JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Pesquisa do Câncer

В Vitro опухолевых клеток Rechallenge для прогнозирования оценки химерных антигена рецепторов Т-клеток противоопухолевые функции

Published: February 27, 2019
doi:
10.3791/59275
, , , , ,
1Department of Hematology & Hematopoietic Cell Transplantation, T Cell Therapeutics Research Laboratory,City of Hope Beckman Research Institute and Medical Center, 2Irell and Manella Graduate School of Biological Sciences,City of Hope Beckman Research Institute and Medical Center

Summary

Здесь мы описываем метод в пробирке совместно культуры рекурсивный вызов опухоли целевой T-клеткам, который позволяет для анализа Фенотипические и функциональной деятельности противоопухолевых Т-клеток.

Abstract

Поле химерных антигена рецепторов (автомобиль) Т-клеточной терапии быстро развивающейся с улучшениями в дизайн автомобиля, генно инженерного подходов и оптимизации производства. Одна из проблем для этих усилий в области развития, однако, стало создание в пробирке анализов, которые энергично может информировать выбор оптимального автомобилей T клеток продуктов в естественных условиях терапевтического успеха. Стандарт в пробирке Распад опухоли анализов часто не отражают истинный противоопухолевой потенциал автомобиля Т-клеток из-за относительно короткий Сопредседатель культуры время и высокой Т-клеток опухоли соотношение. Здесь мы описываем метод в пробирке совместно культуры для оценки автомобиля T клетки рекурсивных убийство потенциал при нагрузках высокой опухолевых клеток. Пробирного, долгосрочный цитотоксическую функцию и пролиферативной способности автомобиля Т-клеток рассматривается в vitro свыше 7 дней с целями дополнительные опухоли, ведении совместного культуры каждый день. Этот assay может сочетаться с профилирования активация Т-клеток, истощения и памяти фенотипов. С помощью этого анализа, мы выделили успешно функциональные и фенотипические различия между CD4+ и CD8+ автомобилей T клетки против глиобластома (GBM) клетки, отражающие их дифференциальной в естественных условиях противоопухолевая активность в ортотопическая Гранулы ксенотрансплантата модели. Этот метод обеспечивает снисходительный подход для оценки автомобиля T клетки потенции и прояснить функциональные варианты различных продуктов клеток T автомобилей.

Introduction

Иммунотерапия с использованием химерных антигена рецепторов (CAR)-инженерии клетки T видел многообещающие результаты против B клетки злокачественных опухолей1,2,3,4, а потенциал ориентация других опухолей продолжает оставаться под тщательное расследование5,6,7. Для оптимизации конструкции автомобиля, производственного процесса и пациента схемы предварительной инфузии6,,78был достигнут большой прогресс, и Роман синтетической биологии подходы, как ожидается, увеличение их стойкость, безопасность и опухоли специфика9,-правовая10. Однако это было сложной и трудоемкой надлежащим образом оценить терапевтический потенциал автомобилей Т-клеток для того, чтобы руководство лучший выбор для клинических перевода. Наиболее создана модель до настоящего времени оценить функцию клеток T автомобиль находится в иммунодефицитных мышей, принимая человека опухоли ксенотрасплантатов, whereby автомобиль Т-клетки рассматриваются противоопухолевая эффективность и сравнении титруемая клеток доз11,12 , 13 , 14 , 15. Эти исследования в естественных условиях мышиных трудоемкой и отнимать много времени, особенно при отборе большого количества параметров. Кроме того, в естественных условиях исследования может сдерживаться доступность мыши штаммов, Уход за животными и методов обработки животных. Таким образом существует необходимость в разработке более удобным в пробирке анализы, позволяющие быстро отсчетов эффекторных деятельности, которые также добросовестно отражать в естественных условиях противоопухолевые функции этих клеток T.

