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Biologia

경작 된 인간 세포 블루 네이티브 Polyacrylamide 젤 전기 이동 법 및 Immunoblotting 사용 하 여에서 미토 콘 드리 아 호흡 사슬 단지의 분석

Published: February 12, 2019
doi:
10.3791/59269
1Research Programs Unit, Molecular Neurology,University of Helsinki

Summary

이 프로토콜에서는 블루 네이티브 polyacrylamide 젤 전기 이동 법에 의해 미토 콘 드리 아 호흡 사슬 복합물의 분석을 보여 줍니다. 여기 경작된 한 인간 세포에 적용 하는 방법을 설명 합니다.

Abstract

미토 콘 드리 아 호흡 미토 콘 드리 아에서 산화 인 산화 (OXPHOS) 단지에 의해 수행 됩니다. 내부 및 환경 요인 어셈블리 및 OXPHOS 단지의 안정성을 교란 수 있습니다. 이 프로토콜 응용 프로그램을 경작된 한 인간 세포에 블루 네이티브 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (BN-페이지)에 의해 미토 콘 드리 아 호흡 사슬 복합물의 분석을 설명합니다. 첫째, 미토 콘 드리 아 digitonin를 사용 하 여 셀에서 추출한 다음 라우릴 maltoside를 사용 하 여, 그대로 OXPHOS 단지 미토 콘 드리 아 막 으로부터 격리 됩니다. OXPHOS 단지 다음 부정 청구 염료 Coomassie 파란, 단백질 집단을 방지 하 고 음극 쪽으로 단백질 복합물의 전기 이동 기동성을 보장 앞 그라데이션 젤 전기 이동 법에 의해 해결 됩니다. 마지막으로, OXPHOS 단지 표준 immunoblotting에 의해 검색 됩니다. 따라서, BN 페이지 평가 기본 SDS 페이지 수만 개별 OXPHOS 복잡 한 subunits의 연구와 달리 전체 OXPHOS 복합물의 어셈블리를 사용할 수 있는 편리 하 고 저렴 한 기술 이다.

Introduction

미토 콘 드리 아 에너지 생산, 세포 물질 대사, 신호, apoptosis, 노화, 등1,2,3의 규칙에에서 중요 한 역할을 재생 하는 다기능 세포입니다. 미토 콘 드리 아에서 에너지 생산 호흡 ATP 합성 커플 산화 인 산화 기능에 의존 합니다. 인간 세포에 있는 미토 콘 드 리아 산화 인 산화 시스템 (OXPHOS) 5 단지의 구성 됩니다. 단지 I-IV 복잡 한 V ATP를 생산 하는 데 사용 되는 미토 콘 드 리아 intermembrane 공간에서 전기 양성자 기온 변화도를 만듭니다. 복잡 한 각 OXPHOS multimeric 이며, 복잡 한 II, 제외 하 고 핵과 미토 콘 드리 아 유전자에 의해 subunits의 구성. 어떤 결함 돌연변이 또는 환경 스트레스에 기인 하는 OXPHOS 복합물의 핵심 구성 요소에는 어셈블리 및 산화 인 산화 시스템의 기능 교란 수 있습니다. 또한, 기능 OXPHOS 복합물의 적절 한 어셈블리는 어셈블리 요소4,,56의 많은 필요합니다.

블루 기본 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (BN-페이지) 그대로 단백질 복합물의 분석을 사용 하는 기본적인 기술 이며 OXPHOS 복합물의 어셈블리를 공부 하는 데 사용할 수 있습니다. 첫째, 미토 콘 드리 아는 격리 된 세포에서 digitonin에 의해 세포의 원형질 막 permeabilizes 온화한 세제. 그런 다음, 라우릴 maltoside를 사용 하 여 OXPHOS 단지 미토 콘 드리 아 막에서 해제 됩니다. 그라데이션 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 OXPHOS 단지 그들의 질량에 따라 분리 된다. Coomassie 파란 G-250 (하지 R-250) 샘플 버퍼와 블루 음극 버퍼에 추가 세제 정한 연결을 분리 하지만 개별 호흡 사슬의 단지 그대로8을 유지. 전기 이동 법, 동안 블루 음극 버퍼 염료를 포함 하는 염료, PVDF 막8OXPHOS 단지의 효율적인 전송을 보장 없이 음극 버퍼도 대체 됩니다. OXPHOS 단지 시각화, PVDF 막 5 OXPHOS 단지의 선택 된 하위 단위에 해당 하는 항 체와 incubated 순차적으로.

