Imagerie longitudinale intravitale du comportement cellulaire de tumeur cérébrale en réponse à une biopsie chirurgicale invasive

Toutes les expériences ont été menées conformément aux directives du Comité du bien-être animal de l’Académie royale des arts et des sciences des Pays-Bas, aux Pays-Bas. Les protocoles expérimentaux utilisés dans ce manuscrit ont été approuvés par la Commissaire centrale Dierproeven (CCD) et l’Instantie voor Dierenwelzijn (IvD). 1. Implantation de cellules tumorales et préparation de fenêtre d’imagerie crânienne Préparation chirurgicale Utilisez des souris adultes (à l’âge de 6 semaines) de n’importe quelle souche ou sexe. Sédatif d’une souris en injectant (fluanisone [neuroleptique] – fentanyl [opioïde]) (0,4 mL/kg) – sédatif benzodiazépine (2 mg/kg) à une dose de 1:1:2 dans l’eau stérile. Évaluer l’état de sédation de l’animal par pincement d’orteil.REMARQUE : Dans ce protocole, les souris femelles et mâles de C57BL/6 ont été employées dues au même fond génétique de la ligne de cellules de tumeur employées dans ces expériences (GL261). La souris restera entièrement sous sédatif pendant 1,5 h. Alternativement, utiliser l’anesthésie par inhalation comme l’isoflurane (1,5% à 2% isoflurane/O2 mélange). Montez la souris sur un cadre stéréotaxique et fixez la tête à l’aide d’une pince nasale et de deux barres d’oreilles. Utilisez une lampe chauffante pour préserver la température corporelle. La lampe de chauffage doit être employée avec prudence, alternativement des coussins de chauffage de recirculation d’eau peuvent être employés. Appliquer de la pommade pour les yeux pour protéger les cornées de la souris contre le séchage. Utilisez des ciseaux pointus pour raser la fourrure sur le crâne (zone dorsale des yeux de la souris à la base de son crâne) et désinfecter la peau exposée avec 70% d’éthanol. Couper la peau d’une manière circulaire avec des ciseaux pointus et gratter le périoste en dessous avec un coton-tige. Appliquer une goutte de lidocaïne 1% et de l’épinéphrine 1:100.000 pendant 5 min, et retirer l’excédent avec un coton-tige. Coller les bords de la peau au crâne avec de la colle cyanoacrylate. Placez le cadre stéréotaxique sous un microscope stéréo dissection avec grossissement 4x. Visualisez le crâne à travers le microscope de dissection et percez une rainure circulaire de 5 mm de diamètre au-dessus de l’os pariétal droit. Effectuez cette étape avec soin et seulement superficiellement, en évitant toute pression sur le crâne. Appliquer une goutte de cortex tampon (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM de glucose, 10 mM de tampon HEPES, 2 mM MgSO4et 2 mM CaCl2 [pH 7,4]) et soulever le rabat osseux à l’aide de fines forceps. Pour les étapes suivantes, gardez la surface du cerveau recouverte d’un tampon de cortex, sauf indication contraire. Sous le microscope de dissection, visualisez la surface du cerveau et retirez le dura mater à l’aide de pinces à épiler à pointe sinbé, effilée et très fine. Si le saignement se produit à ce stade, utilisez une éponge de gélatine absorbable pour l’arrêter. Injection de cellules tumorales Resuspendre la quantité désirée de cellules tumorales fluorescentes dans 3 l l de PBS (par exemple, pour les expériences montrées dans ce protocole, 1 x 105 cellules GL261 ont été injectées).REMARQUE: Bien que n’importe quel marqueur fluorescent peut être utilisé, un marqueur nucléaire est fortement conseillé, pour suivre les cellules tumorales individuelles au cours de l’analyse. En outre, un marqueur fluorescent lié à l’histone, comme h2B, peut être utilisé pour visualiser la condensation chromosomique et, par conséquent, pour surveiller la division cellulaire. L’utilisation d’un marqueur photo-switchable, tel que Dendra2, permet le marquage photo et le suivi des cellules tumorales sur plusieurs jours4,13. Chargez les cellules tumorales dans une seringue étanche au gaz de 10 l avec une aiguille de style point 2 et fixez-la sur le bras de manipulateur stéréotaxique. Retirez le tampon du cortex. Placez la pointe de la seringue au milieu de la craniotomie et insérez-la à une profondeur de 0,5 mm de la surface du crâne. Optionnellement, créer un petit espace dans le cerveau pour accueillir la suspension des cellules tumorales. Pour cela, insérez la seringue jusqu’à une profondeur de 1 mm, puis récupérez-la jusqu’à 0,5 mm avant l’injection. Appliquer une goutte de tampon