Обычные методы определения цитотоксичность T клеток in vitro были сосредоточены на обнаружение дегрануляции, производство цитокинов и способность Лизируйте клетки-мишени-меченых радиоизотопов (то есть, анализы выпуска хрома). Хотя эти анализы являются информативными для определения специфики клеток T автомобилей и перенаправленные целевой признание, они часто не отражают в естественных условиях противоопухолевой потенциал инженерных T клетки12,13,16. В некоторых случаях в пробирке убийство активности в краткосрочной перспективе анализы показали Обратная корреляция с в естественных условиях противоопухолевые функции16. Такая непоследовательность скорее всего является результатом высокой эффекторных: целевой (E:T) коэффициенты, используемые в этих анализов в пробирке и поэтому неспособность дифференцировать продукцию клеток T автомобилей, которые подвержены истощению17. Напротив во время ликвидации в естественных условиях опухоли Т клетки обычно отвечают против большой опухоли бремя, потребовав несколько раундов в убийстве и впоследствии вождения Т клеточной дифференциации и истощения18,19, 20, который является одним из основных барьеров против эффективного опухоли распродажа автомобилей т-клеток12,13. Между тем большинство краткосрочных в пробирке убийство анализов также сделать не индикация различия в пролиферации Т-клеток, в то время как в автомобиль T клеток лечение больных потенциала для расширения клеток T автомобиль сильно коррелирует с клинических ответов4. Таким образом соответствующие в пробирке необходимо будет повторить условия высокой опухоли бремени, индукции истощения Т-клеток и позволяет для считывания расширения Т-клеток.

Здесь мы описываем стратегию для оценки автомобиля Т-клетки для повторяющихся опухоли убийства потенциал, с простой в пробирке совместно культуры assay. Параметры деятельности эффекторных различные Т-клеток могут одновременно рассмотрены, включая целевой ячейки убийства, расширения клеток T автомобилей и памяти или истощения, связанных фенотипов. Результаты, полученные от этот assay хорошо коррелируют с в естественных условиях противоопухолевый эффект автомобилей Т-клеток и может быть использована для оценки потенции автомобилей T клеточных продуктов. В то время как мы описываем assay для оценки IL13Ra2-ориентированных автомобилей Т-клетки против основной линии GBM21, он может быть легко адаптирована к любой платформе клеток T автомобиля.