여기에 설명 된 몇 가지 수정 하는 방법은 어떤 교양된 셀에 적용할 수 있습니다. 또한, 조직 샘플9에서 고립 된 미토 콘 드리 아에서 OXPHOS 복합물의 분석을 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다. BN-페이지 실행 당 각 샘플에 대 한 미토 콘 드리 아의 적어도 5-10 µ g을 필요합니다. 여기 설명 하는 방법을 사용 하 여, 500000 교양 HEK293, SH-SY5Y와 같은 셀 또는 143B 세포는 미토 콘 드리 아의 약 10 µ g을 얻을 수 있습니다. 그러나, 충분 한 양의 비 엔 분석에 대 한 셀 특정 셀 형식에 따라 달라 집니다.

미토 콘 드리 아 OXPHOS 단백질을 공부 하는 가장 일반적인 방법은 SDS 페이지 이며 서 부 럽. 그러나, SDS 페이지만 개별 OXPHOS 소 단위를 공부 하 고 있으며, BN-페이지, 달리 평가 전체 OXPHOS 복합물의 어셈블리를 사용할 수 없습니다. 분명 기본 페이지 분리 부정 청구 염료의 존재 없이 기본 조건에서 단백질 복합물 그리고 억 페이지에 비해 훨씬 낮은 해상도. 그러나, 분명 기본 페이지 이므로 10 억 페이지 보다 온화한 조건10억 페이지 아래 해리 OXPHOS supercomplexes 같은 단백질 복합물의 정한 supramolecular 어셈블리를 유지할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 그라데이션 젤 복합물; 분리 하는 그러나, 또는, 비 그라데이션 분리 사용할 수 있습니다 경우 상대적으로 비싼 그라데이션 메이커 사용할 수11.

중요 여기에 설명 된 메서드는 단지의 기능 평가 하지 OXPHOS 복합물의 어셈블리를 분석할 수 있습니다. 고해상도 BN 페이지 젤에 활동 분석 결과11 미토 콘 드 리아 단지12 의 spectrophotometric 효소 활동 분석 결과 의해 다음 OXPHOS 단지의 기능 분석에 대 한 효율적인 기술이 있습니다. 그러나, 이러한 두 가지이 방법 OXPHOS 복합물의 어셈블리를 시험 하지 않습니다.

따라서, BN 페이지 개별 OXPHOS 복합물의 어셈블리를 조사 하는 최적의 방법입니다. 예를 들어 Leber 유전 눈 신경 병 (LHON), 유산 증 및 뇌졸중 같은 에피소드 (MELAS), 미토 콘 드리 아 뇌 등 일부 미토 콘 드 리아 장애, 하나 이상의 구성 요소는 OXPHOS의 변경 된 어셈블리와 관련 된 시스템5. 를 사용 하 여 설명 하는 BN 페이지 방법을 여기 미토 콘 드 리아 질병의 분자 메커니즘을 공부 될 수 있다.