cortex. Injectez lentement la suspension cellulaire à l’aide d’un injecteur de microseringue (250 à 400 nL/min). Retirez la seringue et utilisez une éponge à gélatine absorbable pour arrêter tout saignement, si nécessaire. Préparation de fenêtre d’imagerie crânienne Retirez le tampon du cortex et placez une goutte d’huile de silicone sur le site de la craniotomie pour éviter les bulles d’air sous la fenêtre. Scellez le cerveau exposé avec un bordereau de 6 mm. Appliquer de la colle cyanoacrylate entre la couverture et le crâne. Appuyez doucement sur la feuille de couverture contre le crâne à l’aide de fines pinces à épiler pour assurer une distance minimale entre le cerveau et la couverture. Appliquer du ciment acrylique dentaire sur la surface du crâne, en couvrant le bord de la glissière. Placez un mince anneau en acier inoxydable (1,5 mm de diamètre extérieur, 1 mm de diamètre intérieur) autour de la craniotomie et laissez sécher le ciment dentaire. Optionnellement, ajouter un peu de colle sur la bordure pour fixer l’anneau sur le dessus de la tête.REMARQUE : Ce système de fixation de tête est optimal pour l’imagerie sur un microscope inversé : de petits aimants incorporés dans la boîte d’imagerie facilitent la fixation de la fenêtre d’imagerie crânienne (CIW). Dans les expériences montrées dans ce protocole, un microscope inversé a été employé. Pour les microscopes droits, la fixation peut être réalisée au moyen d’une barre ou d’un anneau avec des rainures qui peuvent être fixées au microscope à l’aide de vis ou d’une plaque qui s’adapte à l’anneau. Pour la gestion de la douleur, injecter une dose unique de 100 g/kg de buprénorphine sous-cutané et permettre à l’animal de récupérer sur un coussin chauffant. Placez la souris dans une cage individuelle avec du papier déchiqueté pour l’enrichissement. Surveillez de près la souris tous les jours pendant les premiers jours et 2 fois par semaine, par la suite, pour le comportement normal, la réactivité et l’apparence. 2. Imagerie intravitale REMARQUE : L’intervalle de temps entre l’injection de cellules de tumeur et la première session de formation image intravital dépend du type de ligne de cellules de tumeur employée. Pour les expériences montrées dans ce protocole, 1x 105 cellules GL261 ont été injectées et imaged 10 jours plus tard. Préparation à l’imagerie Sédatez la souris à l’aide d’une anesthésie par inhalation d’isoflurane à l’aide d’un masque facial (mélange de 1,5 % à 2 % d’isoflurane/O 2). Injecter la souris sous-cutanée avec 100 l de tampon salin pour prévenir la déshydratation.REMARQUE : Pour l’imagerie à long terme, la souris peut être hydratée par une pompe à infusion sous-cutanée. Placez la souris face cachée dans une boîte d’imagerie. Utilisez une plaque métallique avec un trou de 1 mm de diamètre et de petits aimants intégrés autour de l’ouverture pour fournir la fixation du CIW à la boîte d’imagerie. Introduire l’isoflurane à travers un masque facial et ventiler par une prise de l’autre côté de la boîte (0,8% à 1,5% isoflurane/O2 mélange). Optionnellement, utilisez du ruban adhésif pour fixer le corps de la souris.REMARQUE : Le dextran étiqueté fluorescent pour la visualisation des vaisseaux sanguins ou d’autres colorants peut être injecté par voie intraveineuse à ce stade. En option, utilisez un oxymètre d’impulsion et une sonde chauffante pour surveiller les signes vitaux de la souris.REMARQUE : Dans cette expérience, il n’était pas nécessaire d’utiliser un oxymètre d’impulsion et une sonde chauffante puisque la souris était stable tout au long de la période d’imagerie (2 à 3 h). Cependant, pour des temps d’imagerie plus longs, une surveillance plus approfondie peut être nécessaire. Placez l’objectif d’eau 25x (p. ex. HCX IRAPO NA0.95 WD 2,5 mm) à la position zla plus basse et ajoutez une grande goutte d’eau.REMARQUE : L’utilisation d’un micro distributeur d’immersion en eau est fortement conseillée pour les expériences à long terme puisqu’elle permet aux scientifiques d’ajouter de l’eau pendant l’expérience. Alternativement, un objectif sec peut être utilisé. Transférer la boîte d’imagerie sur le microscope équipé d’une chambre climat sombre maintenue à 37 oC. Apportez l’objectif à la glissière ciW jusqu’à ce que la goutte d’eau le touche. En utilisant le mode épifluorescence, observez la tumeur à travers l’oculaire et mettre les cellules au point. Acquisition d’images time-lapse