DNA 종이 접기 서식 파일을 사용 하 여 키 랄 Plasmonic Metamolecules로 금 Nanorods의 조립

1입니다. 디자인의 DNA 종이 접기 AuNRs의 원하는 상대 공간 배열 및 DNA 종이 접기 템플릿 (그림 1A)의 적당 한 모양을 식별 합니다. 종이 접기 템플릿과 AuNRs의 구조 매개 변수를 견적 한다. 추가 수정 (그림 1B)를 필요로 하는 먹을거리의 대략적인 위치를 찾습니다. 다운로드 및 설치 caDNAno18 DNA 종이 접기 템플릿 디자인. CaDNAno에서 서식 파일의 원하는 모양에 따라 비 계 및 스테이플 가닥 하 고 Seq 도구를 클릭 하 여 주식 가닥 시퀀스를 생성 합니다. 페인트 도구 를 클릭 하 고 수정 (그림 1C)를 추가 해야 하는 주식 가닥을 표시 합니다. DNA 주식 순서 (그림 1C).csv 파일로 내보내려면 내보내기 도구 를 클릭 합니다. 두 종이 접기 번들 사이 각 Θ 를 해결 하기 위해 더블-좌초 자물쇠 디자인. 두 개의 번들의 상대적 방향에 따라 종이 접기 구성 왼쪽-또는 오른 (LH/RH) 랄 공간 구성 (그림 1B)를 적응할 수 있습니다. 스프레드시트 응용 프로그램으로 스테이플.csv 파일을 가져옵니다. PolyA10 시퀀스 스테이플 AuNR 어셈블리 (핸들)에 대 한 사용의 끝에 추가 합니다. 잠금 시퀀스 설계 된 잠금 위치에 스테이플 가닥을 수정 합니다.참고: 대표 결과에 어셈블리 포함 36 주식 가닥의 3′ 끝에 튀어나온 손잡이, 동등 하 게 두 개의 배포 각 DNA 종이 접기 번들에 18 병렬 나선 모든 21 nt. 첫 번째 및 마지막 핸들 위치 사이의 거리는 168 nt, 약 57 nm (caDNAno 첨부 파일 참조). 2입니다. DNA 종이 접기 서식 파일 어셈블리 작업 재고 주식 가닥 (SM), 핸들 및 잠금, 물가 포함 하 여 동일한 양의 주식 oligonucleotides 농도 정규화 (예:, 100 µ M)를 혼합 하 여 준비 합니다.참고: 종이 접기 구조는 보통 주식 물가의 몇몇 수백을 포함합니다. 스테이플은 일반적으로 (예를 들어, 96-잘) multiwell DNA oligonucleotides의 화학 합성에서 전문 공급 업체에서 구입한 접시. 10 nM 종이 접기의 500 µ L, 트리 스-EDTA (테, 10 배), MgCl2 (100 mM) 100 µ L, NaCl (100 m m), H2O, 100 µ L의 SM의 175 µ L의 25 µ L의 50 µ L 섞는다 (0.5 µ M), 잠금 가닥 (5 µ M)의 5 µ L 그리고 50 µ L 비 계 (100 nM). 표 1에 설명 된 대로 20 ° C에 80 ° C에서 thermocycler에 혼합물을 anneal. 3. DNA 종이 접기 정화 참고:이 섹션에서는 agarose 젤 정화에 대 한 프로토콜을 설명합니다. DNA 종이 접기 템플릿은 대체 방법을38,39또한 정화 수 있습니다. 1% 젤, 분해 트리 스-borate-EDTA의 100 ml에서 agarose의 1 g (TBE, 0.5 x) 렌지에 혼합물을가 열 하 여. 10000 x DNA 얼룩 얼룩 사양에 따라 10 µ L를 추가 합니다. 추출 단계 (단계 3.6)에 자외선에 노출을 최소화 하기 위해 블루 여기에서 구상 될 수 있다 DNA 얼룩을 사용 합니다. 약 40 ° C에 대 한 해결책을 냉각 하 고 천천히 흔들어 동안 MgCl2 (1.3 M)의 1 mL을 추가. 젤을 캐스팅 하 고 실 온에서 30 분 동안 품 어. 전기 장치를 설정 하 고 부 어 감기 (4 ° C) 실행 버퍼 (0.5 11 m m MgCl2와 x TBE) 젤 상자에. 