Protocol

spaNOTE:이 프로토콜은 기반 관련된 간행물 Hilander 외.13 . 1입니다. 버퍼 솔루션의 준비 참고: 모든 버퍼 및 프로토콜에 사용 되는 솔루션 표 1에 요약 됩니다. 버퍼의 지정 된 볼륨 준비 하 고 10 샘플을 실행 하기에 충분 한 있습니다. 모든 버퍼 + 4 ° C에서 최대 1 년 동안 저장할 수 있습니다. 젤 버퍼 1.5 M aminocaproic 산, 150mm 두번째-트리 증류수 (dH2O)에 포함 된 x 3의 20 mL를 준비 합니다. 7.0에 pH를 조정 합니다. DH2오 2 M aminocaproic 산의 10 mL를 준비 다음 결합 하 여 미토 콘 드 리아 버퍼의 1 mL를 준비: 0.5 mL 젤 버퍼, 2 M aminocaproic 산의 0.5 mL 및 500 mM EDTA의 4 µ L x 3의. 두번째-트리 스와 50 m m tricine dH2O. 조절 pH 7.0의 15 m m를 포함 하는 음극 버퍼의 1000 mL를 준비 합니다. 0.04 g Coomassie 파란 G-250의 음극 버퍼의 200 mL를 추가 하 여 파란색 음극 버퍼의 200ml를 준비 합니다. 50mm 두번째-트리 스 dH2O. 조절 pH 7.0에 포함 된 양극 버퍼의 1000 mL를 준비 합니다. 750 mM aminocaproic 산 및 5 %Coomassie 파란 포함 하는 샘플 버퍼의 2.5 mL 준비 dH2O. G-250 2입니다. 미토 콘 드리 아 lysates의 준비 플레이트 셀 컬렉션 전날. HEK293 또는 143B 셀 사용 Dulbecco의 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1 %L-글루타민, 100 mg/mL 페니실린 및 100 mg/mL 스가 글의 중간 (DMEM) 수정. +37 ° c 5% CO2 습도 분위기에서 셀 문화 인큐베이터에서 세포 성장. 컬렉션의 날에 각 샘플에 대 한 적어도 500000 셀 인지 확인 합니다. 부드럽게 한번 얼음 처럼 차가운 PBS로 세포 세척. 접시에서 세포를 분리 하지 마십시오. 세포를 긁어와 800 x g + 4 ° c.에서 10 분 동안에 작은 얼음 처럼 차가운 PBS로 두 번 셀 펠 릿을 세척 하 고 단계 2.2에서 원심. 브래드 퍼 드 방법 상업 키트를 사용 하 여 단백질 농도 측정 합니다. 800 x g + 4 ° c.에서 10 분 동안에 세포를 작은참고: 셀 컬렉션 후 + 4 ° C에서 모든 단계를 수행 하 고 소용돌이 하지 마십시오. PBS의 20 mL를 100 x protease 억제제의 200 µ L을 추가 하 여 20 mL PBS의 protease 억제제와 함께 준비 합니다. 얼음에 계속. 5 mg/mL의 최종 단백질 농도에 protease 억제제와 함께 PBS에 셀 resuspend 5 mg/mL에서 세포를 resuspend 하는 데 필요한 효소 억제제와 PBS의 볼륨을 계산 하려면 각 샘플의 단백질 양을 계산 합니다. 이 계산에 대 한 단백질 농도 측정 단계 2.3 단계 2.3에서에서 세척 후 셀을 resuspend 하는 데 사용 하는 PBS의 볼륨에서 사용 합니다. 효소 억제제와 PBS에서 3.3 m m digitonin의 1 mL를 준비 합니다. 1.65 m m의 최종 농도를 3.3 m m digitonin를 추가 합니다. 