Sélectionnez plusieurs positions d’intérêt pour l’image, et enregistrez leurs coordonnées dans le logiciel. Assurez-vous que les positions sélectionnées sont des positions représentatives de différents sites de la tumeur (chaque tumeur peut être différente, mais pour assurer la cohérence, sélectionnez la même quantité de positions qui sont centrales au noyau de tumeur et aux bords à travers toutes les souris).REMARQUE : Un balayage de tuile d’une partie de la tumeur ou de la tumeur visible entière peut être exécuté ; cependant, si la tumeur est grande, cette méthode augmentera le time-lapse entre les images. En outre, si les cellules tumorales se déplacent rapidement, il peut être difficile de suivre les mêmes cellules au fil du temps. Passez en mode multiphoton et accordez le laser à la longueur d’onde correcte. Notez que, pour éviter les photodamages, des longueurs d’onde plus élevées sont souhaitées.REMARQUE : Pour l’imagerie Dendra2, une longueur d’onde de 960 nm a été utilisée. Avec l’objectif utilisé dans ces expériences, un zoom de 1.3 était suffisant pour obtenir une bonne résolution des noyaux de tumeur et de scanner une zone représentative de la tumeur. Passez au mode live et définissez une z-pile pour chaque position afin d’acquérir le volume maximal de cellules tumorales sans compromettre la résolution des cellules tumorales. Définissez la taille de l’étape entre les images comme étant de 3 m. Utilisez le mode bidirectionnel pour augmenter la vitesse de numérisation. La résolution de l’image doit être d’au moins 512 x 512 pixels. Acquérir des images du volume tumoral à différentes positions toutes les 20 min pendant 2 h. Ajouter de l’eau à l’objectif avant chaque acquisition d’image.REMARQUE : Les images en accéléré peuvent être automatiquement acquises en définissant le bon time-lapse dans le logiciel. Cependant, la souris peut se déplacer, et la position ou z-stack peut se déplacer au fil du temps, causant la perte de données. Par conséquent, il est recommandé d’effectuer le time-lapse manuellement et de vérifier et ajuster pour les changements xyz entre les acquisitions. À cette étape, en option, photo-switch le marqueur fluorescent Dendra2.REMARQUE: Contrairement à l’imagerie time-lapse (qui permet d’étudier les propriétés des cellules tumorales individuelles et comment ils changent au fil du temps), cela permettra d’étudier la zone de l’infiltration des cellules tumorales dans le cerveau sur plusieurs jours4. Une explication détaillée de cette étape est décrite par Gligorijevic et coll.13. Une fois la dernière image acquise, retirez la souris de la scène et laissez-la récupérer sur un coussin chauffant. Pour prévenir la déshydratation, 100 l de saline peuvent être administrés sous-cutané. Placez la souris dans sa cage jusqu’à ce que la blessure ressemblant à une biopsie soit effectuée. 3. Blessures de type biopsie et remplacement de CIW Créez une lésion ressemblant à une biopsie au site tumoral 1 jour après la première séance d’imagerie.REMARQUE : Alternativement, une autre procédure, comme l’enlèvement partiel de tumeur, peut être exécutée. Sédatez la souris à l’aide de l’anesthésie par inhalation d’isoflurane telle que décrite précédemment à l’étape 2.1.1.REMARQUE : Bien que l’anesthésie injectable puisse être utilisée, cette procédure est plus courte que l’implantation de CIW, et l’anesthésie par inhalation permet de contrôler avec précision et de réduire le temps que la souris reste sous sédatif. Placez la souris sur un cadre stéréotaxique et fixez sa tête avec deux barres d’oreilles et une pince à nez. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réflexes de pédale. Utilisez un masque d’anesthésie pour la chirurgie stéréotaxique pour garder la souris sous sédatif pendant la procédure. Tremper un coton-tige dans de l’acétone et l’étaler sur le bord de la couverture pour adoucir la colle qui tient la couverture contre le cerveau. Glissez les forceps à points minces sous la glissière de couverture pour le soulever. Si le bordereau se brise à ce point, utilisez les forceps pour enlever les morceaux de verre. Appliquer un tampon cortex pour garder le cerveau humide. Trempez une aiguille de 25 G dans la tumeur à une profondeur de 1 mm. Retirez l’aiguille et arrêtez le saignement, si nécessaire, en appliquant une éponge stérile à la gélatine.REMARQUE: Cette étape peut être effectuée sous un stéréomicroscope fluorescent pour identifier plus précisément la zone tumorale (si la tumeur est trop petite). De plus, une solution de 1 l de perles fluorescentes en polystyrène de 1 m peut être injectée pendant la ponction afin d’identifier la zone biopsiée. Scellez la surface du cerveau avec de l’huile de silicone et collez un bordereau de 6 mm sur le dessus. 