Protocol

Наши IRB не требует рассмотрения настоящего Протокола. Мы получаем отбрасываются свежие глиобластома опухоли образцы от города надежды патологии Департамента, которые кодируются, и наша лаборатория не может получить доступ к ключу. Мы получаем образцы с данными только на предыдущее лечение и болезни состояние во время биопсии/резекции, без идентифицирующих данных. 1. средства массовой информации подготовка Подготовить СМИ нервных стволовых клеток для культивирования первичной GBM клеточных линий: DMEM:F12, 1:50 B27, 5 мкг/мл гепарина и 2 ммоль/Л Л-глютамин; дополнены 20 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF) и фактор роста фибробластов основных 20 нг/мл (ФБП) два раза в неделю (см. Таблицу материалы). Подготовка клетки T СМИ: 15 X-VIVO, содержащие 10% плода телячьей сыворотки (FCS); дополнены 70 МЕ/мл rhIL-2 и 0,5 нг/мл rhIL-15 каждые 48 ч (см. Таблицу материалы). Подготовка совместного культуры СМИ: Возьмите нервных стволовых клеток СМИ без EGF и ФБП дополнения, и добавить 10% FCS. Подготовить СУИМ, окрашивание раствора (FSS): HBSS, 2% FCS, НАН3 (0,5 г/500 мл). 2. Подготовка GBM опухолевых клеток Урожай низкий проход GBM опухоли сферах (TSs) центрифугированием при 300 x g 4 мин и удалить супернатант.Примечание: GBM опухоли сферах (TSs) генерируются из резецируется опухоли, как описано ранее22,23,24и поддерживается в СМИ нервных стволовых клеток, в инкубаторы с 5% CO2 при 37 ° C. Предварительно теплой Сопредседатель Культура СМИ в ванну воды 37 ° C. Добавьте 1 mL холодной accutase GBM ТВУ, отделить ТВУ, закупорить за 30-60 сек и остановить диссоциации, добавив 5 мл теплой Сопредседатель культуры средств массовой информации.Примечание: GBM ТВУ не должны храниться на accutase для более чем 5 мин. Урожай GBM клетки центрифугированием при 300 x g 4 мин, удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 2 мл Сопредседатель культуры средств массовой информации. Определение концентрации клеток с помощью счетчика жизнеспособность клеток.Примечание: Жизнеспособность клеток должно быть > 70%. 3. Подготовка автомобилей Т-клеток Менее чем за 24 часа до assay, взять 100 мкл культивировали автомобилей Т-клеток в трубку цитометрия потоков и добавить 2 мл ФСБ.Примечание: АВТОМОБИЛЕЙ Т-клетки были созданы, как описано ранее,11,21 и культивировали в СМИ Т-клеток. Центрифугирование в 300 x g 4 мин и удалить супернатант. 2 мл FSS для мытья клетки, центрифуги на 300 x g 4 мин, добавить и удалить супернатант. Пятно клетки с соответствующие антитела, чтобы указать выражение автомобиля на 4 ° C на 30 мин.Примечание: Например, если IL13Rα2-целевой машине описанные ранее25 используется, затем пятна с анти IL13 антител. Мыть дважды с 2 мл ФСБ и анализировать автомобилей exn с помощью проточный цитометр. Определите автомобиль % на Т-клетки, используя стробирования стратегию, показанный на рисунке 1B. В день культуры сотрудничества урожай всех автомобилей Т-клетки центрифугированием при 300 x g 4 мин, удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 2 мл Сопредседатель культуры средств массовой информации. Определение концентрации клеток с помощью счетчика жизнеспособность клеток.Примечание: Жизнеспособность клеток должно быть > 70%. 4. Настройка опухоли — Сопредседатель культуры клеток T Разбавьте опухолевых клеток к концентрации 0,16 млн/мл с совместного культуры средств массовой информации. Основываясь на автомобиль %, разбавляют автомобилей Т-клетки к концентрации 0.04 миллиона автомобилей+ клеток/мл с совместного культуры средств массовой информации.