잘 혼합 하 고 5 분 동안 얼음에 품 어. Protease 억제제와 PBS에서 3.3 m m digitonin의 1 mL를 준비 될 때까지 아무 침전 볼 수 하 고 시원한 얼음에 즉시 100 ° C에서 PBS의 1 mL에 digitonin의 4 mg를 분해. Digitonin 솔루션의 1 mL를 100 x protease 억제제의 10 µ L를 추가 합니다.참고: digitonin의 신선한 솔루션만을 사용 합니다.주의: Digitonin은 독성! 사용 하 여 얼굴 마스크, 장갑 및 실험실 외 투. 1.5 mL의 최종 볼륨을 가수분해 억제 물 (준비 단계 2.4에서에서)와 PBS를 추가 합니다. 10000 x g에서 원심 분리기에서 10 분 동안 + 4 ° c. 제거는 상쾌한. 이 단계에서 미토 콘 드리 아는 일지도. 미토 콘 드 리아 버퍼에 미토 콘 드리 아 펠 릿을 resuspend. 미토 콘 드 리아 버퍼의 볼륨 단계 2.4에서에서 PBS의 볼륨의 절반 이다. 신선한 10% 라우릴 maltoside 프로 테아 제 억제 물 (준비 단계 2.4에서에서)를 포함 하는 PBS에 준비 합니다. 1 mL 10 샘플에 대 한 충분 하다입니다. 1%의 최종 농도를 10% 라우릴 maltoside를 추가 합니다. (이 단계는 몇 시간까지 긴 될 수 있습니다) 15 분 동안 얼음에 품 어. 20000 x g 에서 원심 분리기에서 20 분 + 4 ° c. 새로운 관으로는 상쾌한을 수집 합니다. 키트를 사용 하 여 Bradford 메서드에서 단백질 농도 측정 합니다. 샘플 버퍼, 라우릴 maltoside 단계 2.8에서에서 사용의 볼륨의 볼륨을 추가 합니다. 샘플-80 ° C에서 최대 6 개월까지 저장할 수 있습니다. 3. 그라데이션 젤 BN-페이지에 대 한 준비 실 온에서 10 억-페이지에 대 한 그라데이션 젤 하 거 라. 그라데이션 메이커를 저 어 접시에 놓고 유연한 튜브 연동 펌프를 연결 합니다. 주입 튜브에 바늘 세트를 연결 합니다. 그라데이션 메이커의 인접 챔버로 자력 장소. 10 분 최대 펌프 속도에서 dH2O와 튜브를 세척. 빈 관과 그라데이션 메이커. 피펫으로 사용 하 여 그라데이션 메이커의 챔버 사이 채널에 남은 dH2O를 제거. 채널 및 튜브 밸브를 닫습니다. 캐스팅 프레임 및 클램프를 사용 하에 하단에 있는 구멍은, 홀더 2 개의 유리 접시를 조립 하 고 스탠드에 배치. 그것이 물 균형 직선 표면에 더 많거나 적은 다는 것을 확인 하십시오. 장소 바늘 유리 접시 사이 배관에 연결. 6%와 15% 젤 솔루션 (표 2)를 준비 합니다. 얼음에 계속. 암모늄 persulphate (AP) 및 tetramethylenediamine (TEMED) (그들은 시작 중 합) 추가 마지막. 부드럽게 공기를 만드는 방지 하려면 믹스 거품. 6% 젤 그라데이션 젤 믹서 튜브 챔버의 근 위 끝과 15% 젤 선단부를 로드 합니다. 총 볼륨 젤의 유리 접시 사이 분리 젤의 볼륨을 동일 해야 합니다. 따라서, 2.6 mL 6% 젤의 그리고 15% 젤 그라데이션 젤 믹서의 2.1 mL를 사용 하 여 하나의 8.3 cm x 7.3 c m 크기의 젤. 자력에 스위치와 튜브와 그라데이션 메이커의 챔버 사이 채널을 엽니다. 연동 펌프에 5 mL/분으로 즉시 전환 유리 접시를 거품 젤 입력을 허용 하지 않습니다. 