4. Imagerie répétée Un jour après avoir infligé la biopsie-comme la blessure (et les jours consécutifs si nécessaire), répéter la formation image intravitale comme décrit dans l’étape 2 ci-dessus pour évaluer comment le comportement de cellules de tumeur change au fil du temps. Sélectionnez plusieurs positions de la tumeur qui seraient représentatives de la zone entière de tumeur.REMARQUE : Si des perles fluorescentes ont été employées pour identifier la zone biopsied, les localiser pour imager le comportement de cellules de tumeur dans les régions psipées comparées aux régions non-biopsied. 5. Analyse d’image Si les images en time-lapse ont été acquises manuellement, combinez-les en un seul dossier. Ouvrez le fichier LIF en time-lapse dans le logiciel commercial associé au microscope (p. ex., LasX ou LAS AF). Sélectionnez le processus d’onglet ‘gt; Outils de processus ‘gt; Fusionner. Sélectionnez la première image de la séquence temporelle et cliquez sur First. Sélectionnez la deuxième image de la séquence temporelle et cliquez sur Second. Dans Merge Dimensions, sélectionnez t pour le temps. Cliquez sur Appliquer. Un nouveau fichier avec deux points de temps sera généré. Répétez ce processus pour tous les points de temps, en utilisant le fichier nouvellement généré comme la première image de la séquence. Corriger les z-stacks acquis pour n’importe quel décalage xyz. REMARQUE : Pour les expériences décrites dans ce protocole, un logiciel Visual Basic conçu sur mesure a été utilisé pour la correction. Alternativement, d’autres logiciels disponibles peuvent être utilisés, tels que ImageJ ou Imaris. Exportez les fichiers TIFF à partir du logiciel en cliquant à droite sur le fichier en accéléré fusionné. Sélectionnez Enregistrer des données RAW. Les fichiers exportés seront exportés vers un dossier nommé en fonction du canal, du temps et de la position z. Ouvrez les fichiers TIFF dans le logiciel Visual Basic conçu sur mesure. Définissez le nombre de points de temps, de z-stacks et de canaux. Attribuez une couleur à chaque canal par l’ordre d’apparence. Dans le panneau Form Show, pour chaque point de temps, corrigez le décalage dans le z en cliquant sur les boutons up (U) ou Down (D). Dans le panneau de construction d’images Intravital, sélectionnez le canal à utiliser pour corriger le décalage xy. Sélectionnez le canal vert à corriger, en fonction du signal des cellules tumorales. Cliquez sur Automatique pour la correction xy. Exporter les images corrigées comme une projection maximale de trois z-stacks consécutifs. Dans le panneau Sélection, introduire les numéros de la première (Begin) et la dernière (Fin) z-tranches à exporter. Sélectionnez Max. Sélectionnez dossiers séparés pour Z. Cliquez sur Ne. Pour chacun d’eux, trois z-stacks, images en time-lapse seront exportés vers un dossier séparé. Optionnellement, correct pour la déformation élastique de tissu.REMARQUE : Pour les expériences de déformation élastique des tissus, un logiciel de compensation de mouvement d’allumette a été employé pour corriger la déformation rigide et élastique de tissu14. Suivez les cellules individuelles dans le z-stack complet dans le film time-lapse.REMARQUE : Les cellules tumorales peuvent être suivies manuellement à l’aide, par exemple, d’un plugin ImageJ (MTrackJ). Bien que précis, cela se limite au plan xy et prend beaucoup de temps. Alternativement, les cellules tumorales peuvent être suivies automatiquement tout au long du z-volume complet, en utilisant la segmentation des cellules tumorales (par exemple, le logiciel Imaris). Cependant, dans les tumeurs très denses, le suivi automatisé est moins précis et peut donner lieu à plus d’erreurs de suivi. Ouvrez et suivez chaque série time-lapse (pour trois z-stacks consécutifs) séparément. Faites glisser le dossier contenant les images time-lapse sur ImageJ. Sélectionnez l’onglet Plugins ‘gt; Suivi ‘gt; MtrackJ. Suivez chaque cellule en sélectionnant Ajouter et en cliquant sur chaque cellule à chaque point de temps. Extraire la mesure des pistes en cliquant sur Mesurer et enregistrer le fichier.