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Pesquisa do Câncer

Imagem latente longitudinal de intravital do comportamento da pilha do tumor cerebral em resposta a uma biópsia cirúrgica invasora

Published: May 03, 2019
doi:
10.3791/59278
,
1Cancer Genomics Netherlands,Prinses Máxima Center for Pediatric Oncology

Summary

Aqui nós descrevemos um método para a imagem latente high-resolution do multifotônica do tempo-lapso de pilhas do tumor cerebral antes e depois da intervenção cirúrgica invasora (por exemplo, biópsia) dentro do mesmo animal vivo. Este método permite estudar o impacto destes procedimentos cirúrgicos invasivos no comportamento migratório, invasivo e proliferativo das células tumorais em um único nível de células.

Abstract

As biópsias são padrão do cuidado para o tratamento do cancro e são clinicamente benéficas como permitem o diagnóstico contínuo do tumor, o prognóstico, e a determinação personalizada do tratamento. No entanto, a perturbação da arquitetura tumoral por biópsia e outros procedimentos invasivos tem sido associada a efeitos indesejados na progressão tumoral, que precisam ser estudadas em profundidade para melhorar ainda mais o benefício clínico desses procedimentos. As aproximações estáticas convencionais, que fornecem somente um instantâneo do tumor, são limitadas em sua habilidade de revelar o impacto da biópsia no comportamento da pilha do tumor tal como a migração, um processo estreitamente relacionado à malignidade do tumor. No detalhe, a migração da pilha do tumor é a chave em tumores cerebrais altamente agressivos, onde a disseminação local do tumor faz o resection total do tumor virtualmente impossível. O desenvolvimento da imagem latente do multifotônica e das janelas crônicas da imagem latente permite que os cientistas estudem este processo dinâmico em animais vivos sobre o tempo. Aqui, nós descrevemos um método para a imagem latente longitudinal de alta resolução de pilhas do tumor cerebral antes e depois de uma biópsia no mesmo animal vivo. Essa abordagem possibilita estudar o impacto desse procedimento no comportamento das células tumorais (migração, invasão e proliferação). Além disso, discutimos as vantagens e limitações desta técnica, bem como a capacidade desta metodologia para estudar mudanças no comportamento das células cancerosas para outras intervenções cirúrgicas, incluindo a ressecção tumoral ou a implantação de quimioterapia Wafers.

Introduction

O padrão do cuidado para a maioria de tumores contínuos inclui a biópsia do tecido para o diagnóstico, o prognóstico, e a determinação personalizada do tratamento1,2. Globalmente, esses procedimentos dão benefício clínico, mas evidências recentes indicam que a biópsia e outros procedimentos mais invasivos, como a ressecção tumoral, também podem influenciar negativamente a progressão tumoral3,4,5 , 6. embora esses procedimentos permaneçam indispensáveis no atendimento ao paciente e seus benefícios superem seus efeitos negativos, é necessário compreender plenamente os mecanismos por trás desses efeitos negativos, a fim de maximizar a segurança dos pacientes e a influências positivas desses procedimentos e torná-los ainda mais clinicamente benéficos.

Efeitos indesejáveis mediados pela biópsia na progressão tumoral são desencadeados por alterações sistêmicas e alterações no microambiente tumoral em resposta ao rompimento tecidual4,5. Assim, é necessário estudar esse processo em animais vivos. No entanto, as conseqüências sutis desses procedimentos minimamente invasivos podem muitas vezes ser disfarçadas por grandes variações entre os indivíduos. Os métodos convencionais baseados na análise da expressão immunohistochemistry ou do transcricional podem negligenciar estes efeitos ou exigir o grande número de animais para identificá-los. Além disso, essas abordagens estáticas não têm a capacidade de identificar alterações no comportamento das células tumorais, como migração e invasão, processos dinâmicos que se correlacionam com malignidade tumoral. Estas características da pilha do tumor são da importância particular para tumores cerebrais altamente agressivos, tais como o multiforme do glioblastoma (GBM), onde espalhar local de pilhas do tumor limita o resection cirúrgico e diminui a sobrevivência paciente7. Para compreender completamente como as biópsias afetam o comportamento de pilhas de GBM, uma aproximação longitudinal que permita o visualização destas pilhas no contexto fisiológico de organismos vivos é precisada.