때 아무 젤 튜브에 바늘을 제거 합니다. 부드럽게 dH2오 유지 중 합에 대 한 1 시간 이상 실 온에서 젤 젤 오버레이. 젤을 붓는 후 즉시 씻어 튜브 dH2O 그라데이션 챔버를 작성 하 고 최대 속도로 연동 펌프를 사용 하 여. 2 더 많은 젤을 준비할 때 항상 깨끗 한 시스템 사이. 젤 버퍼 x 3의 3 mL를 혼합 하 여 1 x 젤 버퍼를 준비 하 고 필터 종이 젤의 표면에서 부드럽게 dH2O. 제거 dH2O 6 mL를 추가 합니다. 젤 젤 버퍼 x 1의 표면 세척. 부드럽게 필터 종이 젤 버퍼 x 1을 제거 합니다. 젤에 필터 종이에서 섬유를 하지 마십시오. 이 보장 하기 위해,가 위, 종이 작은 조각으로 잘라 하지만 종이 찢 어 하지 마십시오. 유리 접시 사이 빗을 배치 하지만 그것을 완벽 하 게 부 어 빗에서 겹쳐 쌓이는 젤 수 담그지 마십시오. 겹쳐 쌓이는 젤 (표 2) 4%를 준비 합니다. APS와 TEMED 추가 그들은 쉽게 중 합을 시작으로 최근. 부드럽게 피하 공기 방울 혼합. 오버레이 겹쳐 쌓이는 젤, 빗, 아래 거품을 방지 하 고 빗을 완전히 몰입할. 하자 겹쳐 쌓이는 젤 유해 적어도 30 분 빗을 제거 하 고 세척 젤 버퍼를 피펫으로 사용 하 여 x 1와 우물. 중 합, 후 며칠에 대 한 젤 + 4 ° C에서 저장 수 있습니다. DH2O와 플라스틱 젖은 종이에 젤 포장 저장 젤, 젤의 건조를 방지 하기 위하여 필름. 4. 블루 기본 젤 전기 이동 법 참고: OXPHOS의 저하를 방지 하기 위해 단지 실행 법 + 4 ° c.에 미리 냉장된 버퍼를 사용 합니다. 우물의 바닥까지 블루 음극 버퍼와 젤 카세트를 로드 합니다. 샘플의 로딩 때 카세트 상단에 가득 하지 쉽습니다. 블루 음극 버퍼와 우물을 세척 하 고 피펫으로 사용 하 여 블루 음극 버퍼를 채울 우물. 웰 스에 샘플 (5-30 µ g 단백질)를 로드 합니다. 부드럽게 블루 음극 버퍼와 양극 버퍼 탱크 상단에 젤 카세트를 작성. 40 V의 정 전압에서 15 분 동안 젤을 실행 합니다. 다음 80 V 전압을 증가 (또는 6의 정 전류를 사용 하 여 mA), 10을 초과 하지 않는 엄마. 염료의 젤 길이 2/3에 도달할 때까지 젤을 실행 합니다. 음극 버퍼와 블루 음극 버퍼를 교체 하 고 전기 이동 법 염료 전면 밖으로 실행 하고있다 때까지 계속. 총, 전기 이동 법 약 3 시간 걸립니다. 유리 접시를 검색 하 고 세미 드라이 blotting에 의해 polyvinylidene 불 소 (PVDF) 막에 단백질을 전송. 25 V와 전류 1.0 A 30 분 제한의 정 전압을 사용 합니다. 또는 사용 하 여 젖은 blotting PVDF 막에 OXPHOS 단지 전송. 계속 표준 immunoblotting 프로토콜에 따라 멤브레인과 항 체 외피의 차단 합니다. OXPHOS 복합물의 소 단위에 대 한 1 차 항 체를 순차적으로 사용 합니다.참고: 예를 들어 복잡 한에 대 한 안티-NDUFA9 항 체 (1: 2000)를 사용 나, 복잡 한 II, 복잡 한 III, 안티 COX1 복잡 한 IV 및 안티-ATP5A 항 체 (1: 2000) 복잡 한 v에 대 한 항 체 (1: 2000)에 대 한 안티-UQCRC2 항 체 (1:1000)에 대 한 안티-SDHA 항 체 (1: 2000). 항 체의 목록 자료의 테이블에에서 표시 됩니다.