Примечание: Например если автомобиль составляет 50% и 0,4 млн/мл концентрация Т-клеток, затем сделайте разбавления 1:5 получить окончательный концентрация 0.04 миллиона автомобилей+ клеток/мл. Пипетка 100 мкл разбавленного опухолевых клеток в каждой скважине плиты культуры ткани 96-луночных с плоским дном. Пипетка 100 мкл разбавленного автомобилей Т-клеток в каждой скважине, содержащий опухолевых клеток и смесь хорошо.Примечание: Каждый совместно культуры клеток опухоли T будет анализироваться в 4 точках времени. 4-6 реплицирует могут потребоваться на каждый раз, когда точка на основе анализа различных, но < 3 реплицирует на момент времени не рекомендуется; приведена Таблица 1 представитель platemap. Поддерживать пластины в 37 ° C, 5% CO2 инкубатора. 5. опухолевые клетки Rechallenge Примечание: Rechallenge проходит на 2, 4 и 6 дней поста первоначального совместного культуры установки (рис. 1А). Урожай и разъединять GBM ТВУ, как описано выше (шаги 2.1-2.6). Ресуспензируйте GBM клетки в концентрации 0,64 млн/мл. Определить совместно культуры скважин, которые нуждаются в rechallenge (см. таблицу 1) и тщательно удалить 50 мкл СМИ из верхней части каждой скважины. Добавьте 50 мкл суспензии клеток GBM в каждой скважине и хорошо перемешать, а затем вставьте пластину в 37 ° C, 5% CO2 инкубатора. 6. сбор образцов и анализ гранулярных потока Примечание: Образцы будут собраны на 1, 3, 5 и 7 дней поста, установки первоначального совместного культуры, с 1, 2, 3 и 4 раундов опухоли вызов, соответственно. Предварительно теплой 0,05% раствор трипсина ЭДТА в капилляре 37 ° C. Определите скважин, которые требуют сбора и передачи средств массовой информации в новый раунд-96-луночных днище. Пипетка 50 мкл трипсина ЭДТА в скважины переваривать оставшиеся опухолевые клетки при 37 ° C за 5 мин. Под микроскопом убедитесь, что клетки отсоединяется от дна. Пипетка вокруг хорошо нижней Ресуспензируйте отдельные клетки, а затем передавать трипсина ЭДТА, содержащих отдельные ячейки соответствующего скважин 96-луночных раунд-днище. Центрифуге тура-96-луночных днище на 300 x g, 4 ° C на 4 мин, затем удалить супернатант. Добавить 200 мкл/колодец FSS для мытья клетки, центрифуги на 300 x g, 4 ° C на 4 мин, а затем удалить супернатант. Ресуспензируйте клетки в 100 мкл/хорошо FSS содержащие антител (см. Таблицу материалы), и пятно клетки на 4 ° C на 30 мин. Добавить 100 мкл/хорошо FSS в клетки, центрифуги на 300 x g, 4 ° C на 4 мин, затем удалить супернатант. Добавить 200 мкл/колодец FSS для мытья клетки, центрифуги на 300 x g, 4 ° C на 4 мин, а затем удалить супернатант. Ресуспензируйте клетки с 100-200 мкл/хорошо FSS с 500 нг/мл DAPI, а затем анализировать образцы проточной цитометрии. 7. функциональные и Phen Otypic анализ автомобилей Т-клеток Извлечь файлы данных из потока цитометр и ворота всех живых (DAPI-) клеток (рис. 1C). Количественного определения опухолевых клеток, стробирование CD45– населения и автомобилей Т-клетки, стробирование CD45+, авто + населения (рис. 1C).Примечание: Если клетки тумора Экспресс CD45 (например Раджи лимфоидные клетки), анти CD3 пятнать может использоваться для различения Т-клетки от опухолевых клеток. Участок опухолевых клеток и автомобилей T мобильный номер через время курс. Определите активация Т-клеток, Сопредседатель выражением 4-1BB и CD69.Примечание: Эти поверхностных маркеров могут использоваться для анализа T активации 6-24 h пост первоначального совместного культуры клеток. Выявление истощения Т-клеток с выражением PD-1, ЛАГ-3 и Тим-3. Определите состояние Т-клеток памяти, выражением CD45RO и CD62L.