O desenvolvimento recente da imagem latente intravital de alta resolução em combinação com o Windows crônico cirurgicamente implantado da imagem latente permite que os cientistas estudem o comportamento dinâmico de pilhas do tumor em ratos vivos sobre dias múltiplos8,9. Usando esta abordagem poderosa, podemos estudar como as células tumorais proliferativas, migratórias, e comportamento infiltrativo muda ao longo de vários dias em resposta a uma biópsia no mesmo rato. Comparado a outras técnicas que permitem a monitoração de múltiplos dias dos tumores em ratos vivos, tais como a imagem latente de ressonância magnética (MRI)10, o tomography de emissão de positrão/tomography computado (animal de estimação/CT)11, ou a imagem latente bioluminescente12, este a aproximação oferece excepcionalmente a possibilidade de estudar o comportamento da pilha do tumor a nível único da pilha e de desvendar mudanças sutis que ocorrem dentro do tumor.

Aqui, nós descrevemos um método detalhado para executar a biópsia-como o ferimento e a imagem latente intravital longitudinal do pre-e do postbiopsia no cérebro de ratos tumor-tendo. Este método pode potencialmente ser aplicado para estudar outras intervenções cirúrgicas, tais como o resection parcial do tumor ou a implantação de wafers da quimioterapia.