Representative Results

BN-페이지를 사용 하 여, 미토 콘 드리 아 OXPHOS 복합물의 어셈블리에 결함 조사 수 있습니다. 그림 1A 인간의 신경 세포 (SH-SY5Y) 페니, 특히 번역 mtDNA 인코딩된 OXPHOS subunits의 억제와 치료에 호흡기 체인 단지의 어셈블리를 보여 줍니다. 페니 고갈 mitochondrially 인코딩 하위 단위를 포함 하는 OXPHOS 복합물 (복잡 한 전, 3 세, 4; 그림 1A), 복잡 한 2 차 핵 유전자에 의해 인코딩된 독점적으로 upregulated compensatorily 동안. 단지 V immunoblotted 여기 아니었다. 여러 freeze-thaw 주기 OXPHOS 단지 파괴. 그림 1B freeze-thaw 주기에 의해 OXPHOS 단지의 저하를 보여 줍니다. 여러 freeze-thaw 주기 받은 샘플 3에서에서 미토 콘 드리 아 호흡 단지 낮은 밴드 강도 있고 한 번만 냉동 같은 샘플에 비해 이동 된다. 그림 1B 의 자르지 서쪽 오 점 이미지 보 그림 1에 표시 됩니다. 젤의 품질이 선명 하 고 뚜렷하게 밴드에 대 한 중요 합니다. 그림 1 C 에서 잘 유해 하지 않은 젤 immunoblot을 보여줍니다. 막의 스트립 또한 OXPHOS 복합물의 감지를 발생할 수 있습니다. 그림 1 D, 복잡 한 내가 검색 되었습니다 스트립 전후. 신호 대 잡음 비 스트립 후 훨씬 낮습니다. 그림 1. 성공적이 고 최적의 실험에서 BN 페이지 immunoblots. (A) 미토 콘 드 리아 번역의 억제제에 의해 고갈의 OXPHOS 단지. 인간의 신경 세포 (SH-SY5Y)는 48 시간 동안 페니 (CAP)으로 치료 했다. Ctrl 키, 페니 치료 없이 제어 셀입니다. 하단 패널은 immunoblot의 정량화를 보여줍니다. 컨트롤의 값은 1 (점선으로 표시 된)가지고 간다. 데이터는 ± SD, 의미 하는 대로 표시 됩니다 n = 3, * P 제어를 사용 하 여 비교 < 0.0001 짝이 없는 학생의 t 시험. (B) 여러 동결-해 동 하 여 OXPHOS 복합물의 주기. 샘플 1-3은 동일한 조건에서 인간의 다리 셀 (143B)에서 준비 되었다. 샘플 숫자 1과 2는 동결 되었고 샘플 번호 3 수술 4 freeze-thaw 주기 동안 한 번만 녹아. (C) OXPHOS 단지 HEK293 세포에서 고립의 BN 페이지 immunoblots. 밴드의 번짐 젤의 낮은 품질에 의해 발생 합니다. (D) OXPHOS 복합물의 검출에 스트립의 효과. 복잡 한의 인간의 신경 세포 (SH-SY5Y) 같은 막의 제거 전후에서 나. OXPHOS 단지 안티-NDUFA9 항 체를 사용 하 여 검색 된 (복잡 한 나), 안티-SDHA 항 체 (복잡 한 II), 안티-UQCRC2 항 체 (복합물 III)와 안티 COX1 항 체 (복잡 한 IV). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 버퍼 또는 솔루션 구성 레시피 젤 버퍼 x 3 1.5 M aminocaproic 산 aminocaproic 산의 3.94 g 150 mM 두번째-트리 스 두번째-트라이앵글 0.63 g dH2O DH2O 20 mL을 추가 pH 7.0 7.0에 pH를 조정 음극 버퍼 15mm 두번째-트리 스 3.14 g 비스-트리 스의 50 m m tricine tricine의 8.96 g dH2O DH2O 1000 mL에 추가 pH 7.0 7.0에 pH를 조정 블루 음극 버퍼 0.02 %coomassie 파란 G 0.04 g Serva 블루 G의 15mm 두번째-트리 스 음극 버퍼의 200 mL 50 m m tricine dH2O pH 7.0 양극 버퍼 50mm 두번째-트리 스 20.93 g dH2O DH2O 2000 mL을 추가 pH 7.0 7.0에 pH를 조정 미토 콘 드 리아 버퍼 1.75 M aminocaproic 산 3 배 젤 버퍼의 0.5 mL 75mm 두번째-트리 스 2 M aminocaproic 산의 0.5 mL 2 mM EDTA 500 mM EDTA의 4 µ L dH2O – pH 7.0 – 샘플 버퍼 750 mM aminocaproic 산 2 M aminocaproic 산의 0.94 mL 5 %comassie 블루 G 블루 Serva G의 0.125 g dH2O DH2O 2.5 mL을 추가 2 M aminocaproic 산 2 M aminocaproic 산 aminocaproic 산의 2.62 g dH2O DH2O 10 mL을 추가 표 1입니다. 버퍼 및 BN-페이지에 사용 하는 솔루션 블루 기본 젤 6% 젤을 분리 15% 젤을 분리 누적 4% 젤 젤 버퍼 x 3 3.3 mL 3.3 mL 1.64 mL 40% 아크릴/두번째 37.5:1 1.5 mL 3.75 mL 0.5 mL dH2O 5.14 mL 0.93 mL 2.77 mL 글리세롤 0 2 mL 0 10% 염화 persulfate * 60 Μ L 10 Μ L 60 Μ L TEMED 4 Μ L 2 Μ L 6 Μ L 총 볼륨 10 mL 10 mL 5 mL * DH2O에서에서 항상 신선한 10% 염화 persulfate 확인 표 2입니다. BN 페이지 젤의 조리법입니다. 보충 그림 1. 자르지 서쪽 오 점 이미지의 그림 1B. 이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