Representative Results

Используя assay, описанных выше, мы выделили дифференциального эффекторных потенции и убийство динамика при посредничестве CD4+ и CD8+ автомобилей T клетки. Результаты, представленные здесь иллюстрируют разницу между CD4+ и CD8+ автомобилей T клетки, созданный из здоровых доноров, независимо от нашей предыдущей публикации21. Через стандартный дегрануляции пробирного, мы смогли наблюдать, что оба CD4+ и CD8+ T автомобиль стал столь же активация клеток против GBM клетки, которые выражают целевых антигена, как указано выражением CD107a и внутриклеточных цитокинов (Рисунок 2). Однако, используя assay вызов повторяющихся опухоли, мы обнаружили, что CD4+ но не CD8+ автомобилей T клетки выставлены возможности убийства нескольких патронов (рис. 2B). CD4+ автомобилей T клетки также достигнутые лучше расширения по сравнению с CD8 + клеток во время этот assay (рис. 2C). Разница расширения между подмножествами клеток T автомобиль только наблюдались от D3 после двух раундов опухоли вызов (1:12 E:T), в то время как разница цитотоксичность было отмечено начало на D5 после трех раундов опухоли вызов (1:20 E:T), показывая, что краткосрочные анализы не для выяснения различий в потенции различных автомобилей T клеточных продуктов. Когда 1:1 смешанная CD4+ и CD8+ автомобилей T клетки были применены к этот assay, они были найдены, чтобы превзойти CD8+ но не CD4+ автомобилей T клетки на долгосрочный цитотоксичности (рис. 2B). Расширение CD8+ автомобилей T клетки было вызвано совместно прикладной CD4 клеток+ , пока CD4+ расширения клеток T автомобиль был препятствуют присутствии CD8+ клеток (рис. 2C). Чтобы объяснить механизм, который отличает эффекторных активности между CD4+ и CD8+ автомобилей T-клеток, мы сначала подтвердить что 24 ч после первоначального совместного культуры, оба CD4+ и CD8+ автомобилей T клетки были сравнительно активированные (Рисунок 3 A). Тем временем, как указано выражением CD45RO и CD62L, оба CD4+ и CD8+ автомобилей T клетки показали переход от центральной памяти (CD45RO+, CD62L+) для эффекторных памяти (CD45RO+, CD62L–) фенотип во время вызова повторяющихся опухоли (рис. 3B). Тогда мы были характерны клетки на D3 этот assay, время до подмножества ячеек автомобиль T начала для отображения функциональных различий. Т-клеток истощения был отмечен Сопредседатель выражение рецепторов ингибирующих PD-1, ЛАГ-3 и Тим-315,21, который показал что CD8+ автомобилей T были более склонны к истощению, по сравнению с уровнем CD4 клеток+ автомобилей T-клеток () Рисунок 3 C). Кроме того, никакой разницы был замечен на CD8+ автомобилей T клетки исчерпания в наличие/отсутствие совместного прикладного CD4+ клеток (рис. 3C), показывающее, что CD4-индуцированной CD8+ автомобилей T клетки расширение не является связанные с лучше эффекторные функции. Вместе, результаты этого анализа определены что CD4+ автомобилей T-клеток превысил CD8+ клеток специально в долгосрочной цитотоксичности. Несмотря на аналогичные краткосрочные цитотоксичности (1-3 дня, однажды Перевызов), CD4 клеток+ автомобилей T устойчивый эффекторные функции при повторяющихся опухоли вызов, хотя CD8+ клетки стали исчерпаны и не контролировать рост опухолевых клеток. Когда два подмножества были неоднозначными, CD4+ автомобилей T клетки способствовало расширение CD8 клетки+ автомобилей T, но истощения статус CD8+ клетки не были устранены, что приводит к отсутствию синергического эффекта между двумя группами. Аналогичное различие между CD4+ и CD8+ автомобилей T клетки был замечен в в естественных условиях модели как описано выше21. Действительно, CD8+ автомобилей T клетки смогли выступить посредником краткосрочных опухоли Распродажа но следуют с антиген положительных повторения; в отличие от CD4+ автомобилей T клеток лечение привело к долгосрочной опухоли искоренение21, который напоминает их потенциал повторяющихся убийства, используя assay в пробирке rechallenge. Рисунок 1 : Схемы и анализа стратегии повторяющихся вызов пробирного. (A) схемы и Хронология пробирного вызов повторяющихся опухоли. Для каждой скважины автомобиль Т-клетки были впервые совместно культивируемых клеток GBM PBT030-2 (4000 автомобилей + клеток, 16000 опухолевых клеток) и вновь оспорено с 32000 опухолевых клеток каждый день (D2, D4 и D6). Анализ опухолевых клеток и автомобилей T мобильный номер, а также фенотипа клетки T автомобилей осуществляется на D1, D3, D5 и D7. (B) стробирование стратегии для определения % автомобилей в T клетки до создания совместного культуры. (C) стробирование стратегия живых клеток, клеток опухоли и автомобилей Т-клетки из повторяющихся вызов assay. (D) опухолевых клеток номер в разные времена rechallenge assay, совместно культивируемых с untransduced Т-клеток. Планки погрешностей = ±SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2 : Повторяющиеся задачи, пробирного показывает различия в убийстве и пролиферативной потенции CD4+ и CD8+ автомобилей T клетки. (A) дегрануляция и внутриклеточных цитокинов окрашивание CD4+ и CD8+ автомобилей T клетки после 5 h культуры совместно с GBM клеток (E:T = 1:1). (B) CD4+, CD8+ или смешанного (CD4:CD8 = 1:1) автомобилей Т-клетки были применены к повторяющиеся задачи пробирного и жизнеспособной опухолевые клетки были количественно. p < 0,05, **p < 0.01, ***p < 0,001 по сравнению с уровнем CD4+, используя односторонний дисперсионный анализ с Бонферрони множественные сравнения тестов. CD4 (C)+ и CD8+ автомобилей T клеток расширения во время повторяющихся опухоли вызов пробирного. Сравнение (слева направо) CD4+ против CD8+, одно подмножество; CD4+ против CD8+, в группе «смешанные»; CD4+, один против смешанные; CD8+, один против смешанной. p < 0,05, **p < 0.01, ***p < 0,001 с помощью теста t качестве непарный студента. Планки погрешностей = ±SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3 : Анализ фенотипа Т-клеток во время повторяющихся вызов пробирного. (A) 4-1BB и CD69 окрашивания на автомобиль Т-клетки на D1 assay. (B) CD45RO и CD62L окрашивание автомобилей Т-клеток перед применением rechallenge проба (вход) и D3 и D7 assay. (C) совместно выражение PD-1, ЛАГ-3 и Тим-3 на автомобиль Т-клеток в D3 assay. (Вверху) Строб стратегии выявления Т-клеток, выражая 1, 2 или 3 тормозящий рецепторов. (Внизу) Сравнение: CD4+ клетки (одно подмножество), CD8+ клетки (одно подмножество), CD8+ клетки (в группе «смешанные»). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Таблица 1: Представитель пластины карта rechallenge установки.