얼음 물 목욕에서 젤 상자를 놓습니다. (6 x 로딩 버퍼 포함 15% polysucrose 400 및 0.25 %bromophenol 물에 파란색) 종이 접기 샘플을 로딩 버퍼를 추가 합니다. 빗을 사용 (예:, 50 µ L 두께에서 1.5 m m의 8 잘 빗에 대 한)에 따라 적절 한 볼륨으로 우물에는 샘플을 로드 합니다. 80 V에 2 시간에 대 한 전기를 실행 합니다.참고: 종이 접기 특성화 고 열리고 닫힌 구조를 분리, 1 %2% 젤을 사용 하 고 4 h 실행 시간을 연장. 젤 젤 영상 (그림 2)와 함께 이미지. 블루 빛 transilluminator를 사용 하 여 시각화 하는 밴드, 종이 접기 밴드를 잘라, parafilm에 젤을 버리고 고 액체를 추출. 복구 비중은 약 40%입니다. 원심 필터 장치에 액체를 플라스틱 및 3000 x g 5 분에서 스핀 측정 260에서 종이 접기 솔루션의 흡수 UV 표시 (UV-VI) 분석기 nm. 종이 접기 108 M-1·cm-1x 1.3의 소멸 계수를 사용 하 여 농도 견적 한다.참고: 종이 접기 솔루션 agarose 젤 정화 후의 전형적인 농도 1-2 nM. 나중에 사용할 4 ° C에서 순화 된 종이 접기 서식 파일을 저장 합니다. 4입니다. 골드 nanorods의 합성 참고: AuNR 합성에 대 한 프로토콜은 사소한 수정 이전 문학40 에서 적응. 5 분을 위한 아쿠아 레 지아와 모든 유리 그릇을 씻어, 물으로 씻어, 초순, 함께 sonicate 그리고 사용 하기 전에 건조. 준비 0.2 M hexadecyltrimethylammonium 브 로마 이드 (CTAB), 1 mM HAuCl4, 4mm AgNO3, 64 m m L (+)-아 스 코르 빈 산과 6mm NaBH4. 냉 수 (4 ° C)를 사용 하 여 분해 NaBH4 4 ° c.에는 냉장고에 보관을 Ascorbic의 산 성 솔루션 갓 준비 했다.주의: CTAB (자극성) 피부 접촉, 눈 접촉 (자극), 섭취, 흡입 시 위험입니다. 적절 한 보호복을 착용 하십시오. 부족 한 환기의 경우 적당 한 호흡 장비를 착용 하십시오. NaBH4 가 (자극성) 피부 접촉, 눈 접촉 (자극), 섭취, 흡입 시 매우 위험 합니다. 스플래시 고글, 실험실 외 투, 장갑, 그리고 증기와 먼지 인공 호흡기를 착용 하십시오. 승인/인증 호흡기 또는 해당 사용 해야 합니다. Au 씨앗을 준비 합니다. 유리 제 작은 유리병에 CTAB (0.2 M), 250 µ L의 초순, 고 HAuCl4 (1mm)의 250 µ L의 500 µ L를 추가 합니다. 5 분 동안 실내 온도에 450 rpm에서 저 어. 교 반 속도 1200 rpm를 증가. 차가운 NaBH4 솔루션 (6 m m, 4 ° C)의 100 µ L를 추가 합니다. 2 분 후에 교 반 중지 하 고 사용 하기 전에 30 분 동안 30 ° C에서 물 욕조에 솔루션을 품 어. AuNRs을 준비 합니다. 둥근 바닥 플라스 크에 0.55 g CTAB에의 하 고 따뜻한 물 (60-65 ° C)의 15 ml 2, 6-dihydroxybenzoic 산의 0.037 g를 용 해. 30 ° C에 대 한 해결책을 식히십시오 AgNO3 (4mm)의 600 µ L을 추가 하 고 450 rpm 2 분 저 어. 그런 다음, 솔루션을 30 ° c.에서 15 분 동안 그대로 두고 솔루션, HAuCl4 (1mm)의 15 mL를 추가 하 고 15 분 추가 120 µ L L (+)의 대 한 450 rpm 볶음-아 스 코르 빈 산 (64 m m), 즉시, Au 씨앗의 30 s. 