샘플 준비, 저장 하는 동안 그대로 OXPHOS 단지를 보존 하 여 젤 전기 이동 법 프로토콜의 가장 중요 한 부분 중 하나입니다. 따라서, 미토 콘 드리 아 + 4 ° C에서 격리 되어야 합니다 및 샘플 하지 freeze-thaw 주기를 받아야 한다. OXPHOS 단지만 전체 절차 동안 한 동결-해 동 주기를 용납 수 있습니다. 여러 freeze-thaw 주기 파괴 OXPHOS 복합물 (그림 1B). 컨트롤과 비교 하는 실험 샘플 저장 조건, 잘못 된 결과 줄 수 있는 차이 피하기 위해 동시에 준비 되어야 한다. 씻어 셀 알 약-80 ° C (이 프로토콜에서 1.4 단계)에서 동결 하 고 나중에 수행 모든 샘플에 대 한 프로토콜의 나머지 함께 적어도 젤 elec까지 하는 것이 좋습니다 모든 예제와 함께 병렬로 프로토콜의 모든 단계를 수행할 수 없는 경우 trophoresis입니다. (탱크, 카세트) 전기 기구의 청결에 특별 한 주의 지불 합니다. SDS 페이지 같은 장치를 사용 하는 경우 그것은 매우 잘 하기 전에 세척 BN 페이지. 모든 잔여 SDS 전기 이동 법 동안에 OXPHOS 복합물의 분리를 일으킬 수 있습니다.

고급 그라데이션 젤 프로토콜의 또 다른 중요 한 부분입니다. 블루 기본 페이지에 대 한 캐스트 젤은 상업적으로 사용할 수; 그러나, 이후 상업 젤 사용 하는 버퍼는 다른 샘플 버퍼는 구성 있을 그들을 사용을 권장 하지 않습니다. 여기에 사용 된 젤 (6-15%)의 그라데이션은 개별 OXPHOS 복합물의 분리에 적합 합니다. OXPHOS, 일컬어 호흡 체인 supercomplexes14의 더 높은 순서 supramolecular 구조를 검출 하기 위하여 일부 최적화 필요한11입니다.

OXPHOS의 시각화를 위한 단지 사용 하 여 특정 항 체 순차적으로, 그들의 속성에 따라. 예를 들어 사용 하 여 먼저 마지막 약한 신호 및 가장 강한 신호를 가진 항 체를 제공 하는 항 체. 이것은 탐지 (그림 1D) 약화는 스트립 때문에 중요 한입니다. 호흡 사슬 복합물의 구성 비 엔 페이지 후 젤에 2 차원 SDS 페이지15복종 되는 경우 조사 수 있습니다.

여기에 설명 된 프로토콜 순차적으로 개별 OXPHOS 단지에 대 한 항 체를 사용 하 여 제안 합니다. 그러나, 동시에 모든 5 개의 OXPHOS 단지 감지 하 칵테일 상용 OXPHOS 항 체를 사용할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 불완전 하 게 조립된 OXPHOS 복합물을 감지 하 여 자신의 정체성을 정의 수, 개별 OXPHOS 단지에 대 한 항 체 사용 해야 순차적으로. 이 단계는 시간이 오래 걸릴; 그러나, 그것은 새로운 실험 조건 및 모델 테스트를 위한 필수 수 있습니다.