Protocol

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê de bem-estar dos animais da Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences, Holanda. Os protocolos experimentais utilizados neste manuscrito foram aprovados pelo Centrale Commissie Dierproeven (CCD) e pelo Instantie voor Dierenwelzijn (IvD). 1. implante de células tumorais e preparação de janela de imagem craniana Preparação cirúrgica Use camundongos adultos (> 6 semanas de idade) de qualquer estirpe ou sexo. Sedate um rato injetando (fluanisone [Neuroleptic] + fentanil [opioid]) (0,4 ml/kg) + sedativo do benzodiazepínicos (2 MGS/quilograma) em uma dose de 1:1:2 na água estéril. Avalie o estado de sedação do animal pela pinça do dedo.Nota: neste protocolo, ambos os camundongos feminino e masculino C57BL/6 foram utilizados devido ao mesmo contexto genético da linhagem celular tumoral utilizada nesses experimentos (GL261). O mouse vai ficar totalmente sedado por 1,5 h. Alternativamente, use anestesia inalatória, como isoflurano (1,5% – 2% de isoflurano/O2 mistura). Monte o mouse em um quadro estereotáxica e fixe a cabeça usando uma braçadeira de nariz e duas barras de orelha. Use uma lâmpada de aquecimento para preservar a temperatura do corpo. A lâmpada de aquecimento deve ser usada com cuidado, alternativamente as almofadas de aquecimento recirculando da água podem ser usadas. Aplique a pomada do olho para proteger as córneas do rato da secagem. Use tesouras afiadas para raspar a pele no crânio (área dorsal dos olhos do mouse para a base de seu crânio) e desinfectar a pele exposta com 70% de etanol. Corte a pele de forma circular com uma tesoura afiada e raspe o periósteo embaixo com um cotonete de algodão. Aplique uma gota de lidocaína 1% + epinefrina 1:100000 por 5 min, e retire o excesso com um cotonete. Cole as bordas da pele para o crânio com cola de cianoacrilato. Coloc o frame stereotactic um microscópio estereofónico da dissecção com ampliação 4x. Visualize o crânio através do microscópio de dissecção e perfure um sulco circular de 5 mm de diâmetro sobre o osso parietal direito. Realize este passo com cuidado e apenas superficialmente, evitando qualquer pressão sobre o crânio. Aplique uma gota de tampão de córtex (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM de glicose, 10 mM de tampão HEPES, 2 mM MgSO4e 2 mm CAcl2 [pH 7,4]) e levante a aba óssea usando fórceps fino. Para as seguintes etapas, mantenha a superfície do cérebro coberta com o amortecedor do córtice a menos que indicado de outra maneira. o microscópio da dissecção, visualize a superfície do cérebro e remova a dura-máter usando a pinça curvada, afilada, muito fina do ponto. Se o sangramento ocorre nesta fase, use uma esponja de gelatina absorvável para pará-lo. Injeção de células tumorais Ressuscitar a quantidade desejada de células tumorais fluorescentes em ~ 3 μL de PBS (por exemplo, para os experimentos mostrados neste protocolo, 1 x 105 GL261 células foram injetadas).Nota: enquanto qualquer marcador fluorescente pode ser usado, um marcador nuclear é fortemente aconselhado, para rastrear células tumorais individuais durante a análise. Adicionalmente, um marcador fluorescente histone-lig, tal como H2B, pode ser usado para visualizar a condensação do cromossoma e, assim, para monitorar a divisão da pilha. O uso de um marcador fotocomutável, como o Dendra2, permite a foto-marcação e rastreamento de células tumorais ao longo de vários dias4,13. Carregue as células tumorais numa seringa a gás de 10 μL com uma agulha de 2 pontos e fixe-a no braço manipulador estereotaxico. Retire o tampão do córtex. Coloque a ponta da seringa no meio da craniotomia e insira-a a uma profundidade de 0,5 mm a partir da superfície do crânio. Opcionalmente, criar um pequeno espaço no cérebro para acomodar a suspensão de células tumorais. Para isso, insira a seringa até uma profundidade de 1 mm e, em seguida, recupere-a até 0,5 mm antes da injeção. Aplique uma gota do amortecedor do córtice. Injete lentamente a suspensão da célula utilizando um injector de bomba de microseringa (250 – 400 nL/min). Retire a seringa e utilize uma esponja de gelatina absorvável para interromper qualquer hemorragia, se necessário. Preparação da janela da imagem latente craniana Remova o amortecedor do córtice e coloc uma gota do óleo de silicone no local da craniotomia para evitar bolhas de ar a janela. Sele o cérebro exposto com uma lamínula de 6 mm. Aplique cola de cianoacrilato entre a lamínula e o crânio. Pressione delicadamente o lamela de encontro ao crânio com a ajuda de pinças finos para assegurar a distância mínima entre o cérebro e o lamela. Aplique o cimento acrílico dental na superfície do crânio, cobrindo a borda da lamínula. Coloc um anel de aço inoxidável fino (1,5 milímetros no diâmetro exterior, 1 milímetro no diâmetro interno) em torno da craniotomia e permita que o cimento dental seque. Opcionalmente, adicione alguma colagem na borda para fixar o anel na parte superior da cabeça.Nota: este sistema de fixação da cabeça é ideal para a imagem latente em um microscópio invertido: os ímãs pequenos encaixados na caixa da imagem latente facilitam a fixação craniana da janela da imagem latente (CIW). Nos experimentos mostrados neste protocolo, utilizou-se um microscópio invertido. Para microscópios verticais, a fixação pode ser conseguida por meio de uma barra ou de um anel com os sulcos que podem ser Unidos ao microscópio com a ajuda dos parafusos ou de uma placa que caiba o anel. Para o manejo da dor, injete uma dose única de 100 μg/kg de buprenorfina por via subcutânea e permita que o animal se recupere em uma almofada de aquecimento. Coloc o rato em uma gaiola individual com papel desfiado para o enriquecimento. Monitore atentamente o mouse diariamente para os primeiros dias e 2x por semana, depois disso, para o comportamento normal, reatividade e aparência. 