24500392 и MEXT KAKENHI Грант Нос. JP23123525 до YF и JP20022046, JP18H04683 и JP18H05146 до YY.
Materials
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 1.7 ml Low Binding MCT | Sorenson BioScience | 39640T | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 2530149 | |
| 35-mm plastic cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| Anti-actin | Sigma-Aldrich | A-5060 | |
| Anti-alpha-Actinin | Sigma-Aldrich | A-5044 | |
| Anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T-9026 | |
| Anti-Ezrin | Sigma-Aldrich | clone3C12, SAB4200806 | |
| Anti-Galphaq | Santacruz | sc-393 | |
| Anti-MAP2 | Chemicon | clone AP20, MAB3418 | |
| Anti-Moesin | Sigma-Aldrich | clone 38/87, M7060 | |
| Anti-PLCbeta1 | Santacuz | sc-5291 | |
| Anti-PSD95 | MA2 | ABR | |
| Anti-Spectrin beta | Chemicon | MAB1622 | |
| B27 | Gibco | 0080085SA | |
| BCA protein assay kit | Thermo | 23227 | |
| Bromophenol blue | Merck | 1.08122.0005 | |
| calcium chrolide, hydrous | Wako | 038-19735 | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich | C7527 | |
| Complete EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C-6645 | |
| DNase-I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P5155 | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo | 12321D | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel | ATTO | E-T520L | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| i-Inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | |
| LAS-1000 mini | Fuji Film | LAS-1000 mini | For detection of luminescence from WB membrane |
| Magnetic polystyrene microbeads | Sperotech | PM-20-10 | |
| MEM amino acid solution | Gibco | 11130-051 | 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine |
| Mini-slab size electrophoresis system | ATTO | AE-6530 | |
| Niacinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Penicilin / Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 4906845001 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Nacali | 28360-14 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P6155 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R9504 | |
| Silver Stain 2 Kit wako | Wako | 291-5031 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T1270 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 1703940JA | |
| Ultra pure water | MilliQ | For production of ultra pure water |
Referências
- Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1. Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).
- Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia. Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).
- Ziv, N. E., Smith, S. J. Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation. Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).
- Lohmann, C., Bonhoeffer, T. A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia. Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).
- Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).
- Bayes, A., et al. Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins. PLoS One. 7 (10), e46683 (2012).
- Bayes, A., et al. Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density. Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).
- Furutani, Y., et al. Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).
- Mao, Y. T., et al. Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase. Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).
- Matsuno, H., et al. Telencephalin slows spine maturation. Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).
- Raemaekers, T., et al. ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation. The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).
- Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).
- Yoshihara, Y., Mori, K. Telencephalin: a neuronal area code molecule?. Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).
- Annaert, W. G., et al. Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins. Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).
- Furutani, Y., et al. Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin. Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).
- Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth. Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).
- Esselens, C., et al. Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway. Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).
- Furutani, Y., Yoshihara, Y. Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27 (2018).
- Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
- Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit. The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).
- Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture. European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).