미토 콘 드리 아 격리에 사용 되는 digitonin의 농도 특정 세포 유형에 대 한 최적화 되어야 합니다. 세제로 digitonin permeabilizes 세포 막. Digitonin의 최적 농도 효율적으로 그대로 미토 콘 드리 아 막 세포의 원형질 막 permeabilizes. 너무 높은 농도 미토 콘 드리 아 막 손상 총 미토 콘 드리 아 생산량 감소 하는 동안 digitonin의 너무 낮은 농도의 미토 콘 드 리아 추출 물 높은 오염을 발생 합니다. 최적의 digitonin/단백질 비율 (g/g) 1 0.3에서 다릅니다. 서쪽 오 점 분석 펠 릿과 supernatants에서 추출 하는 단백질의 digitonin16의 최적 농도 테스트를 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜에는 단백질; immunoblot에 컨트롤 로드 따라서, 추출 된 복합물의 단백질 농도 측정 되어야 한다 신중 하 게 적어도 동등한 로드 되도록 triplicates에. 또한, 샘플 복제에 BN 페이지에서 실행할 수 있습니다. 선택적인 OXPHOS 복합물의 어셈블리 장애인 경우 영향을 받지 않는 단지 컨트롤 로드 될 수 있습니다.

18억 페이지에 단백질 복합물의 분자 질량의 추정은 도전 이다. 현재 프로토콜에는 분자량 마커; 따라서, OXPHOS 단지의 어셈블리를 예상 하려면 영향을 받지 않는 단지를 포함 하는 컨트롤 샘플 항상 분석에 포함 되어야 합니다. BN-페이지에 대 한 컨트롤 샘플은 일반적으로 치료 또는 강포한 유형 세포.

여기에 제시 된 방법은 미토 콘 드리 아 호흡 사슬 복합물;의 검출에 대 한 최적화 그러나, 그것은 또한 미토 콘 드리 아 단백질19의 oligomerization의 평가 대 한 적용할 수 있습니다. 또한, OXPHOS 복합물의 어셈블리 속도 페니와 페니10제거 후 그들의 회복 다음 첫 없애고 인코딩된 미토 콘 드 리아 소 단위 포함 복합물에 의해 공부 될 수 있다. 따라서, BN 페이지 정상 수준 및 인간 미토 콘 드 리아 장애9,11의 분자 진단 등 다른 응용 프로그램에 대 한 OXPHOS의 어셈블리를 사용할 수 있습니다.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

헬싱키 대학 도서관에 게시 재정 지원에 대 한 감사입니다.

Materials

100 mm cell plates Thermo Fisher Scientific 130182
40% Acrylamide/Bis 37.5:1 Bio-Rad 161-0148
Aminocaproic acid Sigma A2504
Ammonium persulfate Sigma A3678
Anti-ATP5A Abcam 14748 Complex V subunit
Anti-MTCOI Abcam 14705 Complex VI subunit
Anti-NDUFA9 Abcam 14713 Complex I subunit
Anti-SDHA Abcam 14715 Complex II subunit
Anti-UQCRC2 Abcam 14745 Complex III subunit
Bis-tris Sigma B7535
Bradford protein assay kit BioRad 5000006
Cell scrapers Fisher 11597692
Coomassie blue G250 (Serva Blue G) Serva 35050
Digitonin Sigma D141
DMEM Lonza 12-614F/12
EDTA Life Technologies 15575-038
FBS Life Technologies 10270106
Fetal bovine serum Life Technologies 10270106
Glycerol (Sigma G5516
Gradient maker Bio-Rad 1654120
Lauryl maltoside (n-Dodecyl β-D-maltoside) Sigma D4641
L-glutamine Life Technologies 25030024
L-glutamine Gibco 25030
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma T9281
PBS Life Technologies BE17-516F
Penicillin/Streptomycin Lonza 17-602E
Penicillin/streptomycin Gibco 15140
Power supply GE Healthcare  EPS 301
Protease inhibitors Thermo Scientific 10137963
Trans-blot turbo mini PVDF BioRad 1704156
Tricine Sigma T9784
Trypsin-EDTA Gibco 15400054
Vertical electrophoresis apparatus BioRad 1658004
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Referências

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Konovalova, S. Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Complexes in Cultured Human Cells using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Immunoblotting. J. Vis. Exp. (144), e59269, doi:10.3791/59269 (2019).
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