2. imagem latente intravital Nota: o intervalo de tempo entre a injeção da pilha do tumor e a primeira sessão intravital da imagem latente é dependente do tipo de linha de pilha do tumor usada. Para as experiências mostradas neste protocolo, 1x 105 GL261 Cells foram injetados e imaged 10 dias mais tarde. Preparação de imagens Sedate o rato usando a anestesia da inalação do isoflurano através de uma máscara protectora (1.5%-2% isoflurano/O2 mistura). Injete o rato subcutaneamente com 100 μL de tampão fisiológico para evitar a desidratação.Nota: para imagens a longo prazo, o rato pode ser hidratado através de uma bomba de perfusão subcutânea. Coloque o mouse virado para cima em uma caixa de imagem. Use uma placa de metal com um furo de 1 milímetro-diâmetro e os ímãs pequenos encaixados em torno da abertura para fornecer a fixação do CIW à caixa da imagem latente. Introduzir isoflurano através de um facemask e ventilar por uma tomada do outro lado da caixa (0.8% – 1.5% isoflurano/O2 mistura). Opcionalmente, use fita para corrigir o corpo do mouse.Nota: dextrano fluorescently rotulado para visualização de vasos sanguíneos ou outros corantes podem ser injetados por via intravenosa neste momento. Opcionalmente, use um oxímetro de pulso e uma sonda de aquecimento para monitorar os sinais vitais do mouse.Nota: neste experimento, não foi necessário utilizar um oxímetro de pulso e uma sonda de aquecimento, uma vez que o rato estava estável durante todo o período de tempo de imagem (2 – 3 h). No entanto, para tempos de imagem mais longos, pode ser necessária uma monitorização mais aprofundada. Defina o objetivo de água 25x (por exemplo, HCX IRAPO NA 0.95 WD 2,5 mm) para a posição zmais baixa e adicione uma grande gota de água.Nota: o uso de um micro dispensador de imersão de água é altamente aconselhado para experimentos de longo prazo, uma vez que permite que os cientistas adicionem água durante o experimento. Alternativamente, um objetivo seco pode ser usado. Transfira a caixa da imagem latente no microscópio equipado com uma câmara escura do clima mantida em 37 ° c. Traga o objetivo ao lamela de CIW até que a gota da água o toque. Usando o modo de epifluorescência, observar o tumor através da ocular e trazer as células em foco. Aquisição de imagens com lapso de tempo Selecione várias posições de interesse para a imagem e registre suas coordenadas no software. Assegure-se de que as posições selecionadas sejam posições representativas de locais diferentes do tumor (cada tumor pode ser diferente, mas para assegurar a consistência, selecione a mesma quantidade de posições que são centrais ao núcleo do tumor e às bordas através de todos os ratos).Nota: uma varredura da telha de uma parte do tumor ou do tumor visível inteiro pode ser executada; no entanto, se o tumor for grande, esse método aumentará o lapso de tempo entre as imagens. Além disso, se as células tumorais se movem rápido, pode ser desafiador para rastrear as mesmas células ao longo do tempo. Mude para o modo multifóton e sintonize o laser com o comprimento de onda correcto. Note que, para evitar fotodanos, comprimentos de onda mais elevados são desejados.Nota: para a imagem latente Dendra2, um comprimento de onda de 960 nanômetro foi usado. Com o objetivo usado nestas experiências, um zumbido de 1,3 era suficiente para começ uma boa definição dos núcleos do tumor e para escanear uma área representativa do tumor. Vá ao modo vivo e defina uma z-pilha para cada posição a fim adquirir o volume máximo de pilhas do tumor sem comprometer a definição da pilha do tumor. Defina o tamanho da etapa entre as imagens como 3 μm. Use o modo bidirecional para aumentar a velocidade de digitalização. A resolução da imagem deve ser pelo menos 512 x 512 pixels. Adquira imagens do volume do tumor em posições diferentes cada 20 minutos para 2 h. Adicione água ao objetivo antes de cada aquisição de imagem.Observação: as imagens de lapso de tempo podem ser adquiridas automaticamente definindo o lapso de tempo certo no software. No entanto, o mouse pode mover e a posição ou z-Stack pode deslocar ao longo do tempo, causando perda de dados. Portanto, é recomendável executar o lapso de tempo manualmente e verificar e ajustar para turnos XYZ entre aquisições. Nesta etapa, opcionalmente, Photo-switch o marcador fluorescente Dendra2.Nota: ao contrário da imagem latente do lapso de tempo (que permite estudar propriedades individuais das pilhas do tumor e como mudam sobre o tempo), esta permitirá estudar a área da infiltração da pilha do tumor no cérebro sobre diversos dias4. Uma explicação detalhada desta etapa é descrita por Gligorijevic et al.13. Após a última imagem é adquirida, retire o mouse do palco e permitir que ele se recupere em uma almofada de aquecimento. Para evitar a desidratação, 100 μL de soro fisiológico podem ser administrados por via subcutânea. Coloque o rato em sua gaiola até que a biópsia-como ferimento é executado. 