추가 12 µ L에 대 한 1200 rpm에서 저 어 그리고 30 1200 rpm에서 계속 저 어 s. 18 h 30 ° C에서 물 욕조에 솔루션을 품 어. 안 솔루션을 방해 하 고 모자를 사용 하 여 플라스 크를 닫습니다. 원심 분리기 튜브, 및 20 ° c.에 12 분 9500 x g 에서 원심 결과 솔루션을 전송 삭제는 상쾌한, 초순 물 20 mL에 펠 릿을 분산 고 원심 분리 단계를 수행 합니다. 마지막 펠 릿 3 mL의 증류수에 분산. 경도 플라스몬 공명에 대 한 소멸 계수를 사용 하 여 대 한 UV 흡수 측정에서 AuNRs의 농도 견적 한다. 소 광 계수 AuNR 모양 매개 변수41을 사용 하 여 예언 될 수 있다. 추가 사용에 대 한 4 ° C에서 AuNRs를 저장 합니다. 5. 단일 가닥 DNA와 금 nanorods의 기능화 참고:이 섹션에서는 이전 문학42에서 적응 하는 소위 낮은 pH 경로 따라 단일 가닥 dna (ssDNA) AuNR 기능화에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. DNA로 덮여 AuNRs 원심 분리;에 의해 순화 된다 또는, 정화 agarose 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 갓의 20 µ L로 thiol 기능성된 polyT DNA 가닥 (1mm)의 20 µ L를 품 어 tris(2-carboxyethyl) 이황화 결합을 줄이기 위해 1 h phosphine 염 (TCEP, 14 m m).참고: thiol 그룹 형태로 채권 AuNRs, 그리고 polyT 시퀀스에 종이 접기, 너무 많거나 너무 적은 기본적인 쌍 오작동 또는 불안정 한 어셈블리 이어질 수 polyA10 핸들 hybridizes.주의: TCEP는 심한 피부 화상과 눈 손상을 일으킬 수 있습니다. 보호 장갑/보호 의류/눈 보호/얼굴 보호를 착용 하십시오. AuNRs의 믹스 150 µ L (10 nM) 및 TCEP 취급 thiol-DNA (0.5 m m)의 40 µ L. 0.05%의 최종 SDS 농도 도달 AuNR 솔루션 1% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)를 추가 합니다. 2.5-3 (1m) HCl의 ~ 1 µ L로 pH를 조정 합니다. 2 h 70 rpm에서 떨고 있는 동안 품 어.참고: AuNR DNA 비율 1:5, 000-15, 000, 막대의 크기에 따라 순서 대로 해야 합니다. AuNRs에 대 한 (70 nm x 30 nm) 준비 다음 프로토콜 thiol DNA의 4, 13, 000 초과 섹션에 설명 된 것이 좋습니다. 0.5 M의 최종 NaCl concertation를 도달 하 고 실 온에서 4 h 70 rpm에서 떨고 있는 동안 품 어 NaCl을 추가 합니다.참고:이 단계에서 색상 변화는 실패 한 DNA 기능화를 나타낼 수 있습니다. TBE 버퍼 (10 배)와 ~8.5에 pH를 조정 하 고 밤새 품 어. DNA-AuNRs 4 워시 샘플 버퍼 세척의 1 mL와 혼합 하 여 x (0.5 0.1 %SDS x TBE), 그리고 원심 분리기 7000 x g 에서 30 분에는 상쾌한을 제거 하 고 남은 액체 (~ 40 µ L)에서 DNA AuNRs resuspend. 4.4.5 단계에 설명 된 대로 대 한 UV 흡수 측정에서 DNA AuNRs의 농도 견적 한다.참고: 솔루션 thiol DNA로는 AuNRs의 표면에서 CTAB 교체로 인해 5.3 5.4 단계에서 약간 ‘흐린’ 될 수도 있습니다. 