Discussion

Этот assay вызов повторяющихся опухолевых клеток обеспечивает удобный подход к оценке автомобилей T клетки функционального потенции, с помощью экстракорпорального установки, которая повторяет высокий опухоли бремя, связанное с моделями в естественных условиях опухоли. В течение этот 7-дневный assay, автомобиль T клетки проходят четыре раунда вызов опухоли (первоначального совместного культуры и 3 x rechallenge), создание среды, где исчерпаны Т-клетки могут потерять свои возможности реагирования на вызов опухоли несмотря на мощный первоначальный ответ. Ликвидации клеток опухоли и расширения клеток T автомобилей представляют собой два основных показаний, которые могут быть приобретены из этого анализа, в то время как фенотипов автомобилей Т-клеток могут легко анализироваться путем пятнать поверхности или внутриклеточных маркеров, которые указывают активация Т-клеток, истощения и/или памяти. Этот assay также удобно совместить с беспристрастного анализа автомобилей T клетки транскриптом, протеома или фосфора протеома21,26и полифункциональность Т-клеток, который был принят для прогнозирования клинической реакции27. Кроме того для их адаптивной реакции против Т-клеточного иммунитета как секрецию цитокинов28также могут быть тестированны опухолевых клеток. Поскольку образцы собирают в нескольких точках времени, этот assay позволяет не только статические, но и динамический анализ поведения клеток T автомобиля при реагировании на избыточное количество опухолевых клеток.

Assay особенно эффективна в сравнении эффекторных потенции автомобилей Т-клеток, ориентации же антигеном, но с различным дизайном и/или производственных процессов. Мы использовали этот assay для идентификации что CD4+ автомобилей T клетки смогли выступить посредником Улучшенный долгосрочные эффекторные функции чем CD8+ клетки21. Было также показано, что в естественных условиях эффективность автомобиля коррелировалось с цитотоксичность в позднее время точках (D5-D7) во время этот assay, далее подчеркивая необходимость использования повторяющихся опухоли вызов в пробирке оценки клеток T автомобилей. Хотя GBM клетки были использованы в качестве примера здесь клеток-мишеней, этот assay может быть легко принят сочетанием различных опухолевых клеток T. В частности поведение клеток T автомобилей также может изменяться различными антигена плотности и инженерных раковые клетки выразить различные уровни целевых антигены, инструмент для изучения последовательных молекулярных событий на автомобиль признание29. Таким образом этот assay также может быть использована для изучения активации шаблон некоторых автомобилей Т-клеток против различных целей.

Поскольку целевой жизнеспособность клеток и расширение клеток T автомобилей являются два первоначальных показаний этот assay, важно, что все совместно культуры начинаются с жизнеспособным (> 70%) опухоли и Т-клетки. При выполнении rechallenge процессов, действий аспирационных СМИ (шаг 5.3) не должны мешать опухоли и Т-клетки в нижней части скважины, чтобы не допускать ненужных вариации графов клеток. При выполнении этот assay на подвеска целевой клеточных линий, рекомендуется собрать оставшиеся клетки центрифугированием перед rechallenge опухолевых клеток.

Ограничение этот assay состоит, что параметры настройки (E:T соотношения первоначального совместного культуры и rechallenge) необходимо скорректировать основе различных комбинаций автомобилей опухоль. Например, если опухолевых клеток выразить значительный уровень иммуно тормозящий молекул (например, PD-L1), более высокий коэффициент E:T рекомендуется ввиду того, что общая убийство эффективность ухудшается по сравнению с PD-L1-низкий опухолевых клеток. Перед применением assay новых автомобилей опухоль комбинаций, экспериментальное исследование рекомендуется определить оптимальные условия, которые, как правило, позволяет наиболее мощных автомобилей Т-клеток, протестированы в assay для устранения > 80% опухолевых клеток в конечной точке. Поскольку прямой ячеек контакт необходим для автомобилей T клеточный убийство, если опухолевые клетки были флуоресцировани обозначенного, то Группа анализа потока гранулярных должна корректироваться соответственно (например если опухолевые клетки были помечены GFP, затем любой FITC-конъюгированных антител не должны использоваться).