3. biópsia-como ferimento e recolocação de CIW Crie um ferimento biópsia-como no local do tumor 1 dia após a primeira sessão da imagem latente.Nota: Alternativamente, um outro procedimento, como a remoção parcial do tumor, pode ser executado. Sedate o rato usando a anestesia da inalação do isoflurano como descrito previamente na etapa 2.1.1.Nota: enquanto a anestesia injetável pode ser utilizada, este procedimento é mais curto que o implante de CIW, e a anestesia por inalação possibilita o controle com precisão e a redução do tempo que o rato permanece sedado. Coloque o mouse sobre um quadro estereotódico e fixar a cabeça com duas barras de ouvido e uma braçadeira de nariz. Verifique a profundidade da anestesia pela falta de reflexos do pedal. Use uma máscara da anestesia para a cirurgia Stereotaxic para manter o rato sedado durante o procedimento. Mergulhe um cotonete de algodão na acetona e espalhe-o em torno da borda da lamínula para suavizar a cola que prende a lamínula contra o cérebro. Deslize o fórceps fino do ponto o lamela para levantá-lo. Se a lamínula quebrar neste ponto, use o fórceps para remover os pedaços de vidro. Aplique o amortecedor do córtice para manter o cérebro húmido. Mergulhe uma agulha de 25 G no tumor a uma profundidade de 1 mm. Retire a agulha e pare o sangramento, se necessário, aplicando uma esponja estéril de gelatina.Nota: esta etapa pode ser realizada um estereomicroscópio fluorescente para identificar com mais precisão a área do tumor (se o tumor é muito pequeno). Adicionalmente, pode-se injetar uma solução de 1 μL de grânulos de poliestireno fluorescente de 1 μm durante a punção para identificar a área biopsiada. Selar a superfície do cérebro com óleo de silicone e cola um 6 mm lamela na parte superior. 4. imagem latente repetida Um dia após ter causado a biópsia-como ferimento (e em dias consecutivos se necessário), repita a imagem latente intravital como descrita em etapa 2 acima para avaliar como o comportamento da pilha do tumor muda sobre o tempo. Selecione várias posições do tumor que seria representativo de toda a área do tumor.Nota: se os grânulos fluorescentes foram usados para identificar a área biópsia, localize-os ao comportamento da pilha do tumor da imagem nas regiões biópsia comparadas às regiões não-biópsia. 5. análise de imagem Se as imagens de lapso de tempo foram adquiridas manualmente, combine-as em uma pasta. Abra o arquivo LIF de lapso de tempo no software comercial associado ao microscópio (por exemplo, LasX ou LAS AF). Selecione o processo de tabulação > ferramentas de processo > mesclar. Selecione a primeira imagem da sequência de tempo e clique em primeiro. Selecione a segunda imagem da sequência de tempo e clique em segundo. Em mesclar dimensões, selecione t para o tempo. Clique em aplicar. Um novo arquivo com dois temporais será gerado. Repita esse processo para todos os timepoints, usando o arquivo recém-gerado como a primeira imagem da seqüência. Corrija as pilhas zadquiridas para qualquer turno XYZ .Observação: para os experimentos descritos neste protocolo, um programa de software personalizado do Visual Basic foi usado para correção. Alternativamente, outros softwares disponíveis podem ser usados, como o ImageJ ou o Imaris. Exporte os arquivos TIFF do software clicando com o botão direito do mouse no arquivo de lapso temporal mesclado. Selecione salvar dados brutos. Os arquivos exportados serão exportados para uma pasta denominada de acordo com o canal, a hora e a posição z. Abra os arquivos TIFF no programa de software personalizado do Visual Basic. Defina o número de timepoints, z-Stacks e Channels. Atribua uma cor a cada canal pela ordem de aparência. No painel Mostrar formulário , para cada ponto de tempo, corrija a mudança no z clicando nos botões para cima (U) ou para baixo (D). No painel de construção de imagens intravital , selecione o canal a ser usado para corrigir o deslocamento XY . Selecione o canal verde para corrigir, com base no sinal das células tumorais. Clique em automático para correção XY . Exporte as imagens corrigidas como uma projeção máxima de três pilhas zconsecutivas. Na seleçãodo painel, introduza os números do primeiro (begin) e o último (final) z-Slices a serem exportados. Selecione máx. Selecione pastas separadas para Z. Clique em fazer. Para cada um deles, três pilhas z, imagens de lapso de tempo serão exportadas para uma pasta separada. Opcionalmente, correto para a deformação elástica do tecido.Nota: para experimentos de deformação elástica tecidual, um programa de software de compensação de movimento de fósforo foi usado para corrigir a deformação rígida e elástica do tecido14. Rastreie células individuais na pilha zcompleta no filme de lapso de tempo.Nota: as células tumorais podem ser rastreadas manualmente usando, por exemplo, um plugin ImageJ (MTrackJ). Embora seja preciso, isso é limitado ao plano XY e consome muito tempo. Alternativamente, as células tumorais podem ser rastreadas automaticamente ao longo do volume zcompleto, usando a segmentação por células tumorais (por exemplo, software Imaris). No entanto, em tumores altamente densos, o rastreamento automatizado é menos preciso e pode dar origem a mais erros de rastreamento. Abra e acompanhe cada série de lapso de tempo (para três pilhas zconsecutivas) separadamente. Arraste a pasta que contém as imagens de lapso de tempo para ImageJ. Selecione a guia Plugins > Tracking > mtrackj. Acompanhe cada célula individual selecionando Adicionar e clicando em cada célula em cada ponto temporal. Extraia a medida das faixas clicando em medir e salvando o arquivo.