솔루션 5 분 동안 최대 ~ 35 ° C 온난 화 시 분명 될 것입니다. 6. DNA 종이 접기 템플릿에 골드 nanorods의 조립 MgCl2 순화 된 DNA-AuNRs, 10 m m의 최종 농도를 솔루션에 추가 합니다. 순화 된 DNA AuNRs와 종이 접기를 10:1 비율로 섞는다.참고: 낮은 비율43의 제품 생산량 줄일 수 있습니다. 표 2의 절차에 따라 400 rpm에서 떨고 있는 동안 20 ° C에 40 ° C에서 온도 제어와 믹서에서 혼합 anneal.참고: CD 특성에 대 한 샘플 더 정화 없이이 단계 후에 측정할 수 있습니다. 0.7 %agarose 젤 전기 이동 법 (3.5 h 80 V)를 사용 하 여 최종 종이 접기-AuNR 구조를 정화. 흰 빛 transilluminator를 사용 하 여 이미지에 대 한. 제품 밴드 (종이 접기-AuNR 이합체)를 잘라 (그림 3), parafilm에 젤을 버리고, 액체를 추출. 피펫은 원심 필터 단위 및 5 분에 대 한 3000 x g 에서 스핀으로 액체 솔루션에서 종이 접기-AuNRs Resuspend. 젤에서 복구 수율은 약 50%입니다. 4.4.5 단계에 설명 된 대로 대 한 UV 흡수 측정에서 종이 접기-AuNR 구조체의 농도 견적 한다. 7. 전송 전자 현미경 이미징 참고:이 uranyl 편대 (UFo) 프로토콜을 얼룩이 지는 이전 문학44에서 적응입니다. 믹스 200 µ L의 UFo 솔루션 (0.75%) 그리고 1 µ L NaOH (5 M)와 2-3 분 위한 즉시 소용돌이의 원심 14000 x g에서 3-4 분 동안 얼룩 솔루션. (예를 들어, 알루미늄 호 일에 포장) 하 여 얼룩을 가벼운 노출에서 보호 합니다.주의: UFo 독성이 흡입 또는 삼 킨 경우 눈 자극을 일으킬 수 있다. 간단한 노출 또는 낮은 오염, 호흡기 필터 장치를 사용 합니다. 집중 또는 더 긴 노출의 경우 자가 호흡기 보호 장치를 사용 합니다. 장갑을 착용 한다. 장갑 재료는 불 침투성 및 UFo와의 솔루션에 저항력이 있다. 단단히 밀봉된 고글을 착용. 글로우 방전 6 편 격자 탄소/formvar 코팅 화란 증가 및 구조의 튀어나와 홍보를 사용 하기 전에 단지 s. 플라스틱 편 격자에 5 µ L 샘플 상품, 5-8 분 동안 품 어 고 필터 종이 격자의 가장자리를 부드럽게 만져 드롭을 제거 합니다. 하나는 parafilm에 얼룩이 솔루션의 드롭 큰 (~ 20 µ L) 및 1 개의 작은 (~ 10 µ L) 플라스틱. 작은 얼룩 솔루션 방울에 그리드를 넣고 그리드의 가장자리 필터 종이 만져 즉시 건조. 그런 다음, 30의 큰 얼룩 솔루션 방울에 넣어 s. 격자의 가장자리와 필터 종이 만져에 액체를 제거 합니다. 표에서 보유자에 그리드를 배치 합니다. 적어도 10 분 동안 건조 그리드를 기다립니다. 종이 접기 (그림 4), AuNRs (그림 5), 및 종이 접기-AuNRs (그림 6) 가장에 의해 샘플을 특징. 8. 원형이 색 성 측정 20 분에 대 한 N2 CD 분석기를 제거.참고: CD 분석기의 대부분 N2 램프 점화 하기 전에 정화 필요 합니다. CD 분 광 계 설명서를 확인 하십시오. 대역폭, 검색 범위, 및 수집 단계를 설정 합니다.참고: 검색 범위는 AuNRs의 크기에 따라 AuNRs의 광학 속성에 따라 달라 집니다. 버퍼와 측정 빈 Cd입니다. 종이 접기-AuNR 샘플 (그림 7)의 CD 스펙트럼을 측정 합니다.참고: CD 측정에 대 한 쿼트 또는 유리 큐 벳을 사용 합니다. 플라스틱 큐 벳 CD 분광학에 대 한 적합 하지 않습니다. 또한, 대부분 CD 분석기 흡수 및 CD 데이터의 동시 취득을 수 있습니다.