Клинической активность клеток T автомобилей против злокачественных клеток B привело к два утвержденных FDA лекарства. Однако ответ показал существенные вариации в разных пациентов27,30,31, который осветил коррелируют с фенотипических свойств продукции автомобиля30. Этот assay вызов в пробирке повторяющихся опухоли далее обеспечивает подход к функционально тест автомобиль эффекторных потенции помимо фенотипические характеристики и полифункциональность цитокиновой продукции и обеспечивает более высокую пропускную способность скрининг Клинические продуктов по сравнению с модели в естественных условиях опухоли при сохранении точности прогнозирования. В целом этот assay может использоваться для функционального тестирования Т-клеток для автомобилей Т клеток дизайна, доклинических и клинических развития.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантов от Калифорнийского института регенеративной медицины (CIRM) Грант TR3-05641 и низ грантов Р30 CA33572 (ядер). D.W. поддерживается NCI стипендий 1F99CA234923-01.

Materials

0.05% Trypsin/0.53mM EDTA in HBSS w/o Calcium and Magnesium Corning MT25051CI
1M Hepes Irvine Scientific 9319
200 mM L-Glutamine Cambrex Bio Science 17-605E
4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) – FluoroPure grade Invitrogen D21490
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
Aldesleukin Proleukin (rhIL-2) Novartis Oncology NDC 0078-0495-61
Anti-CD137, PE BD Biosciences 555956 4B4-1
Anti-CD19, PE-Cy7 BD Biosciences 557835 SJ25C1
Anti-CD3, PERCP BD Biosciences 340663 SK7
Anti-CD4, FITC BD Biosciences 340133 SK3
Anti-CD45, PERCP BD Biosciences 340665 2D1
Anti-CD45RO, PE BD Biosciences 561137 UCHL1
Anti-CD62L, APC BD Biosciences 559772 DREG-56
Anti-CD69, APC BD Biosciences 340560 L78
Anti-CD8, APC-Cy7 BD Biosciences 348793 SK1
Anti-IL-13, PE BD Biosciences 340508 JES10-5A2
Anti-LAG-3, PE eBiosciences 12-2239-41 3DS223H
Anti-PD-1, APC-Cy7 BioLegend 329921 EH12.2H7
Anti-TIM-3, APC eBiosciences 17-3109-42 F38-2E2
B-27 Serum-Free Supplement (50X) Invitrogen 17504-044
Corning 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile (Product #3596) Corning Life Sciences 3596
Defined fetal bovine serum,HI IR Hyclone Labs SH30070.03IH
DMEM F-12 50:50 (1X) w/o Glutamine MediaTech, Inc. 15-090-CV
DMEM High Gluc w/o L-Glu, Na Pyr 1 L Invitrogen 11960051
DMEM-Ham's F12 50:50 Mixture with L-glutamine and 15 mM HEPES Fisher Scientific MT10092CV
HBSS Irvine Scientific 9224
Heat-Inactivated FCS Hyclone SH30070.03
Heparin Sodium(1,000 U/ml) American Pharmaceutical 401811B
MACSQuant Milteni Biotech Inc. BIS013220 
PBS 1X W/CA & MG Irvine Scientific 9236
PBS with 1MM EDTA (No Ca2+ or Mg2+) VWR Scientific Products PB15009A
Recombinant human EGF R&D Systems 236-EG-200
Recombinant human FGF R&D Systems 233-FB
rhIL-15 Working Dilution (10 ng/µL) CellGenix, US Operations tF0297
Sodium Azide (NaN3) Sigma S8032
Sorvall ST40R Thermo Scientific 41693700
TC-HEPES BUFFER (1M) SOLN 100ML  IRVINE SCIENTIFIC CORP 6472
Tecnol Procedure Mask Kimberly-Clark 47117
X-VIVO 15 Lonza BW04-744Q
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).
  2. Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), (2013).
  3. Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
  4. Lee, D. W., et al. T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial. The Lancet. 385 (9967), 517-528 (2015).
  5. Yong, C. S. M., et al. CAR T-cell therapy of solid tumors. Immunology and Cell Biology. 95 (4), 356-363 (2017).
  6. Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric antigen receptor therapy for cancer. Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).
  7. Priceman, S. J., Forman, S. J., Brown, C. E. Smart CARs engineered for cancer immunotherapy. Current Opinion in Oncology. 27 (6), 466-474 (2015).
  8. Fesnak, A. D., June, C. H., Levine, B. L. Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 566-581 (2016).