Representative Results

Para avaliar o impacto da biópsia no comportamento das células tumorais cerebrais, realizamos o procedimento descrito neste protocolo. Glioma — células GL261 — expressando uma proteína fluorescente nuclear (H2B-Dendra2) foram injetadas no cérebro de camundongos C57BL/6, e um CIW crônico foi implantado. A imagem latente intravital do tempo-lapso foi executada no mesmo animal pre-e borne-biópsia-como ferimento ao tumor (Figura 1a, B). A migração das células tumorais individuais foi determinada pelo rastreamento do trajeto migratório ao longo do tempo em diferentes planos XY da z-Stack (Figura 1C) e plotado como percentual de células migratórias pré e pós-biópsia (Figura 1F). A taxa de proliferação de células tumorais foi quantificada com base na condensação H2B-Tagged Dendra2 sobre a mitose (Figura 1D) e plotada como percentual de células divisórias pré e pós-biópsia (Figura 1e). Comparou-se a distribuição da velocidade de migração antes e após a biópsia no mesmo tumor e constatou-se que o número de células migratórias (velocidade > 4 μm/h) aumentou após a intervenção, com uma diminuição associada no número de células lentas/não migratórias ( velocidade < 4 μm/h) (Figura 2a). Em média por tumor, observou-se um aumento de 1,75 (DP = 0,16) vezes no percentual de células migratórias quando uma lesão semelhante à biópsia foi realizada, em comparação aos camundongos controle que não foram biopsiados (Figura 2b). Monitoramos o comportamento das células tumorais por mais uma semana e descobrimos que, embora o percentual de células tumorais migratórias eventualmente diminuísse tanto no controle quanto nos camundongos biopsiados, os camundongos biopsiados ainda apresentavam maior capacidade migratória do que os camundongos controle ( Figura 2C). A análise do comportamento proliferativo de células tumorais ao longo do tempo mostrou um aumento de 1,52 (DP = 0,26) no número de eventos mitóticos após biópsia, em relação aos camundongos controle não biopsiados (Figura 2D). Para testar se os efeitos observados da biópsia no comportamento proliferativo e migratório da pilha do tumor eram um artefato devido à cirurgia da recolocação de CIW (exigido para executar uma biópsia-como ferimento), nós monitoramos o comportamento da pilha do tumor em um grupo de ratos que se submeteram a CIW substituição sem biópsia. Neste grupo, não observamos nenhuma indução de migração ou proliferação de células tumorais, indicando que o impulso na proliferação de células tumorais e as taxas de migração foram desencadeados especificamente por lesão semelhante à biópsia (Figura 3a, B). A foto-convertibilidade estável da proteína fluorescente Dendra2 permite estudar a infiltração da pilha do tumor sobre diversos dias. Após a exposição à luz ultravioleta/azul, o Dendra2 é comutado irreversivelmente de verde para vermelho. Usando esta propriedade, uma região quadrada do tumor foi iluminada e as pilhas do tumor de ~ 200 Dendra2-expressando foram foto-marcadas antes da biópsia (Figura 4). Um dia após a biópsia, nós relocalizamos a região foto-comutada e medimos o volume de pilhas do tumor que se infiltrado no tecido circunvizinho do tumor. Verificou-se que a área de infiltração foi de 1,72 (DP = 0,41) vezes maior nos tumores após uma lesão semelhante à biópsia em comparação aos tumores de controle não biopsiados (Figura 4). Embora esta aproximação forneça somente a informação no comportamento infiltrante do volume da pilha do tumor e não em um único nível da pilha, é menos demorado do que a aproximação da imagem latente do tempo-lapso e pode ser o método da escolha para perguntas da pesquisa focalizadas exclusivamente em estudando o comportamento infiltrativo. Figura 1: configuração experimental para imagem intravital longitudinal do efeito da biópsia no comportamento da célula tumoral. (A) diagrama que mostra o desenho do anel e do suporte magnético. (B) representação esquemática do fluxo de trabalho experimental. As células tumorais são injetadas nos cérebros dos camundongos e um CIW é estabelecido. Em cima do desenvolvimento do tumor, uma primeira sessão da imagem latente do tempo-lapso (pré-biópsia) é executada. No dia seguinte, a biópsia e a substituição de CIW são implementadas. O dia após a imagem latente (postbiopsia), uma segunda sessão da imagem latente do tempo-lapso é executada. Para efeitos a longo prazo, as sessões subseqüentes da imagem latente podem ser feitas. (C) imagens mostram instantâneos representativos de um filme de lapso de tempo onde as células tumorais GL261 H2B-Dendra2 foram rastreadas. As linhas vermelhas retratam trilhas individuais da pilha do tumor. A barra de escala = 50 μm. (D) imagens de lapso de tempo representativas in vivo exibindo células divisórias em tumores GL261 H2B-Dendra2. Diferentes estágios de mitose são indicados: prófase (P), prometafase (PM), metafase (M), anaphase (A) e telófase (T). A barra de escala = 50 μm. os gráficos indicam a percentagem de (e) migratórias e (F) células divisórias pré e pós-biópsia. Cada ponto indica o percentual de células migratórias em todas as posições medidas em um animal individual. Os dados são mostrados como média ± M.E.V. de seis camundongos (* *P < 0, 1, teste tpareado). Este valor foi modificado a partir de Alieva et al.4. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: resultados representativos mostrando o impacto da biópsia nas taxas de migração e proliferação de células tumorais. (A) parcelas da cachoeira que mostram a mudança na distribuição da velocidade da pilha relativo à migração básica em ratos individuais. Os dados são mostrados como média ± M.E.V. de cinco camundongos. (B) o número de células migratórias em animais de controle (azul) e biopsiados (vermelhos) normalizados para o número de pré-intervenção das células migratórias (n = 6 camundongos, * * *P &Lt; 0, 1, teste tde Student). (C) o comportamento da célula tumoral foi rastreado por vários dias. São mostrados o número normalizado (relativo à pré-intervenção) das células migratórias em camundongos individuais ao longo do tempo (n > 4 camundongos por condição, * * *P < 0, 1, ANOVA bidirecional). (D) o número normalizado de células divisórias em animais de controle (azul) e biopsiados (vermelho). Por animal individual, os valores pós-intervenção foram normalizados para os valores pré-intervenção (n = 5 camundongos, * *P < 0, 1, teste tde Student). Este valor foi modificado a partir de Alieva et al.4. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: a reposição de CIW não tem efeito no comportamento das células tumorais. A imagem latente intravital longitudinal mostra que a recolocação do CIW sem biópsia não tem nenhum efeito em taxas da migração e da proliferação. A) o aumento do número de células migratórias para as condições indicadas. Cada símbolo representa a média de um rato individual e n≥ 4 ratos. (B) o aumento do número de células proliferantes para as condições indicadas. Cada símbolo representa a média de um mouse individual (n≥ 4 camundongos, * *p < 0, 1, * * *p < 0, 1, NS = não significante, ANOVA One-Way com teste post hoc Newman-Keuls). Este valor foi modificado a partir de Alieva et al.4. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: diagrama mostrando a configuração experimental e os resultados representativos obtidos com Dendra2 foto-switching. Para monitorar a infiltração da pilha do tumor em cima da biópsia, as pilhas Dendra2-expressando do tumor são foto-comutadas em uma região quadrada pela iluminação clara UV/azul e imaged, 1 dia antes da biópsia. Um dia após a biópsia, a região comutada por foto é relocalizada e reimaged. São mostradas imagens representativas de Dendra2 de infiltração de células tumorais, corrigidas usando subtração de canais. A linha pontilhada branca representa a área de infiltração. A barra de escala = 50 μm. O gráfico mostra a área de foto-comutada aumentada plotada para ratos biópsia (vermelhos) e do controle (azul). Cada ponto representa o valor médio de um mouse individual (n≥ 5 camundongos, *P < 0, 5, teste tde Student). Este valor foi modificado a partir de Alieva et al.4. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Aqui nós descrevemos um método para estudar mudanças no comportamento da pilha do tumor no único nível da pilha em resposta aos procedimentos cirúrgicos invasivos, tais como uma biópsia, no cérebro de um animal vivo. A combinação da imagem latente longitudinal do multifotônica com a implantação cirúrgica de um CIW crônico permite a quantificação da migração, da invasão, e da proliferação da pilha do tumor antes e depois da biópsia no mesmo animal4. Comparado a outras aproximações usadas para a monitoração multiday do tumor, tal como a imagem latente bioluminescente12, MRI10, ou animal de estimação/CT11, este método visualiza excepcionalmente tumores em um único nível da pilha e, assim, fornece a introspecção no comportamento celular progressão subjacente do tumor.

Para executar esse método com êxito, vários procedimentos devem ser masterizados. As etapas mais críticas deste protocolo são a implantação e a substituição do CIW. A complexidade técnica destas etapas exige a precisão e as habilidades cirúrgicas que podem ser adquiridas com treinamento constante. As complicações durante a cirurgia de CIW, tais como o sangramento que pode cobrir a superfície do cérebro, podem provar desafiar para a imagem latente subseqüente. A falta de ferramentas estéreis ou o ambiente, assim como a falha selar completamente a superfície do cérebro, podem causar uma infecção na superfície do cérebro (líquido branco o COVERSLIP), que fará a imagem latente problemática e compromete fortemente o resultado Interpretação. Uma outra edição comum deste protocolo é movimento animal durante a imagem latente do tempo-lapso. Embora qualquer turno XYZ possa ser corrigido após o experimento, é recomendável corrigir a coordenada de cada posição antes de cada ponto de tempo para evitar qualquer perda de informações. A deformação do tecido é um problema adicional encontrado quando a imagem latente em um microscópio invertido. O tecido cerebral sofre de compressão quando o mouse é colocado em posição supina. Dependendo do grau de deformação tecidual, o rastreamento de células tumorais pode levar a uma quantificação errônea do deslocamento celular. Para evitar isso, um software para deformação rígida e elástica pode ser usado14.