  9. Esensten, J. H., Bluestone, J. A., Lim, W. A. Engineering Therapeutic T Cells: From Synthetic Biology to Clinical Trials. Annual Review of Pathology. 12, 305-330 (2017).
  10. Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
  11. Brown, C. E., et al. Optimization of IL13Ralpha2-Targeted Chimeric Antigen Receptor T Cells for Improved Anti-tumor Efficacy against Glioblastoma. Molecular Therapy. , (2017).
  12. Long, A. H., et al. 4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors. Nature Medicine. 21 (6), 581-590 (2015).
  13. Cherkassky, L., et al. Human CAR T cells with cell-intrinsic PD-1 checkpoint blockade resist tumor-mediated inhibition. The Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 3130-3144 (2016).
  14. Priceman, S. J., et al. Co-stimulatory signaling determines tumor antigen sensitivity and persistence of CAR T cells targeting PSCA+ metastatic prostate cancer. Oncoimmunology. 7 (2), 1380764 (2018).
  15. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).
  16. Gattinoni, L., et al. Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells. The Journal of Clinical Investigation. 115 (6), 1616-1626 (2005).
  17. Malandro, N., et al. Clonal Abundance of Tumor-Specific CD4(+) T Cells Potentiates Efficacy and Alters Susceptibility to Exhaustion. Immunity. 44 (1), 179-193 (2016).
  18. Gattinoni, L., et al. Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells. Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).
  19. Klebanoff, C. A., et al. Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).
  20. Gattinoni, L., Klebanoff, C. A., Restifo, N. P. Paths to stemness: building the ultimate antitumour T cell. Nature Reviews Cancer. 12 (10), 671-684 (2012).
  21. Wang, D., et al. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), (2018).
  22. Kahlon, K. S., et al. Specific recognition and killing of glioblastoma multiforme by interleukin 13-zetakine redirected cytolytic T cells. Pesquisa do Câncer. 64 (24), 9160-9166 (2004).
  23. Brown, C. E., et al. Recognition and killing of brain tumor stem-like initiating cells by CD8+ cytolytic T cells. Pesquisa do Câncer. 69 (23), 8886-8893 (2009).
  24. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  25. Brown, C. E., et al. Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy. The New England Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).
  26. Salter, A. I., et al. Phosphoproteomic analysis of chimeric antigen receptor signaling reveals kinetic and quantitative differences that affect cell function. Science Signaling. 11 (544), (2018).
  27. Rossi, J., et al. Preinfusion polyfunctional anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with clinical outcomes in NHL. Blood. 132 (8), 804-814 (2018).
  28. Garcia-Diaz, A., et al. Interferon Receptor Signaling Pathways Regulating PD-L1 and PD-L2 Expression. Cell Reports. 19 (6), 1189-1201 (2017).
  29. Walker, A. J., et al. Tumor Antigen and Receptor Densities Regulate Efficacy of a Chimeric Antigen Receptor Targeting Anaplastic Lymphoma Kinase. Molecular Therapy. 25 (9), 2189-2201 (2017).
  30. Fraietta, J. A., et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).
  31. Fraietta, J. A., et al. Disruption of TET2 promotes the therapeutic efficacy of CD19-targeted T cells. Nature. 558 (7709), 307-312 (2018).

Tags

In VitroTumor CellRechallengeChimeric Antigen ReceptorCAR T CellsAnti-tumor FunctionGlioblastomaTumorspheresCo-cultureHigh Throughput ScreeningCell DissociationCell SuspensionCell CultureSupernatantTrypsin EDTA

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Wang, D., Starr, R., Alizadeh, D., Yang, X., Forman, S. J., Brown, C. E. In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function. J. Vis. Exp. (144), e59275, doi:10.3791/59275 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image