Embora este procedimento ofereça uma ampla aplicação para estudar alterações no comportamento tumoral, certas limitações devem ser consideradas. Este método permite que os cientistas a imagem até uma profundidade de 1,6 mm (com o uso de um oscilador óptico paramétrico); Entretanto, isto significa que a imagem latente é restrita às áreas superficiais do córtice de cérebro15. Assim, alguns tumores cerebrais localizados em estruturas cerebrais profundas, incluindo gliomas de Pontine intrínsecos difusos localizados na região do tronco encefálico, não podem ser estudados em seu ambiente cerebral original com este protocolo. Outra limitação deste protocolo é o volume do tumor que pode ser imaged. Embora a exploração total do volume do tumor seja desejada obter a informação máxima, frequentemente, o tamanho do tumor e a velocidade de pilhas migratórias podem ser fatores de limitação. Para cada tipo de tumor, um lapso de tempo ideal para a imagem latente tem que ser considerado. Se o período de tempo entre as imagens é muito longo, pode ser difícil rastrear as células tumorais. O uso de um varredor ressonante pode altamente diminuir o tempo da exploração, permitindo a imagem latente de um tumor mais grande16. Finalmente, a análise de imagem manual deste protocolo pode ser muito demorado, então, em vez disso, programas para rastreamento automatizado 3D podem ser usados. No entanto, o resultado do rastreamento deve ser sempre supervisionado visualmente, uma vez que os algoritmos para rastreamento automatizado de células raramente são projetados para recapitular exatamente a migração das células de interesse.

Ligeiras adaptações do protocolo aqui descritos podem permitir uma gama ainda maior de aplicações. Em vez de realizar biópsias, outras intervenções (cirúrgicas) podem ser implementadas, tais como ressecção parcial do tumor ou a entrega de bolachas quimioterápicas. A adição de compostos através de um microtubo cirurgicamente implantado pode ser combinada com este protocolo a moléculas específicas de interesse farmacologicamente alvo. Espera-se que esse modelo seja útil em estudos com o objetivo de analisar o impacto de uma determinada intervenção no comportamento das células tumorais. A possibilidade de executar medidas repetidas no mesmo animal fornece não somente dados mais exatos em mudanças que ocorrem no tumor mas igualmente reduz extremamente o número de animais experimentais necessários por o estudo.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem a ANKO de Graaff e o Hubrecht Imaging Center por seu suporte de imagem e Ellen Wehrens e Hannah Johnson para revisar e editar o manuscrito.

Materials

25g x 16 mm hypodermic needles BD Microlance 300600
701 RN 10uL SYR W/O NEEDLE Hamilton 7635-01
Absorbable gelatin sponge Pfizer Gelfoam
Coverslips round 6 mm VWR international 631-0168
Cyanoacrylate glue Pattex Pattex Ultra gel
Dental cement Vertex Dental Vertex Self-Curing
Drill Dremel Dremel 3000 (dental drill may be more convenient) + 105 Engraving Cutter
Fine curved Tweezers Dumont AGT508
Hypnorm VetaPharma Ltd Hypnorm (Fentanyl citrate 0,315 mg/ml+ Fluanison 10 mg/ml)
Midazolam Actavis Midazolam Actavis 5mg/ml
Opthalmic ointment Kela Veterinaria Duodrops veter kela 10 m
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) Stoelting 53311
Silicone Oil Sigma Aldrich 181838
Stereotaxic frame Stoelting Lab standard stereotaxic, rat and mouse
Surgical stereo microscope Olympus
Temgesic (0.3 mg/ml) BD Pharmaceuticals 283732
Vannas Tübingen Spring Scissors Harvard Apparatus 72-8508
Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) Local anesthetic Astrazeneca Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000)
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Referências

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Intravital ImagingBrain TumorSurgical BiopsyMouseStereotactic FrameCraniotomyTumor Cell InjectionCranial Imaging Window

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Alieva, M., Rios, A. C. Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy. J. Vis. Exp. (147), e59278, doi:10.3791/59278 (2019).
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